Immunologia Oveview e fagocitosi

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1 Immunologia Oveview e fagocitosi riferimenti Overview PROF DIELI March 12, 2012 francesco.dieli@unipa.it unipa.it/dottimmunofarmacologia 091/ /5902/ prove in itinere: 15/06 18/07 12/09 24/09 20/12 17/01 30 risposta muiltipla, 1 risposta aperta 3/4 maggio I prova in itinere 5/6 giugno II prova in itinere testi consigliato: (in ordine di prezzo) patologia generale - pontieri russo frati immunologia male brostoff roth immunologia cellulare e molecolare abbas lichtman kuby immunologia goldsby kindt immunologia partham reviews in immunology htto:// antigene: sono sostanze verso cui la risposta immunitaria è rivolta. è riconosciuto dall'anticorpo; è una molecola di qualsiasi natura che è riconosciuta dai recettori dei linfociti B o T. può essere self: in condizioni di patologie autoimmunitarie la risposta immunitaria è rivolta verso sostanze proprie dell'organismo. ; esistono antigeni nella capsula di alcuni batteri che non sono in grado di indurre risposte immunitarie da soli. immunogeno: sostanza che se somministrata induce una risposta immunitaria. epitopo: porzione dell'antigene che interagisce con BCR TCR Immunogenicità: estraneità, peso molecolare (tanto piu è elevato, tanto più è immunogenica), complessità chimica (maggiore complessità, maggiore immunogenicità), degradabilità (velocità di degradazione, è immunogenica se è poco degradabile), dose e via di somministrazione (fondamentale affinchè questa molecola sia immunogenica. Esempio: non tutte le vie di somministrazione di molecole inducono risposte immunitarie: la via endovenosa non induce risposta immunitaria. funzionano meglio via intramuscolare e intradermica. Dosi molto basse o molto elevate di molecole estranee non inducono risposta immunitaria, ma inducono l'individuo ad abituarsi alla molecola e a tollerarla. una dose intermedia è una dose che può causare immunogenesi, quindi è difficile trovare la giusta quantità affinchè si smuova il sistema immunitario. Esempio: ogni giorno veniamo a contatto con molti germi,virus e batteri, ma la concentrazione è troppo bassa per indurre risposta immunitaria). esempi di strutture antigeniche: possono contenere singoli o multipli epitopi. Aptene, molto semplice a livello di struttura chimica; PM Da= sostanza antigenica ma non immunogenica. per scatenare la risposta bisogna collegarlo ad un carrier affinchè sia riconosciuto. Polisaccaridi: costituiti da uno stesso antigene che si ripette piu volte nella molecola; i lipopolisaccaridi sono contenuti in pareti cellulari, che inducono risposta immunitaria, ma non possono creare una memoria immunologica. Proteine: i migliori immunogenetici in natura: PM elevato, complessa a livello chimico, e rispecchia le caratteristiche dell'immunogenicità. gli antigeni presenti nelle proteine non risultano necessariamente dalla struttura primaria, ma l'antigene è frutto della composizione terziaria. l'antigene proteico può essere lineare (sequenza di amminoacidi in successione riconosciuti come antigene, una proteina può avere più strutture riconosciute come antigene); oppure può essere conformazionale (l'antigene strutturale è riconosciuto dall'anticorpo nella forma di legami S-S (l'epitopo è il legame S-S), cioè dalla conformazione che assume la molecola nello spazio, non dalla sequenza amminoacidica.) anticorpi monoclonali: anticorpi somministrati per il riconoscimento di particolari molecole prodotte da agenti tumorali o patogeni; quindi riconosce selettivamente le molecole "maligne" salvando le cellule e le molecole sane. l'anticorpo monoclonale si crea in laboratorio e si costruisce in maniera tale che riconosca una particolare molecola. per costruire un anticorpo monoclonale bisogna conoscere l'antigene che si vuole eliminare. 1

