UNIVERSITA DEGLI STUDI DI FIRENZE FACOLTA DI INGEGNERIA

Transcript

1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI FIRENZE FACOLTA DI INGEGNERIA CORSO DI LAUREA IN INGEGNERIA ELETTRONICA Progetto per l ottimizzazione della macchina a stati di gestione di un contaglobuli con campionatore automatico e sviluppo e implementazione delle procedure operative per il controllo dello strumento di Emiliano Venturi Relatori: Prof Prof Dott Dott Guido Valli Silvano Dubini Angelo Manzoni Igor Betti ANNO ACCADEMICO

2 Ai miei genitori e a Fabio Montobbio, mio compagno all Accademia Navale di Livorno i

3 Un sincero ringraziamento va all azienda che mi ha ospitato, SEAC Srl ovverosia la Divisione Elettronica del GRUPPO RADIM E stata un esperienza utilissima per me Un esperienza di lavoro che si aggiunge alle precedenti 4 fatte alle scuole Superiori e che va ad arricchire il mio curriculum: questo è quello che volevo dall inizio, questo è quello che ho ottenuto Ringrazio la Proprietà per la possibilità offertami Saluto le persone che ho conosciuto nel reparto R&D dell azienda, a partire dal Dott Angelo Manzoni che ne è il Direttore e continuando con tutti i tecnici che ivi lavorano Un grazie particolare va al Dott Igor Betti, il tecnico con cui ho avuto la fortuna di lavorare gomito a gomito nello svolgimento del lavoro di tesi: ai miei occhi si è mostrato un tecnico capacissimo, oltrechè un interlocutore squisito Grazie Igor ii

4 Indice - Cap - Argomento - Pagina INTRODUZIONE 1 1 Caratteristiche tecniche 11 L automazione nel laboratorio 12 Campionamento del liquido ematico 13 Risposta SEAC al campionamento automatico: HeCoSampler 14 Metodi di indagine ematologica 15 Conta e classificazione dei leucociti 151 Metodo impedenziometrico 152 Metodo ottico (scattering) 153 Sistemi integrati resistivo-ottici 16 La famiglia HeCo3POP: l Hardware 161 Soluzioni e reagenti 162 Principi operativi 163 Parametri di conta 17 La famiglia HeCo3POP: il Software 171 Menù Principale 172 Menù Analisi Protocollo di comunicazione 21 Flusso di informazioni a tre (HeCo PCGest Sampler) e i due livelli di comunicazione 22 Livello 2: comunicazione PCGest schede HeCo/Sampler 23 Ambiente di sviluppo multitasking e opportunità di suddividere i compiti fra moduli software caratterizzanti 231 Livello 1: struttura di ipcmsg e comunicazione fra moduli 24 Kernel della sequenza tipica di dialogo fra i moduli CM- DISP-DdS 25 Esempio di flusso informazioni completo in una procedura operativa doppia: caricamento del rack iii

5 3 Organizzazione software 31 Motore software di HeCoSampler: i venti moduli 311 Il modulo degli stati macchina: ControlloMacchina 32 Scelta strategica del puntatore ad uno stato 33 Distribuzione del set funzioni nei tre stati di partenza 34 Gli stati Occupati 35 Gestione lista di lavoro Soluzione realizzativa 41 Sequenza eventi nel capionamento automatico 42 Rappresentazione macchina a stati finale 43 Modalità di richiamo delle procedure operative firmware 44 Controllo di restart a fine ciclo operativo 45 Gestione interruzione prematura del campionamento automatico: casi accidentali e casi volontari 5 Conclusioni A B Profilo aziendale Software sviluppato BIBLIOGRAFIA iv

6 INTRODUZIONE Introduzione HeCoSampler è parente stretto di HeCo ed HeCoVET, due strumenti che SEAC ha già commercio a pieno regime Si distingue dai suoi predecessori per l aggiunta del modulo Campionatore Automatico (Sampler, usando l inglese come lingua di presentazione del proprio prodotto) Con il termine Sampler si intende il blocco hardware (costituito da parti meccaniche, elettriche, elettroniche) che permette il caricamento, posizionamento, prelievo, analisi e scarico di provette-campione di sangue: l intero ciclo deve avvenire in modo automatico Lo scopo del progetto è quello di realizzare un modulo software che consenta il perfetto sincronismo degli stadi del campionamento automatico appena accennati in precedenza Inoltre, dovranno essere riconosciute ed espanse al campionamento automatico le normali operazioni che lo strumento già aveva a bordo nel campionamento manuale Il modulo software da realizzare andrà ad aggiungersi agli altri moduli già implementati da SEAC in quello che sarà il software di gestione e controllo del sistema L ambiente di sviluppo è VisualC++70 DotNet sotto WindowsXP, lo stesso sistema operativo installato sul PC che comunica con HeCoSampler e che l utente ha di fronte a sé per pilotare lo strumento Il progetto deve rispettare le seguenti specifiche: il modulo non deve alterare la struttura del software del sistema; questo significa che le funzionalità già realizzate non devono risentire dell inserimento del modulo; 1

7 INTRODUZIONE il modulo deve essere progettato in maniera tale da utilizzare le stesse regole di comunicazione degli altri moduli; questa specifica deriva dall esistenza di una struttura di comunicazione, per meglio dire un protocollo di comunicazione, già implementato da SEAC attraverso il quale i moduli si inseriscono Gli strumenti elettronici per indagine ematologica rivestono un importanza straordinaria nella società di oggi ed hanno aiutato la medicina a fare un deciso passo avanti: il Capitolo 1 mostra con i numeri le ragioni che avvalorano questo comune pensare ed illustra le evoluzioni scientifiche avute nel settore In questo contesto viene offerta una panoramica dello strumento per ematologia di interesse, con riferimento sia all hardware che al software Il Capitolo 2 ha l obiettivo di far comprendere al lettore la struttura, intesa come semantica innanzitutto e dopodichè come sintassi, del protocollo di comunicazione che SEAC ha adottato per questa linea di strumenti Il Capitolo 3 segue logicamente il Capitolo 2 ed illustra come operare per poter inserire nuove procedure operative in una classe già esistente (Dispatcher, DialogoDiStato ad esempio) o in una classe creata ex-novo che rappresenta in sé un singolo anello della Macchina a Stati finale In questo Capitolo si fa riferimento anche alla gestione della lista di lavoro in modalità campionamento automatico Il Capitolo 4 mette insieme le conclusioni raggiunte al Capitolo 3 e descrive la Macchina a Stati finale che rappresenta la soluzione del lavoro Il Capitolo 5 si lascia andare a valutazioni di collaudo che mettono in luce quanto le difficoltà incontrate nell attenersi ad un protocollo di comunicazione rigido abbiano il pregio di trasformarsi in una soluzione robusta e affidabile per il nostro strumento 2

