PAP ELISA E wells. Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa della fosfatasi acida prostatica umana nel siero

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1 PAP ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa della fosfatasi acida prostatica umana nel siero E wells

2 1 USO DEL KIT Immunoassay enzimatico per la determinazione quantitativa di PAP nel siero umano. 2 INTRODUZIONE L attività enzimatica della fosfatasi acida della prostata (PAP) è stata misurata per la prima volta nell urina di uomini ed è stata localizzata negli organi del tratto genitale maschile 2. Gutman e coautori hanno ipotizzato che PAP potrebbe essere un marker tumorale significante in pazienti affetti da cancro della prostata, perchè le concentrazioni di PAP nel siero erano elevati in uomini con un carcinoma primario della prostata e con lesioni metastatiche della prostata,4. Un attività moderatamente elevata della fosfatasi acida nel siero è stata osservata anche in molte malattie non prostatiche. 3 PRINCIPIO DEL TEST Si tratta di un test immunoenzimatico su fase solida (ELISA). I micropozzetti sono ricoperti con anticorpi anti- PAP murini. I campioni, gli standard e i controlli sono incubati nei pozzetti assieme al tracciante enzimatico, che è una miscela di anticorpi anti-pap murini con differente affinità a epitopi della molecola PAP e che sono chimicamente coniugati alla perossidasi di rafano. Il tracciante enzimatico non legato è lavato via e la quantità di perossidasi legata è proporzionale alla concentrazione di PAP presente nei campioni, negli standard e nei controlli. Dopo l aggiunta del substrato, l intensità di colore è proporzionale alla concentrazione nei campioni e puo essere letta direttamente dalla curva standard, dato che l analisi dei controlli e degli standard viene eseguita parallelamente ai campioni. 4 REAGENTI 1. Micro-well Strips: micropozzetti ricoperti con anticorpi anti-pap (96) pozzetti. 2. Enzyme Conjugate * (12 ml): Tracciante enzimatico - perossidasi di rafano coniugata agli anticorpi anti-pap 3. Sample Diluent * (12 ml). Diluente dei campioni o standard zero 4. Reference Standard * (5 x 0.75 ml): Set di standard di referenza, concentrazione: 1, 3, 5, 15, 30 ng/ml PAP 5. TMB Solution A (12 ml): soluzione tampone contenente perossido di idrogeno e benzidine tetrametilico 6. Wash Buffer concentrate 100X (10 ml): Diluire 10 ml Wash Buffer concentrata con 990 ml di acqua deionizzata fino ad un volume finale di 1000 ml. 7. Stop Solution : Soluzione d arresto, 1 flacone, 14 ml, pronto all uso; contiene 0.5M H 2 SO 4. Evitare il contatto con la soluzione d arresto. Può causare irritazioni cutanee e ustioni. 8. Well holder: for securing wells. 9. Istruzioni per l uso * contiene 0.01% Thimerosal come conservante. 5 MATERIALE RICHIESTO MA NON FORNITO 1. Uno spettrofotometro per micropozzetti con lettura a 450 nm. 2. Micropipette per 25 e 100 µl. 3. Controllo (Bio-Rad Lyphocheck)

3 6 AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per la diagnosi in vitro esclusivamente. I componenti di questo kit sono intesi come unità integrale. I componenti di numeri di lotto differenti non devono essere mescolati. 7 CONDIZIONI DI CONSERVAZIONE 1. Conservare i kit a 2-8 C nel frigorifero. 2. Conservare i micropozzetti in sacchetti asciutti contenenti essicante. 3. I reagenti sono stabili fino alla data indicata sull etichetta. TMB Solution devono essere incolori. Se le soluzioni si presentano di colore blu, devono essere rimpiazzati. Non esporre questi reagenti a luce forte durante l uso o il magazzinamento. 8 COLLEZIONE DEI CAMPIONI E PREPARAZIONE Siero Collezionare il sangue attraverso la venipuntura. Far coagulare il sangue e separare il siero mediante centrifugazione a temperatura ambiente al più presto possibile. I campioni dovrebbero essere magazzinati ben chiusi fino a 24 ore a 2-8 C u a 20 C. Campioni magazzinati per un periodo più lungo dovrebbero essere congelati solo una volta a 20 C prima dell analisi. Evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento. 9 PREPARAZIONE DEL TEST 1. Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente (24 C ± 3 C) prima dell uso. Tutti i reagenti devono essere mescolati evitando la formazione di schiume. Una volta iniziato, il test deve essere eseguito e completato senza interruzioni. 2. Utilizzare nuove punte da micropipette per ogni campione. 10 POCEDIMENTO DELL ANALISI 1. Fissare il numero di pozzetti desiderato nell appoito sostegno. Annotare l identificazione dei campioni su un folio. 2. Pipettare 25 µl dei campioni, degli standard o dei controlli nei pozzetti.appositi. 3. Aggiungere 100 µl di tracciante enzimatico (Enzyme Conjugate) in ogni pozzetto. Incubare i pozzetti per 30 min. a temperatura ambiente. 4. Vuotare i pozzetti capovolgendoli con vigore. Lavare i pozzetti 5 volte con Wash Buffer (300 µl/well) 5. Aggiungere 100 µl di TMB Solution in ogni pozzetto. Incubare per 15 min. a temperatura ambiente. 6. Fermare la reazione enzimatica aggiungendo 100 µl di Soluzione d arresto (Stop Solution) in ogni pozzetto 7. Determinare l assorbanza a 450 nm.

