Commissione Internazionale sulla Trichinellosi

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1 Commissione Internazionale sulla Trichinellosi Raccomandazioni sui metodi per il controllo di Trichinella negli animali domestici e selvatici destinati al consumo umano H.R. Gamble, A.S. Bessonov, K. Cuperlovic, A.A. Gajadhar, F. van Knapen, K. Noeckler, H. Schenone, X. Zhu Traduzione in Italiano a cura di E. Pozio e A. Casulli. L articolo originario è stato pubblicato su Veterinary Parasitology 2000, 93:

2 Sommario Lo scopo di questo documento è di fornire una serie completa di raccomandazioni per il controllo di Trichinella a tutti i livelli (allevamento, macello e processamento delle carni). Queste raccomandazioni sono basate sulle più aggiornate informazioni scientifiche disponibili e rappresentano la posizione ufficiale della Commissione Internazionale sulla Trichinellosi (ICT) riguardo i metodi di controllo più accettabili. Queste raccomandazioni potranno essere soggette a cambiamenti in relazione all acquisizione di nuove informazioni scientifiche. 1. Saggio alla macellazione (ispezione individuale degli animali) I metodi d ispezione alla macellazione sono stati studiati per prevenire la trichinellosi clinica nell uomo e non per prevenire del tutto la trasmissione dell infezione. I metodi correntemente utilizzati di digestione di un pool utilizzando un minimo di 1g del campione (come utilizzato per analizzare le carni suine) o il trichinoscopio che utilizza un campione di almeno 0,5 g, sono generalmente considerati sufficienti per individuare le infezioni in grado di causare la malattia clinica nell uomo. Per i prodotti che sono consumati crudi o senza trattamenti in grado di disattivare le larve di Trichinella, si raccomanda l utilizzo di metodi più sensibili per prevenire l infezione umana. 1.1 Saggio alla macellazione dei suini Per l esame routinario delle carcasse di suini mediante la digestione di un pool di campioni, si raccomanda di analizzare almeno 1g di tessuto e preferibilmente 5g (specialmente nelle aree endemiche) per prevenire la malattia nell uomo. Per gli stessi scopi, un minimo di 0,5g di tessuto, e preferibilmente di più, può essere esaminato usando il trichinoscopio (trichinelloscopio). Esempi di metodi di digestione di un pool di campioni possono essere trovati nei seguenti testi: - OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines (Articolo 3.5.3) Gamble (1998) - Direttive dell Unione Europea 84/319/EEC, che rettifica gli annessi della direttiva del Consiglio 77/96/EEC, L Appendice A di questo documento Ognuno dei metodi descritti per la digestione di un gruppo di campioni deve essere appropriatamente validato ed utilizzato in concomitanza di un appropriato sistema di assicurazione di qualità come descritto nei paragrafi 1.5 e 1.6 di questo documento. Sebbene minori variazioni nella metodologia utilizzata per eseguire il test della digestione possono non interferire con l esito, ci sono diversi punti di

3 controllo critici che devono essere esaminati per assicurare l integrità del processo di analisi. I punti di controllo critici sono i seguenti: 1. Deve essere utilizzato un sistema verificabile di raccolta e identificazione dei campioni. Il procedimento deve assicurare che i campioni di 1g o di peso superiore provengano da un eguale numero di suini e che dai campioni si possano chiaramente identificare i suini di provenienza. 2. Il liquido digestivo deve essere di buona qualità e preparato in modo tale da non inficiare l attività della pepsina. La fase più critica nella preparazione del liquido digestivo è l aggiunta dell acido cloridrico all acqua prima dell aggiunta della pepsina. Questa fase proteggerà la pepsina dalla degradazione dovuta al contatto diretto con l acido cloridrico concentrato. Altri fattori nella preparazione e nell uso del liquido digestivo (l origine e la qualità della pepsina, la quantità di pepsina e di acido cloridrico utilizzati, e il rapporti tra il tessuto ed il liquido digestivo) devono essere conformi alle direttive pubblicate. 3. La temperatura durante il processo di digestione non deve superare i 45±2 C. Temperature più elevate saranno causa di una inattivazione della pepsina e/o di una digestione incompleta e/o di una bassa percentuale di recupero delle larve. Temperature più basse richiederanno tempi di digestione più lunghi o saranno causa di un incompleta digestione del campione. 4. Dopo la digestione, non devono rimanere tessuti indigeriti (come si può evidenziare dal materiale trattenuto dal filtro). La digestione deve essere completa per assicurare l integrità del test. I rimedi ad una digestione incompleta includono un mescolamento adeguato o l omogenizzazione dei campioni, l aumento del tempo di digestione, e se questo non sortisce effetto, bisogna verificare la qualità della pepsina. 5. Le procedure ed i tempi di sedimentazione devono essere condotti in maniera tale da ottimizzare la raccolta delle larve. Gli attuali protocolli che prevedono tempi di sedimentazione di 30min, sono sufficienti. Diminuendo i tempi raccomandati si avrà come conseguenza un minore recupero delle larve. La sedimentazione può essere migliorata con la periodica vibrazione o battitura dell imbuto durante la decantazione. Il recupero del sedimento dall imbuto separatore deve includere la completa apertura del rubinetto di arresto per evitare la ritenzione delle larve. 6. I campioni digeriti devono essere sufficientemente chiarificati per permettere la visualizzazione delle larve. La classica misura per valutare se il liquido digestivo sia sufficientemente chiaro è quella di poter leggere un giornale posto al di sotto della capsula di Petri. Se il liquido digestivo non è stato reso sufficientemente trasparente c è il rischio di non osservare le larve eventualmente presenti.