8 INTRODUZIONE Il lettore può trovare una sezione corposa, ma necessariamente non completa per motivi di segreto industriale, dei vari listati software sviluppati in questo lavoro nell Appendice B 3

9 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE Capitolo 1 Caratteristiche tecniche 11 L automazione nel laboratorio Negli ultimi anni abbiamo assistito ad una domanda continuamente crescente delle analisi di laboratorio, dovuto sia ad un incremento di richieste di esami immunologici che da un incremento di esami clinici ed ematologici Questo incremento sia qualitativo che quantitativo non potendo essere fronteggiato pensando di impiegare ulteriori risorse umane all interno dei laboratori di analisi, ha reso necessario uno sviluppo tecnologico basato su automazione ed informatizzazione con conseguente riduzione di costi e quindi vantaggio economico Analizziamo brevemente adesso il vantaggio economico derivante dal livello di automazione Possiamo riconoscere 3 livelli d automazione: Manuale Media automazione Elevata automazione (a) Fig 11 Livello automazione - costi 4

10 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE In fig 11 vediamo che più esami vengono effettuati dal laboratorio maggiore è la convenienza economica all impiego dell automazione Per avere un idea delle dimensioni operative di un laboratorio si consideri che: Laboratorio di piccole dimensioni esami/anno Laboratorio medie dimensioni esami/anno Laboratorio grosse dimensioni oltre esami/anno Si è resa necessaria, per forza di cose, una evoluzione tecnologica importante all interno dei laboratori analisi [1,2] Basti pensare che fino a metà anni 70 (nel 1975 fu introdotto dalla Technicon Instruments il primo analizzatore ematologico commerciale, l Hemalog D) il campione prelevato al paziente veniva osservato al microscopio, e l operatore ricavava da esso i dati Oggi sarebbe impossibile effettuare le analisi di laboratorio nella stessa maniera sia per quantità che per qualità Le analisi ematologiche sono effettuate da macchine automatiche che seguendo procedure preimpostate riescono ad esaminare ed elaborare i dati relativi al campione presentato, abbassando molto i tempi fra analisi e analisi [3,4,5] Con l avvento delle macchine automatiche nei laboratori di analisi oltre a tenere conto della precisione, accuratezza e capacità operativa si tiene conto anche della biosicurezza In particolare l attenzione deve essere posta: Nella limitazione della manipolazione dei campioni biologici Nella limitazione del rischio biologico per il personale di laboratorio Nel miglioramento del sistema di etichettatura 5

11 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE 12 Campionamento del liquido ematico Ad oggi l uso delle siringhe di vetro è stato ormai abbandonato Il prelievo viene effettuato con l uso di provette in plastica monouso (fig 12) al cui interno è stato applicato il vuoto cosìcche il liquido ematico viene aspirato direttamente nella provetta Questo sistema prevede l uso di un ago provvisto di valvola Una valvola (i) Fig 12 Provetta in plastica monouso che si apre, lasciando passare il sangue aspirato dalla provetta, e si chiude, smettendo così di aspirare, in modo opportuno Fondamentalmente, una volta inserita la provetta nella parte posteriore del supporto, il tappo di gomma viene forato dall appendice dell ago quando l operatore esercita una certa pressione Nel momento in cui il tappo della provetta viene forato dall appendice dell ago, la valvola applicata su quest ultimo si apre e fa defluire il liquido ematico La provetta aspira così la giusta quantità di liquido ematico necessario per le analisi da Fig 13 Sistema di prelievo svolgere sul campione Questo sistema di prelievo, illustrato in fig 13, risolve molti problemi in termini di sicurezza microbiologica ed è sempre più diffuso 6

12 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE Il sistema di prelievo del contaglobuli con campionatore automatico HeCoSampler sfrutta lo stesso principio, ma a parti invertite: stavolta le provette in plastica monouso risultano essere fisse e adagiate su un piattino (come illustrato in fig 14) che in azienda è Fig 14 Rack di HeCoSampler stato battezzato chiamato rack Il rack è appoggiato su un carrello meccanico azionato da un motore passo passo [24] che ne permette lo scorrimento orizzontale in modo da presentare la provetta con il campione da esaminare di fronte all ago di prelievo L ago di prelievo rappresenta invece la parte mobile del sistema Normalmente l ago di prelievo (vedi fig 15) è in posizione di riposo retratto all interno Non appena il carrello ha finito la sua corsa ed ha presentato la provetta da campionare di fronte all ago, quest ultimo fuoriesce e va a forare il tappo di gomma A questo punto, il liquido ematico defluisce verso il contaglobuli per l analisi Ciò che permette il deflusso non è esattamente una valvola standard come quella citata all inizio e presente negli aghi che si trovano in commercio, bensì una struttura apposita progettata e realizzata da SEAC chiamata camerina Elementi caratterizzanti della camerina sono due canali di flusso che l ago incontra durante il suo movimento 7