2 caratteristiche di immunità innata ed acquisita vie di penetrazione dei microrganismi Immunità: i romani definivano immuni gli evasori fiscali, che erano immuni alle tasse -.- immunità Innata: presente fin dalla nascita, non specifica, rapida, assenza i memoria; è composta da barriere naturali (cute; mucose: la mucosa delle vie respiratorie è ciliata, che muovendosi e secernendo mucina che produce muco, intrappolano i microrganismi, e attraverso vari meccanismi vengono espulsi; la mucosa dello stomaco, che crea un ambiente acido che non favorisce la vita dei microrganismi; la saliva, le lacrime, secrezioni nasali; barriere chimiche del sangue come il lisozima), fagociti, mediatori solubili (complemento: proteine presenti in forma inattiva del sangue, che dopo la l'attivazione della prima, questa attiva le proteine simili a cascata inducendo l'eliminazione del microrganismo estraneo; nel sangue sono presenti anche le defensine), recettori per profili molecolari (questi recettori che si trovano sui fagociti o simili; hanno come ligandi dei substrati che fanno tipicamente parte di componenti estranee, Es.: mannosio si trova nella parete batterica, viene riconosciuto, fagocitato, eliminato; lipopolisaccaride si trova su tutti i gram negatici, e assente su cellule self, quindi il fagocita riconosce il batterio riuscendo a distinguerlo da una cellula self.) questi recettori non sono clonalmente distribuiti immunità Acquisita: questo tipo di immunità deriva da una risposta che viene acquisita in seguito a interazione con l'antigene, è quindi antigene-specifica, lenta (giorni), memoria; è composta da linfociti, BCR (recettore delle cellule b) TCR (recettore dei linfociti T) e molecole solubili (anticorpi); ogni cellula ha un recettore che ha una singola specificità antigenica = un linfocita- un recettore-un antigene: per questo i recettori dei linfociti vengono detti clonalmente distribuiti NB: memoria e specificità vanno di pari passo. Vaccino: servono ad indurre una risposta immunitaria che ci proteggera per tutta la durata della vita ( non sempre dura tutta la vita, bisognano particolari circostanze) nei confronti di specifici antigeni. se utilizzo una molecola di antigene A per crearne la memoria immunogenetica attraverso un vaccino, il corpo non avrà memoria per molecole di antigene B. memoria immunologica: in seguito all'interazione con un antigene, si crea una memoria antigenica: questa memoria serve a velocizzare la risposta nel momento in cui si ripresenti lo stesso antigene, offrendo una risposta immunitaria più efficiente. la memoria immunologia è migliore nei confronti di antigeni recenti o passati se particolarmente intensi; per crearsi ha bisogno di tempo (2-3 settimane prima di attivarsi). antitetanica: nonostante si sia stati vaccinati nei confronti del tetano, e quindi dovremmo possedere anticorpi contro la tossina del tetano, l'antitetanica(che non è altro che anticorpi contro la tossina del tetano) viene somministrata perchè la memoria indotta dalla vaccinazione può non durare o affievolirsi, a causa di alcune condizioni particolari. recettori clonalmente distribuiti: si fa riferimento al clone in quanto un clone è un derivato identico da una singola cellula. se una cellula viene stimolata da un antigene, acquisisce proprietà immunogeniche che prima non aveva. tutte le cellule che derivano per mitosi da quella cellula che per prima ha riconosciuto l'antigene avranno già acquisita la proprietà recettoriale di riconoscere lo stesso antigene più velocemente. i fagociti non hanno recettori clonalmente distribuiti perchè i recettori che possiede sono generici, che non vengono a crearsi o modificarsi in seguito all'interazione con particolari ligandi, ma che sono sintetizzati dalla nascita e presenti su dei fagociti stessi. penetrano prevalentemente attraverso le vie delle mucose o degli epiteli. un microrganismo puo infettare un individuo attraverso le vie aeree, inalando delle spore o delle goccioline. questo si verifica quando si è in un ambiente chiuso e si sta a stretto contatto con delle fonti aeree di microrganismi. alcune malattie infettive che sono tipiche del periodo invernale hanno un contagio favorito perchè in inverno si sta piu spesso al chiuso. l'infezione