4 7. Le ottiche del microscopio devono essere sufficienti ad assicurare ingrandimenti di 15-40x. Bisogna anche provvedere ad una regolare e periodica manutenzione del microscopio. 8. Il digerito deve essere esaminato prima che le carcasse vengano rimosse e immesse sul mercato. Questo sistema è necessario per assicurare che le carcasse positive non vengano distribuite per il consumo umano. 9. Deve essere tenuta tutta la documentazione che assicuri un accurata identificazione dei campioni e delle rispettive carcasse. 1.2 Saggio dei cavalli alla macellazione A causa dell abitudine di consumare carne equina non opportunamente cotta e a causa delle epidemie umane legate al consumo di carne equina, si raccomanda di seguire i seguenti test quando si fanno analisi su carcasse equine per l individuazione di infezioni da Trichinella. L ICT raccomanda che non meno di 5g di tessuto muscolare (preferibilmente 10g) della lingua o del massetere degli equini, venga saggiato con il metodo della digestione di un pool. Il diaframma (Crura diaphragmatica) è un sito alternativo, ma assicura solo da ¼ ad ½ delle larve che si possono trovare nei muscoli della regione della testa. Nelle aree dove viene consumato un gran quantitativo di carne di cavallo dovrebbero essere esaminati maggiori quantità di muscolo. L esempio del test della digestione riportato nell Appendice A può essere utilizzato per il test sugli equini, ad accezione della dimensione del campione da analizzare. I punti di controllo critici, come quelli descritti per saggiare le carcasse dei suini, dovrebbero ricevere le medesime attenzioni quando viene analizzata la carne equina. Particolare attenzione deve essere rivolta alla chiarificazione del digerito e all interferenza di fibre muscolari intatte o dei detriti nella lettura dei sedimenti. A causa delle epidemie di trichinellosi umana per consumo di carne equina, si raccomanda che tutti gli stati che esportano equini per il consumo umano implementino o rafforzino le misure di assicurazione di qualità all interno dei loro programmi d ispezione alla macellazione. Un esempio di programma di assicurazione di qualità è riportato nell Appendice B. 1.3 Saggio alla macellazione per gli animali selvatici Differenti specie di animali selvatici sono fonte d infezione per Trichinella nella popolazione umana. L ITC raccomanda che tutta la carne di animali selvatici destinati all alimentazione umana sia saggiata per la presenza di infezione di Trichinella utilizzando una delle metodologie comunemente accettate. I requisiti particolari di campionamento per saggiare la carne proveniente da animali selvatici includono le seguenti direttive:

5 - i campioni utilizzati per saggiare i cinghiali devono includere la muscolatura dell arto anteriore o del diaframma. - i campioni utilizzati per saggiare gli orsi dovrebbero includere la muscolatura del diaframma o quella del massetere o della lingua. - i campioni utilizzati per saggiare i trichechi dovrebbero includere la muscolatura della lingua. Qualora a causa delle metodologie di preparazione della carne non potessero essere utilizzati i muscoli raccomandati per i test, dovrebbero essere saggiati tagli di muscoli alternativi utilizzando per sicurezza un maggiore quantitativo di tessuto. I metodi di digestione delle carni provenienti da animali selvatici devono seguire quelli descritti per i suini (Appendice A). Il processo di controllo principale per i saggi di digestione della carne proveniente da animali selvatici è la digeribilità. A causa della difficoltà di digerire alcune carni provenienti da animali selvatici, i saggi devono essere condotti assicurandosi della completa digestione dei campioni. Altrimenti, le procedure metodologiche devono essere opportunamente modificate (Sezione 1.1). 1.4 Interventi raccomandati quando si ottiene un saggio positivo Si raccomandano le seguenti azioni quando si ottiene un campione positivo alla macellazione: 1. Le procedure ufficiali devono essere tali da permettere di identificare accuratamente le carcasse positive. L accertamento dell infezione deve essere eseguita mediante la digestione di una maggiore quantità di tessuto. I parassiti isolati dai suini domestici, cavalli o animali selvatici devono essere invitati al Centro Internazionale di Referenza per la Trichinella, Roma, Italia 1, per l identificazione a livello di specie e/o genotipo (Appendice E). 2. Le carcasse positive devono essere distrutte utilizzando una procedura ufficiale. 3. Si deve provvedere ad organizzare una procedura per permettere di: individuare l allevamento di origine degli animali positivi; condurre studi epidemiologici includendo test su un più ampio campione e una sorveglianza sierologica; pulizia degli allevamenti, cambiamenti gestionali per evitare un ulteriore infezione; e controllo nel tempo della scomparsa dell infezione. Per gli equini positivi, si raccomanda l individuazione della fattoria di origine e che vengano condotti studi epidemiologici nell area di origine. I paesi che esportano suini ed equini destinati al consumo umano devono avere un sistema di identificazione dell origine dell animale ed un fondo economico per rintracciare gli animali e per le ricerche epidemiologiche. 4. Il numero dei casi riscontrati deve essere riportato su base annua all Ufficio Internazionale delle Epizoozie (2001). 1 International Trichilella Reference Centre, Laboratory of Parasitology, Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena 299, Rome, Itly; (Tel.: ; fax: ).