13 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE Se ci si pensa bene, i movimenti sono complementari rispetto ad un campionamento manuale dove si può immaginare l ago come fisso e la provetta campione, in mano all operatore, muoversi e fare pressione sull appendice dell ago stesso Fig 15 Ago del blocco campionatore di HeCoSampler Il momento più critico nella campionatura del sangue è l associazione della provetta al relativo paziente; nel passato questo passaggio poteva provocare errori in quanto era basato sull ordine progressivo col quale le provette venivano messe nel relativo contenitore L automazione e l informatizzazione hanno reso questo passaggio molto più sicuro grazie all introduzione delle etichette standard bar-code, che vengono associate ai singoli pazienti e applicate sulle relative provette al momento del prelievo Come sarà illustrato più avanti, HeCoSampler fa uso proprio di questa tecnologia per il miglioramento del sistema di etichettatura: su ciascuna provetta contenente sangue è attaccata un etichetta adesiva con sovrascritto un codice a barre che associa univocamente la provetta al paziente 13 Risposta SEAC al campionamento automatico: HeCoSampler A dir la verità, le prime esperienze in SEAC per quanto riguarda il campionamento automatico sono state fatte con un precedente strumento, 8

14 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE l Hema Sampler Questo strumento interagiva con il contaglobuli GENIUS progettato e prodotto in SEAC La macchina presentava delle criticità che hanno spinto successivamente alla nascità di HeCoSampler Le principali criticità di Hema Sampler erano le seguenti tre: Associazione analisi-paziente indiretta Elevato carry-over Consumo elevato di sangue per un singolo esame Per capire le cause di queste criticità può convenire dare un occhiata alla macchina In figura 16 è ben visibile il sistema di caricamento provette a rotore, elemento che caratterizza Hema Sampler Le provette, fino ad un massimo di 24, vengono caricate sul rotore Il riconoscimento delle singole provette non avviene tramite Fig 16 Hema Sampler (accessorio di Genius) la lettura diretta del bar-code, ma attraverso riferimenti sul rotore stesso che la macchina riconosce ed associa ad ogni analisi In pratica, la macchina non associa direttamente l analisi al paziente ma associa analisi-posizionepaziente Questo passaggio rappresenta la prima criticità del sistema Le successive due criticità derivano dal fatto che il campionatore Hema Sampler è un corpo fisicamente staccato dal contaglobuli vero e proprio GENIUS Il collegamento fra le due parti avviene tramite tubazioni idrauliche esterne Le provette sul rotore di Hema Sampler sono in continua agitazione durante il movimento circolare di posizionamento e questo favorisce la non 9

15 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE coagulazione del sangue Al momento del prelievo non basta un ago, ma è necessaria pure una pompa specifica a bordo di HemaSampler per il trasporto; una pompa che aspiri il sangue e lo spedisca tramite tubo capillare al contaglobuli La fine del tubo raggiunge un bicchierino, una struttura di raccolta cioè, dove il sangue si deposita Da lì viene aspirato, inviato in camera di diluizione e quindi preparato alle analisi Quando la prova è conclusa, da un foro laterale al bicchierino entra il diluente che, aspirato dalla pompa del campionatore, pulisce la camera di prelievo e tutta la tubazione dal campionatore al bicchierino: in questo modo si cerca di abbassare il più possibile il carry over, parametro che tiene conto quanto una misura è influenzata dalla precedente a causa delle impurità nel tubo e rimanenze delle analisi precedenti Nonostante l alto consumo di diluente, il carry over rimane elevato a causa del tubo di collegamento fra campionatore e contaglobuli Occorre osservare l ultimo limite dello strumento: è necessario aspirare dalla singola provetta e spedire al contaglobuli 600µl contro i 40µl di sangue necessari al GENIUS per compiere la prova Ne risulta un grande spreco di materiale con relativo alto consumo di liquidi reagenti Questa tipologia di campionatore pur avendo in sé dei difetti certamente rappresenta un balzo in avanti rispetto all alimentazione manuale della macchina da analisi, arrivando ad una produttività di 65 campionature/ora Il moderno campionatore automatico, presente in commercio, in molti casi è parte integrante della macchina d analisi Questa soluzione serve ad ottimizzare il dialogo fra macchina d analisi e campionatore L assemblare il campionatore alla macchina limita la lunghezza dei tubi di collegamento, evita il collegamento indiretto fra ago di prelievo e camera di diluizione, e quindi 10

16 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE limita il carry over e la quantità di liquido ematico necessario al prelievo Come conseguenza positiva a tutto ciò possiamo abbassare i consumi di liquidi reagenti Scompare il compito dell operatore di effettuare il riconoscimento diretto delle provette, operazione questa che viene lasciata alla macchina, che ha un lettore bar-code a bordo e le provette sono contenute all interno di contenitori più comodi e maneggevoli La risposta di SEAC a tutti questi requisiti è HeCoSampler (fig 17), lo strumento contaglobuli con campionatore automatico integrato che l azienda ha intenzione di lanciare nell immediato futuro Fig 17 HeCoSampler Come si può vedere da subito, lo strumento si compone di due parti: la parte sinistra, HeCo, che è il contaglobuli effettivo e la parte destra dove è 11

17 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE alloggiato il blocco campionatore Il blocco campionatore ha la forma di un piccolo armadio ; in esso si distinguono due spazi vuoti di uguale dimensione che possono contenere ciascuno un massimo di 8 rack disposti a pila uno sopra l altro Questi spazi vuoti sono rispettivamente il vano di carico e il vano di scarico Nella colonna di separazione fra vano di carico e vano di scarico, quindi a metà strada della corsa carrello, è posizionato il lettore barcode addetto alla lettura del codice a barre delle 6 provette inserite nel rack che scorre sotto di esso Inseriti nel blocco campionatore vi sono 4 motori passo passo ed 1 motore in corrente continua Ciascun motore passo passo assolve ad un compito specifico Nella fattispecie, ve ne sono 4 per assolvere ai 4 differenti movimenti del campionatore automatico integrato e cioè: o Caricare il rack sul carrello o Mettere in oscillazione il carrello o Muovere orizzontalmente il carrello presentando la provetta dinanzi all ago o Estrarre il rack dal carrello inserendolo in coda al vano di scarico Il motore in corrente continua serve a muovere l ago di prelievo e cioè a spingerlo fuori dal gruppo ago [24] dove è alloggiato fino a penetrare la provetta posta dinanzi ad esso e poi retrarre nuovamente nel gruppo ago fino a raggiungere il punto morto inferiore da cui il liquido ematico aspirato viene mandato alla circuiteria del contaglobuli Da notare che la quantità sufficiente per l esame, stavolta, è 20µl contro i 40µl di GENIUS: una riduzione del 50% HeCoSampler fa parte, insieme a HeCo ed HeCoVET, della famiglia HeCo3POP, i contaglobuli SEAC a 3 popolazioni 12