attraverso la via gastrointestinale è una misura di infezione tipica dei paesi poco sviluppati, e queste infezioni si verificano in seguito all'ingerimento di acqua inquinata. l'infezione può trasmettersi le vie sessuali. l'infezione attraverso la cute, se è integra è molto raro. ma la cute non è mai integra. lesioni minuscole della cute favoriscono lo scaturire di infezioni. esempio: abrasioni (antrace), ferite (tetano), contatto con animali o morsi di insetti (zanzare zecche - Malaria e malattia di lime. zecca morde il cervio, succhia agente eziologico e nel morso successivo infetta il nuovo ospite). la flora batterica è una via di sbarramento delle infezioni. induce la produzione di citochine che mantengono l'omeostasi del tratto genitale femminile e gastrointestinale 2

3 fagocitosi capacità di alcune cellule di riconoscere un agente estraneo, o segnale di pericolo, tramite recettori per profili molecolari, capacità di legarlo, di internalizzarlo e di eliminarlo. nella fagocitosi è possibile riconoscere certe fasi: (migrazione) riconoscimento; FAGOCITOSI; uccisione del microrganismo. la fagocitosi è operata dai granulociti macrofagi e dai monociti polimorfonucleati; i monociti si trovano nel sangue, e per poter fagocitare un microrganismo entrato attraverso la cute e depositato nel connettivo, il fagocita deve prima MIGRARE dalla sua sede nel sangue fino al luogo dell'infezione. 3

4 migrazione come fa a capire il fagocita la direzione verso cui deve migrare? ESISTONO DELLE CELLULE che si trovano a livello dei tessuti, e non solo al livello del sangue.monocita=se circola nel sangue; macrofago= se è nei tessuti; ma si tratta della stessa cellula. il nostro organismo ha la caratteristica di disporre di macrofagi in diversi tessuti. vengono chiamati con nomi differenti in base alla loro sede anatomica: SNC= microglia; fegato=cellule di ******. i macrofagi residenti nei tessuti, nel momento dell'infezione, iniziano a produrre citochine e chemiochine (mediatori chimici) responsabili del richiamo e del reclutamento orientato dei monociti macrofagi. le cellule residenti nei tessuti sono quindi i primi a dare l'allarme richiamando altre cellule con la loro attivazione. chemiochine= citochine con funzione di far migrare in maniera orientata alcune cellule. è una migrazione che avviene "contro gradiente di concentrazione": dal punto in cui la concentrazione di chemiochine è minore al punto in cui la concentrazione di chemiochine è maggiore. questo fenomeno mediato dalle chemiochine è detto chemiotassi. il fagocita si trova quindi nel vaso, e deve migrare in un tessuto. la fuoriuscita dal vaso è un fenomeno complicato, che avviene attraverso tappe sequenziali che comprendono l'interazione tra endotelio vascolare e cellula stessa. normalmente un leucocita prende contatto con le cellule endoteliali attraverso due molecole: 1 espressa dall'endotelio: e-selectina; e i glicolipidi sul leucocita. questo legame tra queste due molecole è debole. il legame con la e-selectina è subito interrottoa causa di molte ragioni (rotolamento fisiologico del leucocita), che lo spinge avanti, dove può avere un altro legame debole con un altra e-selectina, e così via. questo processo è detto ROLLING, e comprende: interazione, distacco, flusso, interazione, distacco, flusso etc... il leucocita per uscire dal vaso deve fermarsi e legare saldamente all'endotelio. il leucocita si arresta al livello della cellule endoteliali prossime alla sede di infezione. qui intervengono le cito e le chemiochine. queste molecole prodotte in sede di infiammazione permettono l'arresto del leucocita attraverso legami piu stabili. le citochine inducono l'espressione di alcune MOLECOLE DI ADESIONE, che inducono all'espressione di tali molecole da parte dell'endotelio. queste molecole sono indicate come icam, (intercellular adhesion molecules) e vcam. queste molecole legano a livello del leucocita delle molecole dette INTEGRINE in maniera debole. quindi: ROLLING MEDIATO DA E-SELECTINA E GLICOLIPIDI, ADESIONE