6 1.5 Sistema di sicurezza della qualità per il test di digestione L ITC raccomanda che tutti i laboratori che eseguono test per la presenza di Trichinella nei suini, in altro bestiame o nelle carni di animali selvatici, mantengano un adeguato sistema di controllo qualitativo. Le misure per l assicurazione di qualità sono necessarie per assicurare che i test di trattamento funzionino correttamente. Questi includono sistemi di revisione per verificare che il protocollo venga rigorosamente seguito e che ci sia la giusta documentazione. Inoltre, i tecnici deputati alla ricerca di Trichinella devono essere forniti di campioni positivi di controllo. Questi campioni controllano l integrità dei sistemi di analisi e l abilità del personale tecnico nel visualizzare accuratamente la Trichinella. Un esempio di un sistema di controllo di qualità è riportato nell Appendice B. Si raccomanda che l assicurazione di qualità venga condotta costantemente (es. quatto volte l anno). I campioni inviati per il controllo di qualità devono essere appropriati ai metodi di analisi utilizzati (per esempio un minimo di 0.5 g di campione per l esame trichinoscopico (trichinelloscopico) e un minimo di 1.0 g per l esame mediante digestione). 1.6 Validazione dei sistemi di analisi L ITC raccomanda che tutti i metodi di analisi alla macellazione, includendo le modifiche ai metodi internazionali correntemente accettati, devono essere validate mediante procedure standard e i risultati degli studi di validazione devono essere disponibili ed utilizzati come misura dell accettabilità di tali metodi per il commercio nazionale e internazionale. La validazione di nuovi metodi sarà monitorata dall ICT. I nuovi metodi saranno valutati in un minimo di tre laboratori di riferimento selezionati da una lista di laboratori mantenuta dall ITC. La validazione consisterà nell eseguire il nuovo metodo con una lista di riferimento, includendo una serie di campioni positivi e negativi. La lista di riferimento deve essere preparata come suggerito da Forbes et al. (1998). La lista di riferimento valutata da ogni laboratorio di referenza dovrebbe consistere in un minimo di 40 campioni includendo 10 campioni negativi, 10 campioni contenenti 3-5 larve per grammo di tessuto (LPG), 10 campioni contenenti LPG e 10 campioni contenenti LPG. Risultati accettabili dei test tra i tre laboratori di referenza sono: 1) una sensibilità del 90% (con il livello di confidenza del 95%) per i campioni contenenti 3-5 LPG; e 2) il ritrovamento di almeno il 75% delle larve totali nei campioni contenenti e LPG. 1.7 Sistemi di test alternativi Metodi indiretti di analisi (sierologici) non sono raccomandati come sostituti dei test diretti (trichinelloscopio e digestione di un pool) sulle singole carcasse alla macellazione. Miglioramenti nei metodi di analisi diretti devono essere valutati

7 per sensibilità e specificità nei confronti dei metodi di digestione correntemente utilizzati. 2. Metodi di trattamento per il controllo della Trichinellosi Tutte le carni provenienti da animali che potrebbero contenere larve di Trichinella e trovate negative con un metodo non riconosciuto idoneo devono essere trattate con un metodo che sia stato dimostrato inattivare le larve di Trichinella, prima della distribuzione per l alimentazione umana. Quanto detto deve essere applicato sia alle carni di provenienza commerciale che non commerciale. L ITC riconosce la validità di tre metodi di trattamento accettabili che possono essere utilizzati per rendere le carni sicure, se non altrimenti provate di essere prive da infezione di Trichinella. Questi metodi includono la cottura, il congelamento e l irradiazione. 2.1 La cottura per inattivare Trichinella Nel momento in cui si dispone dell opportuna attrezzatura per monitorare accuratamente le combinazioni di tempo e temperature, le linee guida sulla cottura del codice del Regolamento Federale del Dipartimento di Agricoltura degli Stati Uniti (1990) (Appendice C) sono accettabili per il trattamento delle carni per prevenire la trichinellosi umana. In assenza di sistemi di controllo e monitoraggio della temperatura ottimale e del tempo, il personale addetto e i consumatori di carne devono controllare il colore e la struttura della carne durante il processo di cottura. Un cambio di colore dal rosa a completamente grigio ed un cambio della struttura tale che le fibre muscolari siano facilmente separabili le une dalle altre, indicano che la carne è stata resa sicura per essere consumata. (Come nota di precauzione, la preparazione di carne sotto condizioni di controllo imprecise creano opportunità di errore. Il cambio di colore è solo un indicatore generale di sicurezza). 2.2 Il congelamento per inattivare Trichinella Nel momento in cui è disponibile un appropriata attrezzatura per monitorare i tempi e le combinazioni di temperatura, le linee guida sulla cottura del codice del Regolamento Federale del Dipartimento di Agricoltura degli Stati Uniti (1990) (Appendice C) sono accettabili per il trattamento delle carni per prevenire la trichinellosi umana. In assenza di sistemi per il controllo e monitoraggio delle giuste temperature e del tempo, i produttori ed i consumatori di carne devono assicurarsi che i tagli di carne fino a 15 cm di spessore siano congelati (almeno a 15 C) per non meno di 3 settimane e che i tagli di carne fino a spessori di 69 cm siano congelati (almeno a 15 C) per non meno di 4 settimane. I requisiti per il congelamento vanno applicati alle sole carni suine ed equine, visto che le carni di animali selvatici spesso contengono ceppi di Trichinella resistenti al congelamento che pongono rischi di sanità pubblica anche dopo mesi od anni di congelamento. Sebbene le specie di Trichinella resistenti al congelamento hanno una bassa infettività per i