18 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE Analizziamo nei prossimi paragrafi il modo con cui si caratterizza il sangue, cosa si intende per conta cellulare e cosa indica il termine popolazioni Illustriamo infine le tecniche messe a punto nel campo dell analisi ematologica automatica Il tutto ci serve per inquadrare a dovere lo strumento contaglobuli con cui ci troviamo ad interagire 14 Metodi di indagine ematologica Il sangue rappresenta uno dei fluidi corporei più accessibili (in realtà si tratta di un tessuto) ed è stato oggetto di numerosi e approfonditi studi data l enorme importanza che riveste La produzione di cellule sanguigne va sotto il nome di emopoiesi ed avviene, dopo la nascita, esclusivamente nel midollo osseo Nell uomo si ha una genesi unica per tutte le componenti cellulari ematiche e immunitarie a partire dalla cosiddetta cellula staminale capace di dare origine, attraverso tappe evolutive maturative regolate da complessi meccanismi di differenziazione, a cellule mature del sangue Una volta diversificate e maturate, secondo modi e tempi specifici, le differenti cellule ematiche migrano dal midollo osseo al sangue periferico ed entrano così definitivamente nel circolo sanguigno arterioso e venoso Alcuni parametri quantitativi del sangue, essendo misurabili in maniera agevole, vengono individuati ordinariamente nella maggior parte, se non nella totalità, dei pazienti Tali indici quantitativi sono: 1) la concentrazione di emoglobina nel sangue intero, espressa come Hgb; 13

19 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE 2) il numero di eritrociti RBC, o conta eritrocitaria, il numero di leucociti WBC, o conta leucocitaria, il numero di piastrine Plt per unità di volume sanguigno; 3) il rapporto tra volume eritrocitario e volume totale sanguigno, o tasso di ematocrito Hct, nella terminologia anglosassone detto package cell volume (PCV) Dalla conoscenza di Hgb, del numero di globuli rossi RBC e di Hct si possono facilmente calcolare le costanti eritrocitarie: volume eritrocitario medio (MCV), concentrazione di emoglobina per globulo rosso (MCH) e concentrazione eritrocitaria media di emoglobina (MCHC) Tutti insieme, questi valori formano il cosidetto complete blood count (CBC), o conta ematica completa, che costituisce una delle analisi di laboratorio effettuate con maggiore frequenza Il CBC si distingue come un indagine quantitativa; ad essa si affianca una metodologia di indagine qualitativa, comprendente: 1) l analisi morfologica delle emazie (globuli rossi) e il calcolo del diametro corpuscolare medio; 2) l analisi morfologica delle piastrine; 3) l analisi morfologica dei leucociti e la determinazione della formula leucocitaria 14

20 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE Il complesso di indici numerici e analisi morfologiche descritte prende il nome di emogramma ed è schematizzato in figura 18 di seguito; si tratta dell esame fondamentale di base per tutte le indagini ematologiche Molto spesso, tuttavia, ci si limita ad integrare il CBC con il procedimento di cui al punto 3), ottenendo il leukocyte differential count (LDC), o conteggio leucocitario differenziale [3,6,7]: per questa ragione si parla di conteggio leucocitario differenziale (LDC) e conteggio cellulare differenziale (DCC) indistintamente Il conteggio leucocitario differenziale e la conseguente curva di distribuzione dei globuli bianchi è, peraltro, uno dei dati caratterizzanti lo strumento contaglobuli HeCo oggetto di questa trattazione Fig 18 Schema dell emogramma 15

21 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE 15 Conta e classificazione dei leucociti Il conteggio cellulare è stato affidato fino a pochi anni fa al metodo tradizionale manuale basato sull analisi morfologica al microscopio Questa metodologia, pur continuando a rivestire un ruolo di primo piano nell analisi del sangue e di altri tessuti (midollo osseo), per molti scopi sta perdendo terreno rispetto ad altre tecnologie anche a causa di un notevole aumento di domanda di esami di laboratorio (a titolo di informazione, statistiche riportano dati precisi per cui, nei Paesi occidentali, il numero di esami annui effettuati è quintuplicato nel decennio a fronte di una crescita demografica che invece è rimasta sostanzialmente invariata) Il notevole sviluppo tecnologico avvenuto in tempi recenti ha comportato un aumento ed un miglioramento delle informazioni, sia quantitative che qualitative dei campioni In particolare, l introduzione di strumenti automatici nella diagnostica di laboratorio ha contribuito ad un rapido sviluppo nell analisi elettronica con conseguente abbattimento dei costi e riduzione del tempo complessivamente trascorso tra la richiesta e l ottenimento dell analisi clinica Lo scopo finale dell esame è quindi quello di ottenere utili informazioni delle condizioni di salute del campione fornito e quindi del paziente, utilizzando una metodologia che permetta all operatore di laboratorio di limitarsi ad analizzare i dati ottenuti dalla macchina senza andare ad eseguire un analisi diretta Un contributo molto importante nell evoluzione della diagnostica è stato dato dal conteggio cellulare differenziale, ovvero dal conteggio delle differenti popolazioni di globuli bianchi presenti nel sangue In questo ambito lo strumento automatico si pone l obiettivo di determinare le caratteristiche morfologiche delle cellule ematiche e la frequenza in un formato puramente quantitativo, con cui esse si presentano nel determinato campione 16