MEDIATA DA MOLECOLE DI ADESIONE ICAM E INTEGRINE l'affinità di legame tra icam e integrine è molto bassa, occorre quindi che accada qualcosa affinchè aumenti l'affinità di legame e non si verifichi di nuovo il rotolamento ( che allontanerebbe il leucocita) questo ruolo di evitare il rotolamento è svolto dalle chemiochine. i leucociti hanno dei recettori per le chemiochine; queste, legandosi ai recettori dei leucociti, agiscono aumentando l'affinità delle integrine del leucocita per le icam: si realizza quindi una reazione stabile che provoca l'arresto del leucocita che non rotola più. tra le integrine, una delle piu importanti è la LFA1. una malattia da immunodeficienza, dovuta al gene che esprime in maniera errata questa proteina. una volta arrestato, il leucocita deve attraversare l'endotelio vascolare: come? DIAPEDESI. il leucocita modifica la sua conformazione, e si insinua tra due cellule endoteliali grazie alla formazione di uno pseudopodio; la condizione essenziale per il passaggio di un leucocita attraverso il vaso è che le cellule endotelali siano separate (normalmente sono strettamente adese): affinchè avvenga deve esserci un aumento della permeabilità vascolare; i mediatori dell'aumento della permeabilità vascolare sono le citochine, che inducono il distaccamento di due endociti adiacenti. una volta uscito dal vaso il leucocita si ritrova a contatto con il tessuto connettivo, e per muoversi all'interno di esso per raggiungere la sede di infezione deve superare una trama molto fitta di materiale extracellulare e condrociti. deve quindi degradare la matrice connettivale, grazie a degli enzimi litici (metallo proteasi e collagenasi), per attraversarla fino al rarriungimento della sede di infezione guidato dalla chemiotassi. tutte le azioni biologiche del fagocita, che vanno dall'espressione di molecole di membrana, dal loro cambiamento di forma, all'acquisizione della capacità di movimento, alla formazioni di enzimi litici sono tutte innescate da reazioni date interazioni tra citochine e/o chemiochine con i ligandi di membrana del leucocita stesso. 4

5 riconoscimento internalizzazione (fagocitosi) il riconoscimento avviene grazie a recettori per profili molecolari non clonalmente distribuit(i i TLR sono esposti sulla superficie di tutti i macrofagi), detti recettori Toll-Like (TLR) - i recettori toll erano stati trovati nella drosophila (zzappagghione).questi recettori rispettano il self, e riconoscono strutture tipiche di entità non self. i recettori toll-like sono 9-10, nell'uomo, ed alcuni sono espressi come catena singola, altri come dimeri. ad esempio: tlr1 si trova espresso insieme a tlr2 il primo scoperto TLR4, riconosce lipopolisaccaride batterico (tipico dei gram negativi) il TLR9 riconosce DNA ricco di isole di citosina e guanina, presenti generalmente nel DNA di molti virus e batteri, e quasi assenti in quello umano TLR3 lega rna a doppia elica i recettori tlr dopo aver legato il ligando, cambiano di conformazione sul versante interno,e riescono a prendere contatto con proteine chinasi inducendo una cascata di reazioni di trasduzione del segnale, che arriva fino al nucleo. questa trasduzione dal punto di vista pratico induce la modulazione delle molecole espresse sulla membrana (il leucocita esprime molecole solo utili), e tutti gli alti fenomeni della fagocitosi (internalizzazione, lisi del microrganismo), e altre cose, tra cui il ripristino dei tessuti danneggiati sia dal passaggio del leucocita stesso (con produzione di fattori di crescita) sia dall'antigene. la porzione intracitoplasmatica del tlr deve essere tale da poter permettere il contatto con proteine chinasi.purtroppo però le porzioni intracitoplasmatiche sono corte, e quindi per far si che avvenga questa interazione tra le code dei tlr e le chinasi sono necessari delle proteine mediatrici, dette adattatori: CD14, CD36 ect... alcuni recettori tlr sono espressi intracitoplasmaticamente (tlr 3,7,8,9) in alcuni endosomi. questi recettori sono importanti per le infezioni intracellulari: virus (organismi intracellulari obbligati). altri recettori che fungono da sensori intracitoplasmatici sono RIG1 (riconosce dna virale) NOD2 (sensori del citosol, che sembrano implicati anche in parecchi fenomeni autoimmunitari, lega in genere peptidoglicani batterici. N.B.: non tutti i recettori, sia tlr che altri, NON SEMPRE SONO ESPRESSI SULLA MEMBRANA, possono anche essere presenti all'interno della cellula: le cellule attraverso la macropinocitosi e la micropinocitosi possono internalizzare molecole attraverso una "fagocitosi generalizzata", e quindi, se si trovano microrganismi all'interno, devono essere in grado di riconoscerlo attraverso recettori intracellulari. altri recettori per profili molecolari : CD4 (nei macrofagi per il virus HIV); recettore per il mannosio [molti batteri sono mannosilati]; DC-SIGN (dc, perchè scoperto all'inizio sulle cellule dendritiche, è una variante del recettore del mannosio, ed è specifico per 3-4 patogeni: virus HIV, micobatterio TCB e il elicobacter pilori (ulcera) e forse virus dell'epatite.sembra che dc-sign lega dei carboidrati presenti su quiegli antigeni. in sintesi dc-sign è importante per la specificità con cui lega quegli antigeni ) i legami con i recettori del fagocita, inducono l'attivazione all'interno del fagocita di meccanismi per l'uccisione del microrganismo, attraverso la produzione di specie contenenti ossigeno reattivo (ROS), radicali dell'ossigeno e ossido nitrico; al contempo inducono anche la produzione di altre citochine(tnf tumor necrosys factor, interleuchina 1 e 12) che potenziano il processo infiammatorio soprattutto a livello dell'endotelio, dove inducono espressione di proteine per l'arresto del leucocita ed un aumento della permeabilità del vaso. vengono prodotti, in seguito a legame con i recettori, anche fattori di crescita per i fibroblasti, fattori angiogenetici e metalloproteinasi per il rimodellamento della matrice extracellulare danneggiata. nel sito in cui un ligando lega il microrganismo, la membrana si invagina circondando il microrganismo. successiva formazione di una vescicola con il microrganismo al suo interno. questa vescicola con il microrganismo all'interno viene detta fagosoma. il fagosoma deve passare attraverso due eventi: maturazione del fagosoma e fusione tra fagosoma e lisosoma. se non si verificano queste condizioni, specialmente la prima, non vi è possibilità di uccidere il microrganismo. gran parte dei microrganismo che riescono a sopravvivere all'internalizzazione ci riescono proprio perchè ostacolano una di queste due fasi (leishmanie, TCB). 5

6 maturazione del fagosoma processo di internalizzazione è necessaria un acidificazione del ph all'interno del fagosoma. questo ph piu acido induce un attivazione degli enzimi (che lavorano a ph acido: idrogenasi, prolasi collagenasi etc..); per questa acidificazione è necessaria una pompa atp-dipendente. all'interno del fagosoma deve essere portato ferro: trasportatore per il ferro, e transferrina. senza il ferro il fagosoma non può maturare.(sembra sia un componente essenziale di alcune GTP-asi) rimozione dalla membrada del fagosoma della proteina TACO. TACO = proteina che ricopre ricca di aspartato. si trova sul versante interno della membrana cellulare. quando si forma un fagosoma per endocitosi, taco rimane sulla membrana esterna del fagosoma. quando taco è sulla membrana del fagosoma non vi può essere la fusione tra fagosoma e lisosoma. RAB7 (GTP-asi) è adibita alla rimozione di taco e alla conseguente promozione della fusione tra fagosoma e lisosoma. le GTP-asi,anche della famiglia rab, possono avere funzioni che sono contrastanti fra loro stesse. membri della stessa famiglia possono avere azioni inverse: uno stesso batterio, legandosi ad un recettore può innescare due gtp-asi, una che promuove l'uccisione, e una che ne contrasta l'uccisione. rab14 è una proteina che si trova nel citosol e deve esservi trattenuta perchè ha la tendenza di posizionarsi sulla membrana del fagosoma, impedendone la fusione con il