8 suini, queste infezioni non possono essere ignorate nelle aree dove queste specie del parassita sono endemiche (es. latitudini nordiche). 2.3 L irradiazione per inattivare Trichinella L ITC considera l irradiazione, a livelli dimostrati di inattivare Trichinella (0.3 kgy), un metodo accettabile per rendere le carni sicure per l alimentazione umana in quei paesi dove l irradiazione dei cibi è permessa. L irradiazione viene raccomandata solamente per cibo confezionato. 2.4 La conservazione di cibo per inattivare Trichinella I processi di affumicatura e salatura non sono raccomandati per il controllo di Trichinella nelle carni di suini, cavalli o animali selvatici. Benché singoli studi di validazione hanno mostrato che diverse combinazioni di sale, temperatura, e tempi di essiccamento inattivano Trichinella, i metodi di affumicatura e la salatura sono difficili da controllare con sicurezza. La salatura dovrebbe essere utilizzata solamente dopo approfonditi studi di validazione e con rigorosi processi di controllo. L ITC raccomanda nella preparazione di prodotti affumicati o salati di utilizzare esclusivamente carni ispezionate o certificate libere da Trichinella. 2.5 Educazione del consumatore In tutte le aree dove i metodi di controllo di Trichinella non sono stati pienamente implementati, i consumatori dovrebbero essere adeguatamente informati del rischio dalle autorità sanitarie, e istruiti sui metodi più opportuni di preparazione delle carni. Metodi accettabili per la preparazione di carne destinata al consumo che potrebbero essere a rischio per la sanità pubblica includono: - cottura con una temperatura interna di 71 C (160 F). - congelamento (-15 C o meno) per tre settimane (per tagli fino a 15 cm di spessore) e congelamento (-15 C o meno) per quattro settimane (per tagli fino a 69 cm di spessore). Nelle aree dove sono endemici ceppi di Trichinella resistenti al congelamento, i consumatori devono essere informati che il congelamento non è raccomandato. Metodi non considerati sicuri per la preparazione delle carni includono: - cottura mediante forno a microonde, - processi di affumicatura, salatura, o essiccamento. L educazione dei cacciatori per la corretta preparazione delle carni di animali selvatici dovrebbe seguire le stesse linee guida di quella per i consumatori. Particolari precauzioni devono essere impartite per la presenza nelle carni di animali selvatici di larve di Trichinella resistenti al congelamento. In qualsiasi caso, l ITC raccomanda precauzione nel consumo di prodotti carnei crudi (maiale, cavallo, animali selvatici). 3. Controllo negli allevamenti La trasmissione di Trichinella al bestiame domestico è limitata a pochi rischi che includono il nutrire gli animali con scarti e prodotti crudi o carcasse di animali o

9 l esposizione a roditori infetti o ad animali selvatici. I sistemi moderni di produzione dei suini riducono o eliminano il rischio di infezione da Trichinella nei suini ed i test eseguiti sui singoli animali allevati in queste condizioni, potrebbero essere eliminati. Ci sono dei requisiti minimi che devono essere soddisfatti per considerare l allevamento di bestiame privo da Trichinella 2. Questi requisiti gestionali sono riassunti come segue: 3.1 Suini requisiti per la produzione di maiali privi di Trichinella Barriere architettoniche ed ambientali - I fabbricati per suini devono essere costruiti per prevenire l ingresso di roditori nelle strutture. - Le condutture, come quelle utilizzate per la ventilazione d aria o per il trasporto d acqua, devono essere coperte con filo metallico (1 cm di apertura o meno). - Le aree in un raggio di 100 m dalle porcilaie devono essere prive di rifiuti e rifugi per roditori. - Un perimetro di 2 m di ghiaia o vegetazione falciata a una altezza di non più di 10 cm deve essere mantenuta intorno a tutte le strutture della porcilaia Alimentazione ed immagazzinamento di cibo - Il cibo deve essere conservato dentro silos che non permettano l entrata ai roditori. - Il cibo acquistato deve provenire da un impianto approvato che produce cibo secondo le buone pratiche di produzione. - Scarti di cibo, contenenti carne, devono essere cotti per inattivare la Trichinella in accordo con le leggi sugli scarti di cibo Controllo dei roditori - Un programma documentato per il controllo dei roditori deve essere attuato sistematicamente da una ditta specializzata nel controllo di nocivi (Appendice C). - La ditta specializzata nel controllo dei nocivi non deve rivelare la presenza di roditori (tane, tracce, feci) Igiene dell allevamento - Gli animali morti devono essere eliminati entro 24 h attraverso appropriate modalità sanitarie. Nessuna discarica deve essere presente nel raggio di 2 km dall allevamento. 2 Dove indagini statisticamente valide sono state condotte, chiaramente mostrano che la prevalenza di Trichinella nelle popolazioni di predatori (lupi, volpi, gatti) è di 0.1% o meno con un livello di confidenza del 95%, le barriere biologiche non sono richieste per la produzione di suini privi di Trichinella. Tuttavia, tutti gli altri requisiti, includendo programmi di controllo per roditori, dovrebbero continuare.

10 3.1.5 Nuovi animali - I nuovi animali devono nascere negli allevamenti privi di Trichinella, o - I nuovi animali devono essere tenuti in quarantena e devono essere analizzati sierologicamente dopo 3 settimane per assicurare l assenza di anticorpi specifici anti-trichinella. 3.2 Requisiti per la produzione di carni equine prive di Trichinella A causa della mancanza di conoscenze concernenti la trasmissione di Trichinella agli equini e più in generale sull allevamento degli equini, non è possibile allevare i cavalli garantiti liberi dall infezioni. L ITC raccomanda che studi epidemiologici vengano condotti nei paesi di origine degli equini destinati al consumo umano. 3.3 Certificazione di produzione di bestiame esente da Trichinella I programmi che permettono di certificare i suini come privi di Trichinella, basati su buone pratiche di gestione che eliminano il rischio di esposizione, devono essere organizzati amministrativamente per permettere di avere un opportuna documentazione di allevamenti certificati. Questa gestione deve eseguire le seguenti funzioni: - Sviluppare un sistema di documentazione della procedura di produzione di carni prive di Trichinella che faccia riferimento a tutti i punti trattati nella Sezione Emissione di certificazioni e mantenimento della documentazione degli allevamenti certificati. - Periodicamente, condurre verifiche random delle procedure certificate per assicurare l integrità del sistema. - Condurre periodicamente test sierologici su suini provenienti da allevamenti certificati per verificare l assenza di infezione. I suini allevati in assenza delle norme per una produzione esente da Trichinella, devono essere saggiati individualmente con i metodi approvati (Sezione 1.1). 4 Licenze regionali per infezioni da Trichinella nei suini L ITC non appoggia nessun programma su base regionale, statale o nazionale (es. OIE International Animal Health Code, Articolo ) che assicuri suini privi di Trichinella. L ITC considera gli allevamenti privi di Trichinella come base per costituire regioni prive di Trichinella. 5 Raccomandazioni legislative L ITC raccomanda a tutte le nazioni di rendere illegale la distribuzione di carni contaminate da Trichinella, includendo carne di suino, cavallo e di animali selvatici. Inoltre i cacciatori devono essere educati e resi responsabili per la sicurezza della carne che distribuiscono.