22 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE Quindi, la tipologia di strumenti su cui focalizzare l attenzione è quella che eseguono un analisi specifica delle cellule presenti nel sangue ed in particolare le popolazioni di globuli bianchi dette leucocitarie Tali cellule risultano avere una concentrazione fortemente inferiore rispetto alle altre presenti nel sangue I globuli rossi ad esempio risultano di facile individuazione proprio grazie alle loro massiccia concentrazione pari a 1000 volte maggiori rispetto ai globuli, quindi per l individuazione di quest ultimi è necessario eseguire un trattamento che elimini le altre cellule presenti poiché si possono confondere Tale trattamento sfrutta le proprietà di un lisante con soluzione di NaCl che grazie alla pressione osmotica elide i globuli rossi lasciando piccoli residui di dimensioni trascurabili Le popolazioni leucocitarie (vedi figura a fianco) che solitamente appaiono sono principalmente tre: Granulociti (65%), Linfociti (30%), Monociti (5%) A sua volta i Granulociti si suddividono in altre tre famiglie portando il numero totale delle popolazioni a cinque: Neutrofili (95%), Eosinofili (4%) e Basofili (1%) Ai fini dell analisi in laboratorio, più popolazioni riesce ad individuare lo strumento e più l analisi risulta completa Fig 19 Morfologia delle 5 popolazioni leucocitarie Come già si intuisce in fig 19, il volume è un fattore di distinzione molto importante per individuare le singole popolazioni: i Linfociti sono la tipologia di cellule più piccola in assoluto, mentre i Neutrofili sono la più grande in assoluto Nel mezzo vi stanno i Monociti, gli Eosinofili e i Basofili che, fra l altro, rappresentano la percentuale più piccola in termini di presenza con 17

23 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE circa l 8% Nell istogramma a tre popolazioni Monociti, Eosinofili e Basofili vengono accorpati insieme in quelle che la terminologia medica definisce medie cellule La curva di distribuzione (istogramma) delle varie tipologie di globuli bianchi varia da paziente a paziente, in base proprio a come è distribuito il numero delle singole particelle all interno dell organismo dell individuo, ma in generale assume un andamento standard come quello riprodotto in figura 110 Fig 110 Diagramma delle tre popolazioni leucocitarie Sull asse delle ascisse vengono riportate tutte le possibili dimensioni volumetriche assumibili dalla singola cellula ematica espresse in femtolitri (1fl=10-12 litro), mentre in ordinate viene riportato il numero (oppure la percentuale) delle cellule misurate ed aventi un ben preciso volume Escludendo la parte del diagramma più vicina all origine (quella che arriva fino alla prima soglia di separazione) che rappresenta il rumore iniziale, si possono individuare tre zone distinte divise da altrettante soglie di separazione: procedendo da sinistra verso destra si incontra per prima la zona dei Linfociti, segue poi la zona delle Medie Cellule ed infine quella dei Granulociti Neutrofili Le aree sottese dalle tre zone, in un paziente non in presenza di patologie particolari, stanno in un rapporto percentuale di circa 30%, 8%, 62% come detto in precedenza Le soglie di separazione indicano l inizio di quando un volume cellulare deve essere considerato facente parte 18

24 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE alla famiglia dei Linfociti, Medie Cellule, Granulociti Neutrofili rispettivamente La posizione delle soglie arriva da bibliografia medica e non è necessariamente fissa, ma può variare con la razza [vedi Hanes II, 23] Conta manuale L esame a microscopio di pellicole ematiche fissate e colorate, al fine di estrapolare ulteriori informazioni di tipo qualitativo da aggiungersi a quelle per lo più di tipo quantitativo fornite da uno strumento di conta automatico, costituisce tutt oggi una parte essenziale di qualunque indagine ematologica Diverso è il discorso per il conteggio manuale, come sottolineato nel documento H20-A del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), dal momento che lo studio morfologico delle cellule del sangue presuppone l esecuzione dello striscio di sangue, una opportuna colorazione e quindi l analisi al microscopio I tre fattori che maggiormente contribuiscono, in termini di errore, all imprecisione del conteggio manuale sono: la distribuzione dello striscio il riconoscimento cellulare la statistica del campione La distribuzione dello striscio è un problema in quanto non si dispone uniformemente sul vetrino; vi sarà una parte troppo spessa ed una troppo sottile Anche gli stessi globuli bianchi non si dispongono uniformemente: le cellule più grandi come monociti e neutrofili vengono spinte verso la Fig 111 Distribuzione dello striscio 19

25 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE coda e verso i lati mentre i linfociti tendono a concentrarsi al centro L errore dovuto alla disuniformità dei leucociti viene corretto effettuando una scansione a serpentina, o battlement track, grazie alla quale si perlustra tutta la zona utile dello striscio (fig 111) Rimangono tuttavia irrisolti una serie di problemi dovuti al fatto che il processo attraverso il quale le cellule vengono applicate al vetrino (diffusione, colorazione, centrifugazione) può modificare l aspetto ed il contenuto cellulare delle stesse Il riconoscimento cellulare a occhio nudo porta inoltre ad una varietà di errori di identificazione, alcuni dei quali sono attribuibili al livello di allenamento ed esperienza dell osservatore, oltrechè al suo grado di motivazione, stress, affaticamento e distrazione: occorre mettere in evidenza che certe tipologie cellulari implicano maggiori discordanze tra gli osservatori, i quali raramente discutono il conteggio degli eosinofili i cui criteri morfologici possono essere agevolmente definiti, mentre spesso si trovano in disaccordo sul conteggio dei monociti e dei neutrofili a bastoncello Si è rivelata molto problematica l applicazione consistente di criteri morfologici a diversi osservatori o, ancor più manifestamente, tra diversi istituti o tra diversi Paesi La differenziazione cellulare soggettiva, pertanto, conduce a risultati inconsistenti; le probablità di inconsistenza nei casi in cui si applichi un analisi cellulare elettronica alle popolazioni leucocitarie sono assai minori Terzo ed ultimo punto è la statistica del campione: tipicamente, in un procedimento di conta manuale vengono considerate 100 cellule complessivamente e così la numerosità dei vari sottogruppi esprime direttamente anche il valore percentuale rispetto al totale; l insieme di tali percentuali prende poi il nome di formula leucocitaria E evidente che, concentrando l attenzione su 100 cellule, ognuna delle 5 sotto-popolazioni leucocitarie avrà un numero di unità molto inferiore a 100 L imprecisione 20