4 11 NOTE GENERALI 1. Per ottenere ottimi risultati è molto importante lavare accuratamente i micropozzetti e rimuovere le gocce d acqua rimanenti. 2. Pipettare tutti i reagenti direttamente sul fondo dei pozzetti. Il mescolare sul vortex o lo scuotere dei pozzetti dopo ogni aggiunta non è richiesto. 3. L assorbanza è funzione del tempo di incubazione e della temperatura. Prima di iniziare il test si raccomanda di preparare tutti i reagenti, di levare il tappo ai contenitori e di fissare i pozzetti nel sostegno ecc.questa preparazione assicura un uguale tempo per ogni passaggio di pipettamento. 4. Per lo stesso motivo, il volume dei campioni analizzati in una procedura dovrebbe essere limitato. Si raccomanda di analizzare non più di 12 campioni in doppio con un set di standard di referenza. 5. Se in un campione viene trovata una concentrazione di PAP maggiore di 30 ng/ml, questo campione deve essere diluito con 0 ng/ml PAP standard e rianalizzato come descritto. 12 CONTROLLO QUALITÀ È consigliabile utilizzare i campioni controllo secondo le norme di legge. Attraverso l utilizzo dei campioni controllo (Bio-Rad Lyphocheck) si può raggiungere una verifica dei risultati giorno per giorno. Dovrebbero essere adoperati campioni controllo sia con un livello normale sia con uno patologico. 13 RISULTATI Si può usare ogni spettrofotometro per micropozzetti capace di determinare l assorbanza a 450 nm. Il valore di concentrazione di PAP per ogni campione si ottiene come segue: Costruire un grafico con i valori medi di ciascun standard di riferimento (sull ordinata) contro la concentrazione PAP (sull ascisse) e determinare la curva di calibrazione migliore (p.es. log/lineare). Utilizzare il valore medio delle assorbanze di ogni paziente e determinare la concentrazione PAP corrispondente per interpolazione. A seconda delle capacità di calcolatori si possono usare anche metodi alternativi per l elaborazione dei dati. 14 VALORI ASPETTATI È consigliabile che ogni laboratorio determini i propri valori normali e anormali. 1. Bibliografia: 4, 5, In uno studio condotto su persone apparentemente sane usando il test DRG PAP ELISA i seguenti valori sono stati ottenuti: a. Il siero di 100 sogetti normali (uomini) è stato analizzato. In questa popolazione 99% dei valori erano inferiori a 3 ng/ml. b. Campioni di 82 pazienti con prostata ipertrofica benigna (BPH) sono stati analizzati e in 79% sono stati trovati valori inferiore a 3 ng/ml. c. Campioni di 51 pazienti con carcinoma della prostata (PC) sono stati analizzati e in 80% sono stati trovati valori superiore a 3 ng/ml 15 LIMITAZIONE DEL TEST 1. Per l evaluazione diagnostica, i valori di PAP dovrebbero essere usati come fattore aggiuntivo ad altre osservazioni fatte dal medico. 2. Il test PAP ELISA è stato disegnato in modo da non presentare effetti hook di alto dosaggio a concentrazioni di PAP fino a 1000 ng/ml. 3. Campioni con concentrazioni di PAP superiore a 30 ng/ml dovrebbero essere diluiti per ottenere valori precisi. 16 CARATTERISTICHE DEL TEST

5 17 BIBLIOGRAFIA 1. Gorman, L. and Statland, B.E. Clinical usefulness of alkaline phosphatase Isoenzyme determinations. Clin. Biochem., 10:171, Kutscher, W. and Wolbergs H.. Prostatic Phosphatase I. Z. Physiol Chem. 236:237, Kutscher, W. and Warner, A. Prostatic Phosphatase II. Z. Physiol. Chem. 239:109, Gutman, A. B. and Gutman, E. B. An AAcid A Phosphate Occuring in the Serum of Patients with Metastasizing Carcinoma of the Prostate Gland. J. Clin Invest 17: , Yam, Y. T. Clinical Significance of the Human Acid Phosphatases. A Review. Am. J. Med. 56:604, Bernstein, L.H. Rudolph, R.A., Pinto, M.M., Viner, N. and Zuckerman, H. Medically Significant Concentrations of Prostate-Specific Antigen in Serum Assessed. Clin. Chem. 36/3, , Nguyen, L., Chapdelaine, A., and Chevvalier. S.. Prostatic Acid Phosphatase in Serum of Patients with Prostatic Cancer is a Specific Phosphotyrosine Acid Phosphatase. Clin. Chem. 36/8, , Ames, B.N. Assay of Inorganic Phosphate. Total Phosphate and Phosphatases. Methods Enzu,p; 8: , Fishman, W.H. and Lerner, F. A. A method of Estimating Serum Acid Phosphatase of Prostatic Origin. J. Biol. Chem. 200:89, Chu,T.M. et. Al. Immunochemical detection of Serum Prostatic Acid Phosphatase. Methodology and Clinical Evaluation. Invest. Urology 15:319, Bruce, A.W. Mahan, D.E., Sullivan, L.D. and Goldenberg, L. The Significance of Prostatic Acid Phosphatase in Adenocarcinoma of the Prostate. J. Urol. 125:357, InterMedical S.r.l. Via A.Genovesi, Villaricca (NA) ITALY - Tel Fax P. IVA product specialist : mail@intermedical-italy.it SIMBOLI Simboli Italiano Consultare le istruzioni per l uso Conformità europea RUO Per uso Diagnostica in vitro Solo a scopo di ricerca Numero di Catalogo Numero di lotto Contenuto sufficiente per n saggi Temperatura di conservazione Data di scadenza Fabbricante Distributed by Content Volume/No. Distributore Contenuto Volume/Quantità