11 E fortemente raccomandato che le infezioni da Trichinella negli animali da reddito e nei selvatici destinati al consumo umano siano documentate su base nazionale dalle organizzazioni veterinarie nazionali e di sanità pubblica che successivamente comunicheranno la casistica su base annua all Ufficio internazionale delle Epizoozie (2001). Si raccomanda che la trichinellosi umana venga riportata a livello nazionale dalle organizzazioni di sanità pubblica. L ITC raccomanda che a livello di ogni nazione, i suini e gli equini siano muniti di un sistema di identificazione (con contrassegno individuale). Questo sistema di identificazione deve permettere di risalire dai singoli animali fino al loro punto di origine. L identificazione faciliterà le indagini epidemiologiche e il compimento di azioni correttive. Appendice A. Metodo di digestione di un pool di campioni per la ricerca di Trichinella A.1 Introduzione La digestione dei muscoli in soluzione acida con pepsina, rilascia le larve vive di Trichinella dalle cisti muscolari. Differenti procedure di digestione sono state descritte nella letteratura scientifica (vedi EEC, 1984; Gajadhar et al., 1996; Gamble, 1998; Tret Yakov, 1972). Il seguente commento delinea a grandi linee un protocollo generico che può essere utilizzato per individuare l infezione da Trichinella nelle carni. Qualsiasi metodo utilizzato per l individuazione di Trichinella nelle carni deve essere validato correttamente prima del suo utilizzo con campioni positivi e negativi e successivamente monitorato periodicamente per valutare la sua efficacia utilizzando campioni di referenza (vedi Appendice B). A.2 Raccolta dei campioni I campioni muscolari devono essere raccolti dai siti di predilezione delle specie saggiate. Questi siti includono i muscoli del diaframma o lingua per i suini ed i muscoli della lingua e del massetere per gli equini. Se i siti di predilezione per la Trichinella non dovessero essere conosciuti per la specie che si sta esaminando, è raccomandato l utilizzo dei muscoli della lingua e del diaframma. La dimensione del campione deve essere selezionato per andare in contro alla sensibilità richiesta dai test; singoli campioni di 100 g devono essere presi da ogni singolo animale, o campioni multipli devono essere raccolti da un numero di animali per raggiungere 100 g di tessuto. La sensibilità del test è stata considerata come segue: campioni di 1 g permettono di rivelare infezioni 3 LPG; campioni di 3 g infezioni 1.5 LPG; campioni di 5 g infezioni 1 LPG. Ai fini della sanità pubblica, i test su campioni di 1 g di suino (diaframma o lingua) hanno mostrato essere efficaci nel ridurre l incidenza della trichinellosi umana in alcune nazioni. Tuttavia, quando la carne non viene destinata a completa cottura od altri processi post-macellazione, si raccomanda di effettuare un test su un campione sufficiente a determinare livelli di infezione di 1 LPG di tessuto (es., un minimo di 5 g di campione).

12 A.3 Preparazione del campione I campioni devono essere ripuliti da tutto il grasso e tendini poiché questi tessuti sono indigeribili e non contengono larve di Trichinella. I campioni devono essere quindi frullati, macinati o macerati in altra maniera per facilitare la digestione; l utilizzo di un frullatore è il metodo di scelta. Per preparare il campione mediante il frullatore, fino a 100 g di tessuto vengono mescolati con un volume uguale di acqua di rubinetto acidificata (1% HCl) e sottomessi a vari e brevi (5-10s) rotture del tessuto in un frullatore. Miscelazioni troppo brevi porteranno a una digestione insufficiente, mentre troppo lunghe porteranno alla rottura delle larve nel muscolo. Il frullare deve continuare fino a quando non rimane alcun pezzo di carne. La preparazione del campione utilizzando un tritacarne viene considerato un metodo accettabile se si utilizzano pori del diametro non superiore ai 3 mm. A.4 Digestione artificiale 100 g di tessuto devono essere digeriti in un volume totale di 2-3l di una soluzione di pepsina acidificata utilizzando un metodo validato. Un rapporto di 1:30 tra carne e soluzione digestiva (per esempio, 100g di tessuto in 3 l di fluido digestivo) facilita una rapida e completa digestione. Attenzione deve essere posta nel trasferimento del campione nella sua interezza dal frullatore o macina carne al contenitore di 3-4l. Acqua di rubinetto preriscaldata (45±2 C) e acidificata ( % HCl) deve essere utilizzata per sciacquare completamente tutte le parti del frullatore o del macina carne. Dopo, acqua di rubinetto acidificata e pre-riscalcata deve essere aggiunta per raggiungere il volume appropriato (2-3 l). La pepsina (1: NSF) deve essere addizionata al campione con acqua acidificata con un rapporto di % peso/volume. Nel caso in cui il campione venga preparato con il frullatore, tutta la pepsina deve essere aggiunta al campione e brevemente omogenata per assicurare una dispersione uniforme. La soluzione campione/pepsina deve essere poi posta in un contenitore da 3-4l con acqua di rubinetto acidificata come descritto sopra. Per quanto concerne la digestione, la soluzione campione/pepsina acidificata, 2-3l di volume contenuti in un contenitore di 3-4l, deve essere coperta con un foglio di alluminio per prevenire la fuoriuscita della soluzione, e mescolata vigorosamente su un agitatore magnetico (utilizzando una magnete da 8-10 cm), o con un apparecchiatura alternativa per il mescolamento, per un minimo di 30 min (tempi più lunghi possono essere necessari per completare la digestione). La temperatura durante il processo di digestione deve essere mantenuta a (45±2 C) e monitorata con grande attenzione, utilizzando un termometro o un altra apparecchiatura per registrare le temperature. La temperatura viene controllata in modo migliore conducendo l intero processo in un incubatrice od in una stanza riscaldata; tuttavia, un piatto magnetico riscaldato o bagnomaria sono sostituti accettabili se la temperatura può essere mantenuta all interno dei limiti prescritti. La digestione è conclusa solo quando i pezzi intatti di carne non sono più visibili nella soluzione digestiva.