26 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE nella conta differenziale manuale di routine è perciò rilevante ed i suoi ampi intervalli di confidenza influenzano pesantemente il processo di decisione clinica Assumendo che la frequenza N di una certa tipologia cellulare rimanga costante indipendentemente dal numero assoluto di cellule contate su uno striscio, la deviazione standard della sua stima mostrerà una convergenza stocastica a zero come 1/ N al crescere della dimensione del campione; per ottenere una bassa deviazione standard servirebbe un gran numero di cellule enumerate, ben al di là dei limiti del più tenace morfologista Statisticamente, leucociti conteggiati rappresentano un campione di riferimento ottimo per cui l incertezza associata ad ogni popolazione risulta essere inferiore a ±1% [7,8,9] Molti analizzatori automatici oggi in commercio conteggiano circa 8000 leucociti La superiorità statistica della conta cellulare elettronica è schiacciante Tecniche di supporto Si è visto che la LDC e la relativa determinazione della formula leucocitaria svolta manualmente al microscopio risulta essere una procedura di scarsa affidabilità statistica oltrechè assai dispendiosa sia per il tempo sia per il notevole impegno richiesto Storicamente, due sono stati gli approcci teorici al tentativo di automatizzare il DCC che si sono susseguiti: l analisi di immagini e l analisi a flusso Analisi di immagini Il primo tentativo in ordine di tempo è stato quello di automatizzare la procedura così com era, ovvero di puntare ad un analisi automatica al microscopio Si hanno notizie di tentativi avvenuti in tale direzione già negli anni 40 Negli anni 60, complice l avvento dei primi calcolatori, venne intrapresa la strada dell analisi di immagini effettuata con algoritmi computerizzati La possibilità di implementare un sistema 21

27 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE automatizzato in grado di compiere analisi morfologiche al microscopio appariva una soluzione interessante per rimpiazzare la procedura manuale: un algoritmo robusto che sostituisse l interpretazione soggettiva dell osservatore, unitamente ad una gestione automatizzata del campione per mettere in piedi un sistema autonomo Di fatto, molti sistemi basati sull analisi delle immagini erano in grado di identificare la quasi totalità delle cellule ematiche per esemplari normali (sani), ma fallivano in presenza di campioni appartenenti a pazienti con disturbi significativi Di conseguenza, l operatore si trovava costretto ad interagire con il sistema per completare l identificazione delle rimanenti cellule, solitamente difficili da classificare Inoltre, i sistemi di analisi delle immagini erano lenti, anche in confronto all analisi manuale al microscopio e non potevano essere considerati sistemi autonomi a causa dello scarso livello di automazione e della presenza di algoritmi di riconoscimento che richiedevano una quasi costante interazione da parte dell operatore Questi sistemi di analisi delle immagini si mostrarono lenti anche quando impegnati nell analisi di un basso numero di cellule (che di per sé rappresentano un campione di scarsa affidabilità statistica, come spiegato in precedenza) Riassumendo, i limiti del sistema di analisi di immagini sono: elevato grado di errore nei pazienti con patologie lentezza e scarsa affidabilità statistica L importanza dell analisi di immagini nell ambito del laboratorio clinico si è molto ridimensionata col tempo, fino a segnare definitivamente il passo nei primi anni 90: solo in Giappone e in alcuni paesi europei mantiene vivo un certo interesse con la ricerca orientata a nuovi approcci matematici come la Pattern Recognition e l impiego di reti neurali [13,14,15,16,17,18] 22

28 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE Parallelamente al declino dell analisi di immagini, gli strumenti a flusso si andavano sempre più affinando imponendosi all attenzione dei costruttori Analisi a flusso Un approccio completamente diverso per il conteggio differenziale venne dalla messa a punto di un sistema a flusso in grado di analizzare cellule ematiche in sospensione I primissimi sviluppi di DCC citometrico automatico nel campo ematologico risalgono agli anni 30 e si basano su sistemi a flusso continuo, nei quali i singoli campioni venivano separati tra loro da bolle d aria (come negli analizzatori chimici dell epoca) Quindi, l uso combinato di un flusso continuo con trattamento citochimico enzimatico e separazione dei campioni portò ad un miglioramento dei risultati notevolissimo, in termini statistici, rispetto al DLC manuale Il problema maggiore era dovuto al fatto che non era pratico far operare lo strumento a ciclo continuo a causa dei proibitivi costi dei reagenti e della delicata procedura di calibrazione del sistema a flusso continuo I progressi successivi in campo tecnologico furono mirati a rendere accessibile il DLC tramite analisi elettronica creando uno screening differenziale capace di eliminare il ricorso al microscopio: un contributo determinante alla causa arrivò grazie al principio di Coulter, il cui brevetto fu ufficialmente depositato nel 1956 I laboratori svilupparono sistemi per l analisi dei leucociti basati sul dimensionamento cellulare ovvero sul principio di Coulter (sistemi impedenziometrici) e successivamente sistemi basati sulle proprietà di scattering della luce (sistemi a flusso ottico): questi sono i due principi fisici fondamentali sviluppati per gli analizzatori a flusso 23

29 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE Entrambi i metodi si sono arricchiti di nuove soluzioni realizzative nel corso degli anni C è da dire che i migliori risultati, in termini di qualità degli strumenti, si hanno con l impiego combinato di entrambi i principi fisici Lo strumento HeCoSampler, oggetto di questa trattazione, utilizza il metodo impedenziometrico: la SEAC, in linea con la maggioranza dei costruttori di contaglobuli automatici, ha prodotto finora strumenti che utilizzano questo metodo Vediamo adesso un po più in dettaglio su cosa si basano queste tecniche 151 Metodo impedenziometrico W Coulter, fondatore dell omonima compagnia (oggi divenuta Beckman Coulter Co), sviluppò e registrò ufficialmente nel 1956 un brevetto tecnico per il metodo di conteggio eritrocitario basato su una misura di resistenza elettrica [19] Lo stesso ideatore descriveva il suo metodo, in un articolo dell epoca, in questo modo: Una sospensione di cellule ematiche è fatta passare attraverso un piccolo orifizio simultaneamente ad una corrente elettrica La singola cellula ematica passante attraverso l orifizio (o apertura) introduce una variazione di impedenza determinata dalle dimensioni della cellula Il sistema conta le singole cellule e fornisce la loro distribuzione volumetrica Fig 112 Camera di conteggio ad elettrodi 24

