METODICHE NEL LABORATORIO CHIMICO-CLINICO

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1 METODICHE NEL LABORATORIO CHIMICO-CLINICO

2 SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO TURBIDIMETRIA/NEFELOMETRIA FLUORIMETRIA SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO FOTOMETRIA DI EMISSIONE A FIAMMA RIFLETTANZA LUMINESCENZA ELETTRODI A VETRO/IONOSELETTIVI COULOMBOMETRIA VOLTAMMETRIA ANODICA DI STRIPPING Ecc ecc ecc TECNICHE ELETTROFORETICHE TECNICHE IMMUNOCHIMICHE

3 METODI DI SEPARAZIONE Non sono di per sé delle tecniche analitiche, ma sono spesso il presupposto iniziale per l applicazione di una successiva metodica strumentale di determinazione Campione con composizione costante METODI DIRETTI di determinazione specie analitiche Se, però, c è interferenza di altre sostanze, o il campione non è adeguato al procedimento diretto Metodi di separazione

4 METODI DI SEPARAZIONE DIALISI Passaggio di molecole di piccole dimensioni attraverso una membrana permeabile per queste sostanze, ma non per le macromolecole

5 METODI DI SEPARAZIONE PIERCE

6 METODI DI SEPARAZIONE ULTRAFILTRAZIONE Utilizzo di membrane semipermeabili (o permeabili selettivamente) che consentono il passaggio, durante centrifugazione, solo ad acqua e soluti a basso peso molecolare, trattenendo quelli di dimensioni maggiori ( CUT- OFF ) Utile metodo per CONCENTRARE liquidi biologici (urine, liquor, ecc), per poter successivamente effettuare analisi elettroforetiche, dosaggi, ecc.

7 FILTRAZIONE METODI DI SEPARAZIONE Consente l allontanamento di una sostanza insolubile da un mezzo liquido, per procedere al recupero della fase solida o di quella liquida o di entrambe Uso di carta da filtro Filtrazione sotto vuoto (con filtro Buechner) Filtrazione a permeabilità selettiva (sia sotto vuoto o con leggera pressione sul filtro) Con filtri a porosità variabile si possono selezionare i componenti di una sospensione in funzione delle dimensioni (virus, batteri, cellule) o del peso molecolare.

8 CENTRIFUGAZIONE METODI DI SEPARAZIONE In un campo centrifugo applicato (maggiore del campo gravitazionale terrestre!!), le particelle possono essere separate poiché sedimentano con velocità diversa a seconda delle diverse caratteristiche di densità, dimensione e forma. In campo chimico-clinico, la centrifugazione è impiegata soprattutto per la separazione di solidi da liquidi (es. parte corpuscolata del sangue dal plasma, cellule o microcristalli delle urine, ecc.)

9 METODI DI SEPARAZIONE La velocità di sedimentazione dipende dal campo centrifugo applicato (G) RCF = x 10-5 (rpm) 2 r ULTRACENTRIFUGAZIONE: la sedimentazione di molecole proteiche o di acidi nucleici richiede l applicazione di una forza centrifuga molto elevata (da a g!!!!!)

10 METODI DI SEPARAZIONE TIPI DI CENTRIFUGHE PICCOLE CENTRIFUGHE DA BANCO (fino a g)(sedimentazione rapida campioni di sangue) CENTRIFUGHE REFRIGERATE A GRANDE CAPACITA (fino a g, da bilanciare accuratamente; per eritrociti, nuclei, cloroplasti ecc) CENTRIFUGHE REFRIGERATE AD ALTA VELOCITA (fino a g, raccolta di microorganismi, organuli cellulari e proteine dopo precipitazione con ammonio solfato) ULTRACENTRIFUGHE (ANALITICHE O PREPARATIVE) (fino a g, per deproteinizzazione dei fluidi, separazione lipoproteine dal plasma ecc.)

11 METODI DI SEPARAZIONE

12 METODI DI SEPARAZIONE

13 METODI DI SEPARAZIONE GEL FILTRAZIONE Passaggio della miscela attraverso un materiale poroso, capace di trattenere molecole a basso peso: ottimo metodo per il desalting o per separare molecole con grande differenza di peso molecolare (lo ritroveremo nella cromatografia) Il limite di esclusione è il peso molecolare della molecola incapace di penetrare nei pori del gel, per cui ne viene esclusa. L intervallo di frazionamento è l intervallo dei pesi molecolari delle molecole frazionate. Il limite superiore è costituito proprio dal limite di esclusione.

14 METODI CROMATOGRAFICI Metodica che permette di separare i costituenti di un miscuglio omogeneo in base alla loro differente ripartizione tra FASE FISSA, o stazionaria, e FASE MOBILE A seconda dei principi chimico-fisici che determinano la ripartizione tra le due fasi, si può avere cromatografia: di adsorbimento di ripartizione a scambio ionico per esclusione o gel filtrazione di affinità In tutti i casi, sono presenti una fase fissa, che può essere solida o liquida, ed una fase mobile, che può essere liquida o gassosa. HPLC, per separazioni e misure quantitative sia di miscele di sostanze naturali (aminoacidi, porfirine) che di farmaci e droghe

15 CROMATOGRAFIA METODI CROMATOGRAFICI COLONNA PLANARE GC SFC TLC Carta Elettroforesi Scambio ionico LC Gel filtrazione Ripartizione CCE Adsorbimento Ripartizione Fase Normale (fase stazionaria polare fase mobile non-polare) Fase inversa (fase stazionaria non-polare fase mobile polare)

16 METODI CROMATOGRAFICI

17 METODI CROMATOGRAFICI Applicazioni in chimica clinica Le tecniche cromatografiche di HPLC e su carta hanno consentito a tutti i laboratori di rendere agevole lo studio di aminoacidurie e dei conseguenti errori metabolici riguardanti gli aminoacidi; la tecnica su strato sottile ha reso, poi, ancora più agevole la ricerca qualitativa e semiquantitativa degli aminoacidi liberi nei liquidi biologici (siero e urine) Con l HPLC si possono ottenere in tempi brevi (meno di un ora), ed in maniera del tutto riproducibile, separazioni quantitative degli aminoacidi su siero e urine:

18 METODI CROMATOGRAFICI Diventa così agevole la diagnosi di importanti malattie metaboliche come: fenilchetonuria alcaptonuria cistinuria omocistinuria leucinosi argininemia tirosinemia iperprolinemia ipervalinemia iperlisinemia citrullinemia Di interesse è l analisi cromatografica (su carta o su strato sottile) dei polipeptidi ottenuti per idrolisi enzimatica delle emoglobine dopo la separazione elettroforetica: si riescono a caratterizzare, così, varie emoglobine patologiche. La cromatografia su strato sottile, da sola o accoppiata alla gascromatografia, si è rivelata preziosa nello studio degli ormoni steroidei del sangue o delle urine, di molti farmaci e di loro metaboliti (alcaloidi cardioattivi, antibiotici, ecc), di droghe (barbiturici, oppiacei, amfetamine, ecc), di lipidi e fosfolipidi (ad es. nel liquido amniotico, per valutare la maturità respiratoria del feto)

19 METODI CROMATOGRAFICI

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