13 A.5 Raccolta delle larve Alla conclusione del processo di digestione, l intero miscuglio è filtrato dal contenitore attraverso un setaccio ( µm di maglia) dentro un imbuto di dimensioni adeguate (2-4l), munito di un tubo di plastica. Il contenitore, e il setaccio devono essere sciacquati con un volume addizionale (100 ml) di acqua di rubinetto. Sul setaccio non si devono vedere pezzi intatti di carne. In tal caso, i frammenti intatti di carne devono essere posti nel liquido digestivo fresco per un ulteriore processamento. Il digerito si fa sedimentare nell imbuto per 30 min. Differenti opzioni possono essere utilizzate per la chiarificazione del campione. Un volume di 40 ml di fluido può essere tolto dall imbuto e inserito direttamente dentro un tubo da centrifuga da 50 ml. Il contenuto di questo tubo deve sedimentare per altri 10 minuti, dopo i quali si aspira il surnatante dalla superficie lasciando circa 10 ml. Se i restanti 10 ml appaiono densi si deve aggiungere al sedimento 30 ml di acqua calda di rubinetto (37 C) e il procedimento di sedimentazione e aspirazione deve essere ripetuto fino a che il campione non risulti chiaro. Gli ultimi 10 ml chiarificati vengono utilizzati per la ricerca di larve di Trichinella. Un metodo alternativo per la chiarificazione del campione è l utilizzo per una seconda volta di un imbuto (Gajadhar et al., 1996). In questa procedura, circa 125 ml prelevati dal primo imbuto sono fatti defluire in un secondo imbuto da 500 ml ed il volume viene portato a 500 ml con acqua di rubinetto a temperatura ambiente. La soluzione viene fatta sedimentare per altri 10 minuti, dopo i quali un campione di ml viene recuperato per la conta delle larve. In entrambe le procedure è importante che il fluido sia recuperato dagli imbuti aprendo completamente il rubinetto di arresto. Un apertura parziale può portare a trattenere le larve nel tubo dell imbuto. A.6 Conta delle larve Ai fini della conta delle larve, il sedimento chiarificato deve essere versato in una capsula di Petri con griglia ed esaminato per la presenza di larve di Trichinella con un microscopio da dissezione (15-40x ingrandimenti). Il fluido deve essere chiaro a sufficienza affinché si possa leggere un giornale attraverso di esso. Se ciò non accadesse, sono necessarie nuove chiarificazioni del campione. Quando le larve vengono trovate nel campione di liquido digerito, l intera procedura deve essere ripetuta utilizzando pool formati da un numero minore di campioni o campioni singoli, sino all identificazione della carcassa di provenienza. Appendice B. Programma di assicurazione di qualità per i test su Trichinella B.1 Introduzione Mentre l accuratezza nel metodo di scoperta microbica dipende dalla consistenza della sensibilità e specificità, l attendibilità del metodo richiede l utilizzo di un programma di assicurazione di qualità. Un programma di assicurazione di qualità fornisce la sicurezza che il metodo utilizzato sia sempre seguito sotto condizioni

14 definite da analisti competenti, e che i risultati siano ripetibili e sicuri in accordo con i livelli predeterminati di sensibilità e specificità. I programmi di assicurazione di qualità devono essere utilizzati per testare il pericolo microbico, per assicurare il benessere pubblico e per facilitare il commercio internazionale. L ISO Guide 25 specifica i dettagli che possono essere utilizzati nello sviluppo di un programma di assicurazione di qualità per test diagnostici o metodi di analisi. La Guida è stata utilizzata per sviluppare le seguenti linee guida per un programma di assicurazione di qualità per i laboratori deputati all analisi della carne per Trichinella: B.2 Manuale di assicurazione di qualità Un programma di assicurazione di qualità basato sull ISO Guide 25, o uno standard simile di qualità accettato internazionalmente, viene richiesto per documentare che gli analisti eseguano correttamente il metodo sotto condizioni controllate, per quindi produrre risultati sicuri e consistenti. Il sistema di assicurazione di qualità deve essere descritto in un manuale di assicurazione di qualità o su documenti similari che forniscano informazioni sulla struttura organizzativa e descriva le qualifiche del gruppo, le richieste di formazione del personale, i meccanismi di monitoraggio per l aderenza ai protocolli scritti, i criteri per la certificazione degli analisti, il mantenimento delle apparecchiature, le denunce, la conservazione dei documenti, il trattamento delle modifiche, le azioni correttive, il trattamento dei reclami, della documentazioni e delle verifiche. Altri argomenti appropriati per un manuale di AQ per i test sulla Trichinella includono le procedure di campionamento alla macellazione, l identificazione del campione e dell animale, le procedure per risalire alle carcasse di origine ed i criteri per accettare/rigettare il campione. B.3 Attrezzature appropriate di laboratorio Un attrezzatura appropriata di laboratorio fornisce un ambiente controllato per l analisi e assicura il benessere e la sicurezza delle persone che lavorano nel laboratorio. Almeno una porta deve essere utilizzata per separare le aree comuni del laboratorio che devono avere un adeguato spazio sul bancone, un illuminazione adeguata, acqua corrente calda e fredda, un lavandino appropriato per la vetreria utilizzata nella procedura, superfici impermeabili ai comuni disinfettanti, una cappa chimica, una ventilazione adeguata, un sistema di riscaldamento e raffreddamento in grado di mantenere una temperatura di lavoro confortevole, una appropriata cartellonistica, se necessario un programma per il controllo degli animali nocivi, un accesso immediato a docce di emergenza e ad una cassetta di pronto soccorso, gabinetti per il personale e indumenti adeguati per il laboratorio (guanti, occhiali di protezione e camici di laboratorio). B.4 Procedure validate L accuratezza dei metodi di individuazione deve essere definita attraverso dati ricavati scientificamente con un supporto statistico mediante l utilizzo di campioni ottenuti da animali riconosciuti come infetti e non infetti. Il confronto

