METODICHE NEL LABORATORIO CHIMICO-CLINICO

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Simona Villani
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1 METODICHE NEL LABORATORIO CHIMICO-CLINICO

2 SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO TURBIDIMETRIA/NEFELOMETRIA FLUORIMETRIA SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO FOTOMETRIA DI EMISSIONE A FIAMMA RIFLETTANZA LUMINESCENZA ELETTRODI A VETRO/IONOSELETTIVI COULOMBOMETRIA VOLTAMMETRIA ANODICA DI STRIPPING Ecc ecc ecc TECNICHE ELETTROFORETICHE TECNICHE IMMUNOCHIMICHE

RIFLETTANZA LUMINESCENZA ELETTRODI A VETRO/IONOSELETTIVI COULOMBOMETRIA

3 METODI DI SEPARAZIONE Non sono di per sé delle tecniche analitiche, ma sono spesso il presupposto iniziale per l applicazione di una successiva metodica strumentale di determinazione Campione con composizione costante METODI DIRETTI di determinazione specie analitiche Se, però, c è interferenza di altre sostanze, o il campione non è adeguato al procedimento diretto Metodi di separazione

composizione costante METODI DIRETTI di determinazione specie analitiche Se, però, c è

4 METODI DI SEPARAZIONE DIALISI Passaggio di molecole di piccole dimensioni attraverso una membrana permeabile per queste sostanze, ma non per le macromolecole

5 METODI DI SEPARAZIONE PIERCE

6 METODI DI SEPARAZIONE ULTRAFILTRAZIONE Utilizzo di membrane semipermeabili (o permeabili selettivamente) che consentono il passaggio, durante centrifugazione, solo ad acqua e soluti a basso peso molecolare, trattenendo quelli di dimensioni maggiori ( CUT- OFF ) Utile metodo per CONCENTRARE liquidi biologici (urine, liquor, ecc), per poter successivamente effettuare analisi elettroforetiche, dosaggi, ecc.

peso molecolare, trattenendo quelli di dimensioni maggiori ( CUT- OFF ) Utile metodo per CONCENTRARE

7 FILTRAZIONE METODI DI SEPARAZIONE Consente l allontanamento di una sostanza insolubile da un mezzo liquido, per procedere al recupero della fase solida o di quella liquida o di entrambe Uso di carta da filtro Filtrazione sotto vuoto (con filtro Buechner) Filtrazione a permeabilità selettiva (sia sotto vuoto o con leggera pressione sul filtro) Con filtri a porosità variabile si possono selezionare i componenti di una sospensione in funzione delle dimensioni (virus, batteri, cellule) o del peso molecolare.

Buechner) Filtrazione a permeabilità selettiva (sia sotto vuoto o con leggera pressione sul filtro) Con filtri a porosità

8 CENTRIFUGAZIONE METODI DI SEPARAZIONE In un campo centrifugo applicato (maggiore del campo gravitazionale terrestre!!), le particelle possono essere separate poiché sedimentano con velocità diversa a seconda delle diverse caratteristiche di densità, dimensione e forma. In campo chimico-clinico, la centrifugazione è impiegata soprattutto per la separazione di solidi da liquidi (es. parte corpuscolata del sangue dal plasma, cellule o microcristalli delle urine, ecc.)

caratteristiche di densità, dimensione e forma.

9 METODI DI SEPARAZIONE La velocità di sedimentazione dipende dal campo centrifugo applicato (G) RCF = x 10-5 (rpm) 2 r ULTRACENTRIFUGAZIONE: la sedimentazione di molecole proteiche o di acidi nucleici richiede l applicazione di una forza centrifuga molto elevata (da a g!!!!!)

118 x 10-5 (rpm) 2 r ULTRACENTRIFUGAZIONE: la sedimentazione di molecole

10 METODI DI SEPARAZIONE TIPI DI CENTRIFUGHE PICCOLE CENTRIFUGHE DA BANCO (fino a g)(sedimentazione rapida campioni di sangue) CENTRIFUGHE REFRIGERATE A GRANDE CAPACITA (fino a g, da bilanciare accuratamente; per eritrociti, nuclei, cloroplasti ecc) CENTRIFUGHE REFRIGERATE AD ALTA VELOCITA (fino a g, raccolta di microorganismi, organuli cellulari e proteine dopo precipitazione con ammonio solfato) ULTRACENTRIFUGHE (ANALITICHE O PREPARATIVE) (fino a g, per deproteinizzazione dei fluidi, separazione lipoproteine dal plasma ecc.)

