D.ssa Tiziana Marsella. Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia Policlinico di Modena (Dir. Prof. A.Volpe)

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1 D.ssa Tiziana Marsella Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia Policlinico di Modena (Dir. Prof. A.Volpe)

2 Cryopreservation......Is at present the only possible way to STOP and RESTART the human lifeline, either indirectly (through gamete cryopreservation), or directly, by deep cooling human beings after conception and before implantation (Gabor Vajta 2009)

3 ATTUALMENTE lo studio e il miglioramento delle metodiche di crioconservazione rivestono un ruolo di primaria importanza nelle tecniche di Procreazione Medicalmente Assistita...

4 Anomalie cromosomiche linfomi leucemie K ovarico Chemioradio terapia K mammella Malattie autoimmuni Esaurimento ovarico precoce

5 ...le nuove strategie antitumorali hanno portato ad un progressivo aumento della sopravvivenza media delle bambine e delle giovani donne...ponendo particolare attenzione alla preservazione della fertilità

6 crioconservazione ovociti= salvaguardia patrimonio genetico materno

7 LA CRIOBIOLOGIA applicata alla Riproduzione scienza nata da un errore...il glicerolo al posto del levulosio Polge 1949

8 ... Un po di storia dei gametiembrioni umani congelati Sherman 1983 Trounson 1984 Zeilmaker 1986 Chen 1987 Al-Hasani 1987 Van Uem 1995 Kazem (ICSI) 1998 Porcu

9 ... Un interesse sempre più crescente N pubblicazioni /anno 84/anno

10 ... Soprattutto in Italia Dopo l applicazione della Legge 40 /2004

11 Crioconservazione trasformazione dell H2O in GHIACCIO Alle basse temperature il metabolismo cellulare RALLENTA Fino allo stato di ANIMAZIONE SOSPESA

12 Crioconservazione Principi Fenomeni il cui impatto sulla cellula è potenzialmente dannoso durante il congelamento CRISTALLI DI GHIACCIO EFFETTO SOLUZIONE SHOCK OSMOTICO

13 Crioconservazione Principi PASSAGGIO CRITICO CAMBIAMENTO DI FASE DELL H 2 O STATO LIQUIDO STATO SOLIDO CONGELAMENTO SCONGELAMENTO GHIACCIO struttura cristallina meno densa rispetto allo stato liquido i cristalli di ghiaccio occupano un volume maggiore l espansione genera pressione, forze di stiramento e rottura all interno della cellula

14 Crioconservazione Principi Uno dei principali obiettivi da raggiungere durante il congelamento è quello di ridurre la formazione di CRISTALLI DI GHIACCIO soprattutto all interno della cellula DISIDRATAZIONE

15 Sali Cristalli di ghiaccio Crioconservazione Principi L acqua solidifica ed ogni soluto presente viene escluso dal solido in via di formazione 20 C 0 C -196 C

16 Crioconservazione Principi EFFETTO SOLUZIONE Nella frazione non ancora congelata si raggiunge una concentrazione molto elevata di elettroliti che può essere tossica per le proteine intracellulari 20 C 0 C -196 C

17 Crioconservazione Principi SCONGELAMENTO I cristalli di ghiaccio si sciolgono rilasciando H 2 O SHOCK OSMOTICO 0 C -196 C 20 C Reidratazione troppo rapida (scongelamento rapido) Re-cristallizzazione dell H 2 O (scongelamento lento)

18 Crioprotettori MECCANISMI: PENETRANTI: PROH; DMSO; GLICEROLO NON PENETRANTI Saccarosio ETILEN GLICOLE DMSO SACCAROSIO GLUCOSIO FICOLL PROH LIPO-PROTEINE Abbassano il punto di congelamento formando LEGAMI H con l H 2 O Inibiscono la formazione CRISTALLI DI GHIACCIO favorendo la formazione di un solido simile al vetro (VITRIFICAZIONE) Diluiscono la concentrazione degli elettroliti mitigando l EFFETTO SOLUZIONE COLE DISIDRATAZIONE Prevengono lo SHOCK OSMOTICO creando un gradiente osmotico contrario durante lo scongelamento

19 L ovocita umano: una cellula così complicata da congelare!!!! Dimensioni e morfologia Granuli corticali Fuso meiotico Membrana Plasmatica Strutture subcellulari