30 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE Come indicato schematicamente in figura 112, il campione viene inserito nel contenitore di sinistra e contemporaneamente viene creata una differenza di pressione tra i due recipienti La sospensione cellulare viene quindi forzata a passare attraverso un apertura di piccole dimensioni che conduce al contenitore di destra Al canale di collegamento è applicata una tensione di intensità costante (questa è la scelta fatta in SEAC, in quanto un generatore di tensione è più facile da realizzare rispetto ad un generatore di corrente), fornita da due elettrodi situati da una parte e dall altra dell apertura Ogni cellula, quindi, passando attraverso l apertura del campo elettrico crea un Fig 113 Passaggio nel canale capillare (aumento di resistenza) aumento di resistenza nel canale rilevata da una struttura a ponte La misura di tale variazione d impedenza permette la distinzione tra globuli rossi e piastrine, e la stessa cosa avviene nel caso dei globuli bianchi una volta effettuata la emolisi dei rossi Il valore reso all uscita, dipende dal volume della cellula, mentre la durata dell impulso, dalla lunghezza del capillare Per ottenere valori più precisi possibile si dovrebbe far si che il canale sia di diametro pari a quello del globulo che lo attraversa, con il rischio però che il canale si intasi Si dimensiona quindi il canale in base ad un compromesso tra precisione e funzionamento regolare dello strumento Il dimensionamento del canale è stato il principale problema che il metodo impedenziometrico ha dovuto affrontare all inizio della sua introduzione e i 25

31 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE due aspetti critici che si sono presentati nella ricerca di misure più precise possono essere riassunti in: coincidenza non-identificazione interazione orizzontale interazione verticale Fig 114 Fenomeno di coincidenza orizzontale Idealmente, se le particelle si dirigono verso la zona di misura una per volta, è possibile ricavare il numero totale di eventi rivelati in essa; può accadere, tuttavia, che nella zona di misura siano presenti più cellule simultaneamente Questo fenomeno prende il nome di coincidenza, mentre il relativo errore è noto come errore di coincidenza [20] In fig 114 viene mostrato il caso in cui due cellule di dimensioni differenti passano insieme nel canale: l impulso risultante è costituito dalla sommatoria punto a punto lungo l intera sezione dei due impulsi dovuti alle due cellule Ne risulta quindi una forma discendente a zero con due picchi, anziché la tipica forma assomigliante ad una curva gaussiana Se le due particelle avessero avuto identico volume, l impulso avrebbe avuto una forma cosiddetta a M L interazione orizzontale con impulso a M risulta costituito da due gobbe aventi la stessa altezza 26

32 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE Si può osservare in fig 114 che un interazione orizzontale provoca un impulso di durata temporale maggiore: è sulla base di questa osservazione che fu introdotto l editing elettronico (Hogg, 1972) da parte della Coulter Company Letteralmente, si trattava di impiegare circuiti in grado di discretizzare, affettare il segnale misurato e quindi riconoscere, laddove fossero presenti, segnali anomali dovuti a coincidenza Una volta riconosciuti i casi di coincidenza poi, scartarli oppure scomporli nei vari contributi conteggiando le cellule ematiche in maniera corretta Oltre all editing elettronico, si adotta anche una soluzione di tipo matematicoinformatico: nei maggiori analizzatori ematologici, dall analisi dei risultati di misura relativi a campioni con differente concentrazione, si riesce a stabilire la formula per correggere l errore di coincidenza Il fattore di correzione sopra citato viene usato soprattutto nel caso di coincidenza con interazione di tipo verticale (fig 115): in tal caso viene rilevato un segnale singolo di ampiezza elevata anche se due cellule attraversano l apertura contemporaneamente Non è possibile stabilire, a priori, se l impulso grande è da ritenersi associato ad una singola particella grande o a due o più particelle piccole Questa situazione viene definita di nonidentificazione Fig 115 Fenomeno di coincidenza verticale Vi è un altra situazione di non-identificazione ed è dovuta all effetto del flusso assiale e non-assiale di particelle in un campo elettrico all entrata e ai bordi 27

33 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE della zona di misura, come ebbe modo di illustrare Thom nel 1969 in seguito ad una serie di studi da lui effettuati [20] In questo studio risultò che singole particelle passanti vicino alle pareti della cella di misura producono un impulso a M del tutto simile a quello dovuto alla coincidenza orizzontale (fig 116) Stavolta, il segnale a M viene generato dalla singola particella e non ha niente a che vedere con il fenomeno di coincidenza; la sua causa è da attribuire all elevata Fig 116 Impulso generato da una particella in sospensione, al variare della sua posizione assiale, immersa in un campo elettrico Densità di corrente presente alle pareti della zona di misura Questa osservazione decretò l impossibilità di determinare la causa dell impulso M: attraversamento non assiale della cella di misura o interazione orizzontale tra una coppia di particelle? La situazione è definita di non-identificazione Se, da un lato, il risultato della conta può essere ritenuto valido grazie alla correzione dell errore di coincidenza, dall altro non c è modo di correggere la misura del volume cellulare Vi è una soluzione definitiva sia al problema della non-identificazione che ancor prima a quello della coincidenza: Thom risolvette questi problemi con il metodo della focalizzazione idrodinamica Focalizzazione idrodinamica Consiste nello scorrimento di un flusso costante di diluente, in gergo chiamato sheath (guaina, fodero) attirato verso l apertura; le particelle in sospensione vengono iniettate al centro di questo 28

34 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE fluido (supposto dotato di moto laminare), in prossimità dell ingresso dell apertura, a formare un flusso fine avvolto dallo sheath Con questo principio il fenomeno di interazione verticale è drasticamente ridotto, in quanto nessuna particella scorre nelle vicinanze delle pareti della cella di misura o dell angolo di entrata dell apertura, laddove è maggiore la densità di corrente Di conseguenza, tutti i segnali a M sono riconducibili ai casi di interazione orizzontale A sua volta, quest ultima può essere abbassata con la scelta di un opportuno rapporto di diluizione del campione di misura Fig 117 Flusso delle cellule ematiche in assenza e in presenza di sheath idrodinamico Lo sheath ha anche la funzione di impedire il ricircolo di particelle le quali: a) potrebbero essere ricontate erroneamente; b) potrebbero formare dei vortici nella cella di misura, che si tradurrebbero in segnali di piccola ampiezza e lunga durata (rumore di fondo) che deteriorano il SNR [2] La figura 117 riassume schematicamente le due differenti situazioni, in assenza e in presenza di sheath idrodinamico Le prove susseguenti (che Thom fece con un insieme di microsfere di lattice di tre differenti dimensioni) servirono per confrontare le curve di distribuzione volumetrica in presenza ed in assenza di sheath; con l ausilio di tale 29