CENTRIFUGHE REFRIGERATE AD ALTA VELOCITA (fino a 60-70000 g, raccolta di microorganismi, organuli cellulari e proteine dopo precipitazione

11 METODI DI SEPARAZIONE

12 METODI DI SEPARAZIONE

13 METODI DI SEPARAZIONE GEL FILTRAZIONE Passaggio della miscela attraverso un materiale poroso, capace di trattenere molecole a basso peso: ottimo metodo per il desalting o per separare molecole con grande differenza di peso molecolare (lo ritroveremo nella cromatografia) Il limite di esclusione è il peso molecolare della molecola incapace di penetrare nei pori del gel, per cui ne viene esclusa. L intervallo di frazionamento è l intervallo dei pesi molecolari delle molecole frazionate. Il limite superiore è costituito proprio dal limite di esclusione.

limite di esclusione è il peso molecolare della molecola incapace di penetrare nei pori del gel, per cui ne viene esclusa.

14 METODI CROMATOGRAFICI Metodica che permette di separare i costituenti di un miscuglio omogeneo in base alla loro differente ripartizione tra FASE FISSA, o stazionaria, e FASE MOBILE A seconda dei principi chimico-fisici che determinano la ripartizione tra le due fasi, si può avere cromatografia: di adsorbimento di ripartizione a scambio ionico per esclusione o gel filtrazione di affinità In tutti i casi, sono presenti una fase fissa, che può essere solida o liquida, ed una fase mobile, che può essere liquida o gassosa. HPLC, per separazioni e misure quantitative sia di miscele di sostanze naturali (aminoacidi, porfirine) che di farmaci e droghe

ripartizione a scambio ionico per esclusione o gel filtrazione di affinità In tutti i casi, sono presenti una fase fissa, che può essere solida o liquida, ed una

15 CROMATOGRAFIA METODI CROMATOGRAFICI COLONNA PLANARE GC SFC TLC Carta Elettroforesi Scambio ionico LC Gel filtrazione Ripartizione CCE Adsorbimento Ripartizione Fase Normale (fase stazionaria polare fase mobile non-polare) Fase inversa (fase stazionaria non-polare fase mobile polare)

Adsorbimento Ripartizione Fase Normale (fase stazionaria polare fase

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17 METODI CROMATOGRAFICI Applicazioni in chimica clinica Le tecniche cromatografiche di HPLC e su carta hanno consentito a tutti i laboratori di rendere agevole lo studio di aminoacidurie e dei conseguenti errori metabolici riguardanti gli aminoacidi; la tecnica su strato sottile ha reso, poi, ancora più agevole la ricerca qualitativa e semiquantitativa degli aminoacidi liberi nei liquidi biologici (siero e urine) Con l HPLC si possono ottenere in tempi brevi (meno di un ora), ed in maniera del tutto riproducibile, separazioni quantitative degli aminoacidi su siero e urine:

poi, ancora più agevole la ricerca qualitativa e semiquantitativa degli aminoacidi liberi nei liquidi biologici (siero e urine) Con l HPLC si

18 METODI CROMATOGRAFICI Diventa così agevole la diagnosi di importanti malattie metaboliche come: fenilchetonuria alcaptonuria cistinuria omocistinuria leucinosi argininemia tirosinemia iperprolinemia ipervalinemia iperlisinemia citrullinemia Di interesse è l analisi cromatografica (su carta o su strato sottile) dei polipeptidi ottenuti per idrolisi enzimatica delle emoglobine dopo la separazione elettroforetica: si riescono a caratterizzare, così, varie emoglobine patologiche. La cromatografia su strato sottile, da sola o accoppiata alla gascromatografia, si è rivelata preziosa nello studio degli ormoni steroidei del sangue o delle urine, di molti farmaci e di loro metaboliti (alcaloidi cardioattivi, antibiotici, ecc), di droghe (barbiturici, oppiacei, amfetamine, ecc), di lipidi e fosfolipidi (ad es. nel liquido amniotico, per valutare la maturità respiratoria del feto)

elettroforetica: si riescono a caratterizzare, così, varie emoglobine patologiche.

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