20 CONGELAMENTO LENTO Crioconservazione Ovociti due metodiche a confronto VITRIFICAZIONE BASSA (1.5M) Concentrazione di crioprotettore ELEVATA ( M) LENTA ~ 0.5 C /min ASSENTE Curva di congelamento Contatto diretto con azoto MOLTO RAPIDA C /min PRESENTE ml < 1 µl Volume soluzione congelamento

21 CONGELAMENTO LENTO Crioconservazione Ovociti due metodiche a confronto VITRIFICAZIONE SI FORMAZIONE CRISTALLI GHIACCIO NO Complicata?? PROCEDURA Semplice??? ALTI??? COSTI BASSI?? > 90 min < 1 min??? TEMPO NECESSARIO

22 40 Curve di congelamento VITRIFICAZIONE CONGELAMENTO LENTO 20 0 TEMPERATURA C TEMPO min

23 C + 20 Periodo di equilibrazione in crioprotettore penetrante Disidratazione Caricamento in crioprotettore penetrante + non penetrante CONGELAMENTO LENTO Temp di partenza: +20 C 1 step: - 8 C (- 2 C/min) 2 step : hold 10 min (Seeding) 3 step : - 30 C (- 0.3 C/min) 4 step : C (- 50 C/min) 5 step : C minuti N2 Lassalle B, Testart, RenardJP Fertil Steril Nov;44(5): KRYO 10 SERIES III PLANER SAPIO N 2

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25 The HSV straw - The HSV straw - a closed system The McGill Cryoleaf - an open system

26 The Vitroloop Nylon loop ( mm in diameter) Create thin film of cryoprotectant solution by surface tension Load loop using a pipette

27 The Vitroloop

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29 Anni 80-90: Lotta per la sopravvivenza al congelamento Crioprotettori Penetranti Crioprotettori non penetranti 1.5M Me 2 SO (DMSO) Anni 80 Pochi casi Sopravvivenza bassa Sporadiche gravidanze 1.5M PrOH Primi studi consistenti Sopravvivenza Gravidanze

30 ... Sopravvivono!!!!... E le fertilizzazioni? 1.5M PrOH KRYO 10 SERIES III PLANER SAPIO N 2 Saccarosio ICSI Kazem 1995

31 ... Continua la lotta per la sopravvivenza al congelamento: PrOH Saccarosio Tempo di esposizione 1.5M PrOH + saccarosio Fabbri 2001 Saccarosio: 0.3 M > 0.2 M > 0.1 M Tempi di esposizione: 15 min > 10 min Sopravvivenza

32 ... Continua la lotta per la sopravvivenza al congelamento: PrOH PrOH Saccarosio Saccarosio Cumulo + vs Cumulo - Fabbri 2001 Tassi di sopravvivenza non significativamente differenti

33 Stachecki 1998 Variazione sul tema: Na + % blastocisti colina Na + Quintans Tot = 25 C M PrOH 137mM colina 1.0 M PrOH 137mM colina 1.5 M PrOH 137mM colina 1.5 M PrOH 137mM colina 0.1M saccarosio Bio-Cool II Biological freezer scongelamento: Coltura minuti M PrOH 137mM colina 0.2M sacc 0.5 M PrOH 137mM colina 0.2M sacc PBS 137mM colina 0.2M sacc 4-6 h

34 stress osmotico: come varia il volume dell ovocita? Paynter M PrOH 20 C 1 Volume ovocita L p = permeabilità all acqua P s = permeabilità ai soluti Tempo (sec) L p P s 30 C 20 C 10 C L p P s L p P s

35 ... E in presenza del saccarosio? Paynter M PrOH + saccarosio 1 Volume ovocita Tempo (sec) 0.1M 0.2M 0.3M

36 ... Pericoli in agguato!!!! M PrOH KRYO 10 SERIES III PLANER SAPIO N 2 Saccarosio 0.1M Depolimerizzazione del fuso meiotico? Gook 1993 Microscopio a fluorescenza FUSO MEIOTICO INTATTO: 63% (15/24) dopo esposizione al PrOH 61% (8/13) dopo cong/scong (studio con basso numero di ovociti)

37 1.5M PrOH... Pericoli in agguato!!!! % KRYO 10 SERIES III PLANER SAPIO N 2 Saccarosio 0.3M Bianchi 2005 PolScope + spindle view Tempo di attesa per la ICSI h 3 h 5 h Assente Debole Forte

38 ... Pericoli in agguato!!!! M PrOH 100% KRYO 10 SERIES III PLANER SAPIO N 2 Saccarosio 0.1M Rienzi 2004 PolScope + spindle view Riorganizzazione del fuso meiotico? 1.0 M PrOH M sac (5 min) 0.5 M PrOH M sac (10 min) 0.1 M sac (10 min) PBS (10 min) Coltura (+ 3 ore) 31% 25 % 0 % 0 % 100 %