15 dei nuovi metodi con metodi esistenti non validati precedentemente in questa maniera non viene considerato un metodo di validazione accettabile. L adeguata precisione del metodo (ripetibilità) deve essere definita chiaramente e successivamente dimostrata scientificamente. B.5 Protocollo standardizzato Un protocollo standardizzato, in concomitanza con un adeguato addestramento è necessario per assicurare risultati accurati e ripetibili che possano essere effettuati da ogni laboratorio eseguendo il metodo di diagnosi. Un protocollo per il metodo validato deve essere scritto chiaramente, includendo una descrizione dettagliata di tutte le attrezzature, i reagenti e le procedure necessarie. Il protocollo deve essere eseguito esattamente come scritto, includendo punti di controllo critici (CCPs). Le CCPs sono definite come quelle procedure, attrezzature o reagenti che possono influire negativamente sui risultati del metodo di ricerca se non utilizzati esattamente come definiti nel protocollo. Ogni cambiamento fatto al protocollo standardizzato deve essere supportato da test statistici validi eseguiti in parallelo per assicurare che i risultati non vengano influenzati negativamente. B.6 Istruzione e certificazione degli analisti Un istruzione adeguata, in congiunzione con un protocollo standardizzato, è necessaria per assicurare che risultati accurati e ripetibili possano essere realizzati da ogni laboratorio che esegue il metodo di analisi. Un programma documentato d istruzione per analisti deve essere organizzato. Questo programma deve coprire tutti gli aspetti del metodo includendo la procedura, i requisiti pre e post-analisi, l analisi dei requisiti di competenza, le responsabilità, la biologia dell organismo e la sicurezza. Il corso di insegnamento deve essere tenuto da personale qualificato in un laboratorio con le opportune strutture e gli analisti che seguono il corso devono dimostrare competenza attraverso esami scritti e test con campioni sconosciuti con esito positivo durante il periodo di insegnamento e nuovamente nel proprio laboratorio. B.7 Programma di competenza per analisti certificati Per dimostrare continuamente le proprie competenze, gli analisti certificati devono mantenere la propria certificazione analizzando una serie di campioni sconosciuti preparati da un laboratorio di riferimento o attraverso la partecipazione ad un programma di scambio delle competenze quattro volte l anno. Un protocollo standardizzato deve essere utilizzato per preparare e distribuire i campioni. Test paralleli per un sottoinsieme di ogni campione devono essere forniti da parte del laboratorio fornitore contemporaneamente ai laboratori partecipanti che saggiano i loro campioni di competenza. Le linee guida per la valutazione dei risultati dei campioni di competenza sono basati su un metodo conosciuto supportato da dati scientificamente provati utilizzando i campioni di competenza ed il metodo utilizzato. Gli analisti che analizzano con successo i loro campioni di competenza mantengono la certificazione. Un fallimento potrebbe richiedere di ritestare un seconda serie di campioni, la de-certificazione, il ri-

16 addestramento o una combinazione di questi e regole chiaramente definite per rendere queste decisioni stabilite e documentate in anticipo. Questo programma sui campioni di pertinenza può essere adattato all uso per mettere in pratica e/o validare un nuovo metodo, con un ring test tra un gruppo di laboratori qualificati. Appendice C. Metodi per l inattivazione con la cottura di larve di Trichinella spiralis nei suini 1. Tutte le parti dei tessuti muscolari di suino devono essere cotte in accordo con le combinazioni di tempi e temperature riportati in Tabella I tempi e le temperature devono essere monitorate da uno strumento di registrazione calibrato. 3. Il tempo per far raggiungere al prodotto temperature da 24.5 a 49 C ( F) non dovrebbero eccedere le 2 h a meno che il prodotto non sia affumicato o fatto fermentare. 4. Il tempo, in combinazione con le temperature di 58,9-62,2 C ( F), non necessita di essere monitorato se lo spessore minimo del prodotto è di 5 cm (2 in) e la refrigerazione del prodotto non inizia entro 5 minuti del raggiungimento dei 58.9 C (138 F). 5. Devono essere adottate procedure che assicurino la giusta cottura di tutte le parti del prodotto. E importante che salsicce, coscio di maiale e altri prodotti rimangano interamente sommersi durante la cottura in acqua. Inoltre, i pezzi più grandi e quelli che sono circondati da altri pezzi di carne, nonché i pezzi posti nella parte più fredda dell armadio di riscaldamento, siano inclusi nei test sulla temperatura. Tabella 1. Temperatura minima interna Tempo minimo (h) ( C) ( F) h h h h h min min min min min min min istante Appendice D. Metodi per l inattivazione con il congelamento di larve di Trichinella spiralis nei suini In ogni stadio della preparazione e dopo il raffreddamento preparatorio che non sia sotto i 16 C (40 F) o il congelamento preparatorio, tutte le parti del tessuto