35 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE tecnologia si ottiene un istogramma di distribuzione volumetrica molto più smooth (fig 118) Fig 118 Confronto fra curve di distribuzione volumetrica in assenza e in presenza di sheath In conclusione, i contaglobuli a tre popolazioni basati sul metodo impedenziometrico si dimostrarono sorprendentemente efficaci nel fornire risultati di analisi e quindi individuare eventuali anomalie su campioni di pazienti che prima necessitavano di una revisione manuale (vedi fig 119) Peraltro, in campioni regolari (cioè di pazienti non marcati da patologie particolari) il conteggio cellulare si limitava alle sole tre popolazioni leucocitarie supponendo di avere valori normali di eosinofili e basofili; questo comportò per i laboratori un notevole guadagno di tempo riducendo notevolmente i volumi di campioni da revisionare senza compromettere la salute dei pazienti A sua volta, lo snellimento del carico di lavoro implicò un abbattimento dei costi e un incremento del rendimento [8,9,10] A conferma della validità del metodo Fig 119 Criteri per la revisione 30

36 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE impedenziometrico, dallo studio citato in fig119 così come da altri studi, non emergono sostanziali differenze di risultati tra i sistemi impedenziometrici e quelli che integrano le tecnologie impedenziometrica e flusso ottico (limitatamente alle tre popolazioni leucocitarie) Metodo RF/DC Che potesse essere valido il tentativo di differenziare le popolazioni leucocitarie attraverso lo studio del contenuto cellulare dei diversi globuli e non solo del loro volume ci se ne accorse, la prima volta, quando attorno al 1960 la TOA Medical Electronics (oggi Sysmex), per evitare rischi di infrazione del brevetto Coulter, sviluppò un metodo capacitivo di misura Il metodo capacitivo è del tutto simile a quello resistivo [5], con la differenza che stavolta la corrente usata è ad alta frequenza (35 MHz, da cui l abbreviazione RF, Radio Frequency): quando una particella è situata nell area di rivelazione, si ha una variazione di capacità elettrica proporzionale al volume della particella (fig 120) Sappiamo che nel metodo resistivo gli impulsi di rivelazione sono correlati al volume cellulare; i segnali di natura capacitiva, invece, dipendono non solo dal volume cellulare, ma anche Fig 120 Metodo capacitivo dal loro contenuto, presenza e tipo di granulazioni, conformazione del nucleo A condizione che l integrità dei globuli bianchi sia mantenuta, pertanto, la misura simultanea di resistenza e capacità (metodo RF/DC) porta alla conoscenza del volume cellulare e di alcune caratteristiche morfologiche interne: questo poteva spingerci verso il traguardo delle cinque popolazioni [20] 31

37 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE Il metodo RF/DC non ebbe molto successo a causa degli elevati costi di fabbricazione e manutenzione Non a caso, tale metodo fu abbandonato non appena il brevetto di Coulter arrivò a scadenza nel 1976 [5] 152 Metodo ottico (scattering) Tale tecnologia è fondata essenzialmente sull interazione luce-materia: quando un fascio di luce incide su un oggetto, manifestando una variazione dell indice di rifrazione, una frazione della luce può essere assorbita e una parte può essere deviata- si dice cioè che è soggetta a scattering (fig 121) In questo caso la materia sono le cellule ematiche, in particolar modo il globulo bianco Di fondamentale importanza è la morfologia dei globuli bianchi illustrati in fig19; la notevole differenza esistente tra le diverse forme dei globuli bianchi fa si che la luce proveniente dallo scattering abbia una conformazione diversa per ogni tipo di globulo bianco Se così non fosse, il metodo perderebbe la sua utilità Fig 121 Fenomeno di scattering 32

38 Capitolo 1 CARATTERISTICHE TECNICHE Il fenomeno di assorbimento può essere incrementato trattando le cellule con coloranti chimici e questo ci può servire per enfatizzare differenze di volume che altrimenti rimangono minime (come si è visto per le medie cellule) In generale, l energia assorbita viene convertita in calore; in alcuni casi, tuttavia, una frazione di essa può essere re-irradiata ad una diversa lunghezza d onda (fenomeno di fluorescenza) I coloranti che favoriscono la fluorescenza vengono detti fluorescenti L interazione primaria, che da onda incidente si divide in onda trasmessa e onda scatterata, viene di solito rivelata attraverso l ausilio di due fotosensori: il primo sensore viene messo lungo il percorso del fascio di luce incidente e vedrà l interazione in termini di una riduzione di intensità luminosa che lo colpisce Riduzione pari alla differenza tra radiazione incidente e quella dovuta a scattering ed assorbimento; in realtà, ponendo un opportuno filtro davanti al sensore l effetto relativo all assorbimento può essere amplificato e quindi interpretare la misura come dovuta (quasi) solo all assorbimento Tale sensore prende il nome di forward scatter il secondo sensore viene sistemato a formare un certo angolo rispetto alla direzione del fascio incidente; adesso l interazione luce-materia si manifesta in un aumento dell intensità luminosa dovuto allo scattering Tale sensore prende il nome di side scatter: normalmente è in grado (oppure viene accoppiato insieme ad un altro sensore che lo è) di rivelare fenomeni di fluorescenza se dotato di un filtro ottico che taglia la lunghezza d onda del fascio incidente [1] La cellula colpita dal fascio luminoso focalizzato, emette segnali di luce diffusa per fenomeni fisici di rifrazione, riflessione (side scatter) e diffrazione (forward scatter) 33