39 ... Ma... Allora??? M PrOH 0.1M Saccarosio 0.3M Coticchio 2006 Microscopio confocale Freschi 73% 17% 10% 0.1M 51% 42% 7% 0.3M 70% 23% 7%

40 ... Cattive notizie... Ca M PrOH KRYO 10 SERIES III PLANER SAPIO N 2 ATP Saccarosio 0.2M Jones 2004

41 ... Un po di storia della vitrificazione - Descritta già alla fine dell 800 (Tammann, 1898) - Vitrification of mouse embryos at -196 C (Rall & Fahy, 1985; Ali and Shelton, 1993) - Blastocyst development in bovine oocytes (Martino et al. 1996)

42 ... In tempi più recenti..

43 Quale metodo? Congelamento lento Vitrificazione

44 Quale metodo?

45 ... Partendo dal presupposto che......efficacia di una tecnica= risultati AMPI E SISTEMATICAMENTE riproducibili

46 ... Partendo dal presupposto che......il SETTING e l EFFICIENZA dello specifico laboratorio influenzano i risultati clinici

47 CONGELAMENTO LENTO Chen, 1986 Van Uem et al, 1987 Chen, 1988 Porcu et al, 1997 Polak de Fried, 1998 Porcu et al, 1998a Tucher el al, 1998 Porcu et al, 1999a Wurfeel et al, 1999 Kyono et al, 2001 Chen et al, 2002 Huttelova et al, 2003 Miller et al,2004 Notrica et al, 2004 Tyer et al, 2005 Montag et al, 2006 Barritt et al,2007 Gook et al, 2007 Yang et al, 2007 Porcu et al, 2008 Borini et al,1998 Porcu et al, 1998b Porcu et al, 1999b Porcu et al 2000 Winslow et al, 2001 Yang et al, 2002 Quintans et al,2002 Boldt et al, 2003 Fosas et al, 2003 Borini et al, 2004 Azambuja et al, 2005 Chen et al, 2005 Li et al, 2005 Porcu, 2005 Boldt et al, 2006 Borini et al, 2006 Chamayou et al, 2006 La Sala et al, 2006 Levi Setti et al, 2006 Petracco et al, 2006 Bianchi et al, 2007 De Santis et al, 2007 Konc et al, 2007 Lavori Pubblicati VITRIFICAZIONE Kuleshova et al, 1999 Katayama et al, 2003 Kyono et al, 2005 Yoon et al, 2003 Chian et al, 2005 Kim et al, 2005 Okimura et al, 2005 Kuwayama et al, 2005 Ruvalcaba et al, 2005 Locena et al, 2006 Antinori et al, 2007 Cobo et al, 2008

48 NUMERO DI BAMBINI NATI PUBBLICATI congelamento lento vitrificazione Noyes et al, 2009 RBM on line

49 RISULTATI CONGELAMENTO LENTO OVOCITI SCONGELATI 308 BAMBINI NATI (Pubblicati) Noyes et al, 2009 RBM on line RISULTATI VITRIFICAZIONE 5435 OVOCITI SCONGELATI 289 BAMBINI NATI (Pubblicati) 224 BAMBINI NATI (Non Pubblicati) TOTALE BAMBINI NATI (Non Pubblicati) TOTALE 392 Numerosità dei lavori (senza bias di pubblicazione) Riproducibilità dei risultati Applicazione della tecnica su larga scala e non su casi selezionati (surplus ovociti) La maggior parte delle pubblicazioni sono Italiane (restrizioni della Legge 40) Pochi lavori Non riproducibilità Ovodonazione Non restrizioni di Legge

50 148 Live births

51 221 Live births

52 Quale metodo? 0 0

53 Poiche per entrambe le tecniche occorre... Standardizzazione metodiche cliniche e di laboratorio Studio accurato metabolismo embrionale e indagini ultrastrutturali Scrupoloso follow up dei risultati ottenuti

54 Senza perdere di vista il nostro compito: fare in modo che quell ovocita vitrificato o congelato generi un bambino SANO!!

55 Gioie e dolori divisi con... MEDICI Simone Giulini Francesca Tortolani Antonio La Marca Alessandra Tirelli BIOLOGHE Daniela Tagliasacchi Susanna Xella DIRETTORE Annibale Volpe

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