17 muscolare del suino o i prodotti contenenti tali tessuti, devono essere soggetti ininterrottamente ad una temperatura non più alta di quelle specificate nella Tabella 2, essendo la durata di tale refrigerazione a tali temperature dipendente dallo spessore della carne o dalle dimensioni interne del recipiente. 5. Il gruppo 1 comprende prodotti confezionati in pezzi separati non eccedenti lo spessore di 15 cm (6 in), o sistemati su rastrelliere separate con strati aventi profondità non superiori ai 15 cm (6 in), o conservati in casse o scatole aventi profondità non superiori ai 15 cm (6 in), o conservate come blocchi solidi congelati aventi spessori non superiori ai 15 cm (6 in). 2. Il gruppo 2 comprende prodotti in pezzi o strati o all interno di contenitori il cui spessore eccede i 15 cm (6 in), ma non i 69 cm (27 in), e prodotti in contenitori compresi fusti, botti, barilotti, e cartoni aventi uno spessore inferiore ai 69 cm (27 in). 3. Il prodotto che subisce tale refrigerazione o i loro contenitori devono essere distanziati per assicurare un buona circolazione nel freezer tra i pezzi di carne, gli strati, i blocchi, i barili ed i fusti in modo che la temperatura della carne dovunque sia prontamente ridotta a seconda dei casi a non più di -20,6 C (-5 F), -23,3 C (- 10 F) o 29 C (-20 F). 6. Al posto dei metodi prescritti in Tabella 2, il trattamento può consistere nel congelamento commerciale a secco o congelamento controllato, al centro del pezzo di carne, in accordo con i tempi e temperature specificate in Tabella Le stanze o i compartimenti contenenti prodotti sotto congelamento devono essere equipaggiati con termometri precisi posti sopra il livello più alto dove il prodotto sottoposto al trattamento viene conservato e lontani da serpentine refrigeranti. Tabella 2. Tempo di congelamento richiesto alle temperature indicate Temperatura Gruppo 1 Gruppo 2 C F Tabella 3. Periodi alternativi di congelamento alle temperature indicate Temperature minime interne Tempo minimo ( C) ( F) h h h h h h h min

18 Appendice E. Identificazione delle specie/genotipi di larve di Trichinella La conoscenza delle specie o genotipi di Trichinella presente negli animali domestici o selvatici è spesso utile per capire l epidemiologia del parassita ed i rischi per gli uomini. La conoscenza delle specie o genotipi di Trichinella che causa la malattie umana è utile per determinare le strategie di trattamento. L individuazione della specie o genotipo di Trichinella è eseguita presso il Centro di Referenza Internazionale di Roma, Italia. I campioni possono essere inviati per l identificazione della specie o del genotipo utilizzando le seguenti linee guida: E.1 Invio di carne fresca Il campione(i) muscolare di animali domestici o selvatici con larve di Trichinella, o da biopsia umana, devono essere impacchettati in diverse buste di plastica, preferibilmente sotto vuoto o in provette con tappo a vite e sigillate con parafilm. I campioni devono essere impacchettati in scatole di polistirolo per l isolamento e spediti tramite corriere all indirizzo sotto riportato. E.2 Invio di carne congelata I campioni congelati devono essere spediti in ghiaccio secco in contenitori di polistirolo per assicurare che il tessuto non si scongeli durante la spedizione effettuata mediante un corriere all indirizzo sotto riportato. E.3 Invio di larve in alcool etilico Le larve muscolari raccolte dopo digestione artificiale devono essere lavate tre volte in acqua distillata e conservate in alcool etilico in provette coniche di plastica. Devono essere raccolte e conservate solo le larve muscolari vitali. Le provette devono essere chiuse con parafilm, impacchettate per evitare perdite o rotture e spedite con un corriere all indirizzo sotto riportato. I campioni devono essere spediti a: International Trichinella Reference Centre, Laboratory of Parasitology, Istituto Superiore di Sanità, viale Regina Elena 299, Roma, Italia. Tel.: ; fax: ; e.mail: Bibliografia Code of Federal Regulations, Animals and Animal Products, Office of the Federal Register, Government Printing Office, Washington DC. Vol. 9, pp

19 European Economic Community, Commission Directive 77/96/EEC. Off. J. Eur. Comm. 26, European Economic Community, Commission Directive 84/319/EEC. Off. J. Eur. Comm. 167, Forbes LB, Rajic A, Gajadhar AA Proficiency samples for quality assurance in Trichinella digestion tests. J. Food Prot. 61, Office International des Epizooties, International Animal Health Code. 8 th Edition, Office International des Epizooties, Paris. Gajadhar AA, Forbes LB, Rajic A, The double separatory funnel procedure for the detection of Trichinella larvae in pork. Official Protocol, Agriculture and Agri-Food Canada, Version 1.0, 14 November 1996, 18 pp. Gamble HR, Trichinellosis. In: OIE Manual of Standard for Diagnostic Tests and Vaccines, pp (Chapter 3.5.3). Tret Yakov AD (ed.), Veterinary Code of the USSR: Provisions, Guidelines, Instructions, Directions and Rules on Veterinary Matters, vol. II, Kolos, Moscow, 1972.

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