lisosoma. quindi qualcosa deve trattenerla nel citosol. AS160 è la proteina deputata a controllare che rab14 non sfugga dal citoplasma e si vada a posizionare sul fagosoma. alcuni batteri fosforilano, attraverso la produzione di fosfoinositobi-trifosfato, AS160, in maniera che non possa più controllare rab14. a questo punto rab14 si mette sul fagosoma, impedendone la fusione con il lisosoma a seconda della gtp-asi che si attiva può essere promossa (IRGM1, che è anche attivata dai linfociti T) o ostacolata (inibizioneda parte del microrganismo di as160) la fusione tra fagosoma e lisosoma. cosa accade in natura? quando un micobatterio viene fagocitato, all'interno del macrofaco può crescere, perchè blocca i processi di lisi. il macrofago deve essere potenziato dai linfociti nei suoi meccanismi citotossici= produzione di radicali dell'ossigeno (piu potente battericida conosciuto, per produrre i radicali dell'ossigeno hanno bisogno dell'enzima NADPH OSSIDASI), produzione di radicali dell'azoto (indotto dall'ossido nitrico sintasi utilizzando ossigeno molecolare e l'azoto della citrullina o dell'arginina), enzimi che funzionano in ambiente acido, presenza di defensine (peptidi antibatteriche, presenti anche su cellule epiteliali). l'ossidasi fagocitica è localizzata sulla membrana del lisosoma, ed è un enzima la cui attivazione dipende dal ph; il fenomeno di citotossicità è caratterizzato da due fasi, che coincidono con la maturazione del fagosoma e la fusione di questo con il lisosoma. queste due fasi sono dette perossidasi dipendente o indipendete. questi meccanismi possono essere categorizzati per efficienza: il più importante è la produzione di radicali dell'ossigeno perchè, a causa dell'essenzialità della nadph ossidasi, un'eventuale mutazione di questa può portare a gravi situazioni di immunodeficienza. ogni punto di questa fase può essere ostacolato da microrganismi, che impediscono così che possa avvenire il processo di degradazione. il golgi ed il r.e. attraverso una serie di sensori riescono a sostituire lka parte di membrana che è stata usata per creare il fagosoma. nel citosol abbiamo dei sensori per il calcio; vi sono delle vescicole derivanti sia dal golgi (NCS1 sensore neuronale del calcio) che dai lisosomi (sinaptotagmina). queste vescicole presentano recettori per il calcio che sono NCS1 e sinaptotagmina. dopo la formazione del fagosoma la permeabilità di membrana si modificav e avviene l'ingresso di ioni calcio. queste vescicole presentano recettori per il calcio sulle loro pareti e sono NCS1 e sinaptotagmina questi sensori attivati dal calcio si mobilizzano e si portano sulla membrana, in maniera che ogni apparato membranoso (dei due apparati considerati) andrà a donare una porzione di membrana per ricostituire la membrana cellulare. questo meccanismo è stato dimostrato nel novembre

7 Immunologia - Cellula Dendritica e Linfociti cellule emopoietiche teorie di differenziazione di una cellula staminale cellula dendritica PROF DIELI April 22, 2012 tutte derivano da un unico precursore che ha sede nel midollo osso. da questa derivano cellule linfoidi, mieloidi (granulociti e monociti/macrofagi), cellule dendritiche, eritroidi megacariocitari (globuli rossi, e piastrine e elementi anucleati ). ipotesi a: una cellula staminale non differenzia direttamente in una cellula matura, ma si orienta verso un precursore, linfoide o mieloide. ipotesi b: non vi è bisogno di precursori intermedi, ma una staminale a seconda dello stimolon che riceve nel midollo può diffderenziare in qualsiasi cellula senza passare attraverso precursori ipotesi c: la cellula staminale è programmata. questo programma prevede che essa possa differenziarsi solo verso una sede: diventare megacariocita. SE non riuscisse ad attuare questo programma, opterebbe per un programma alternativo che la porterebbe ad una differenziazione linfoide o mieloide. teoria differienziativa natural immunology: la staminale si differenzia in un precursore mieloide comune per cellule linfoidi e mieloidi, ed un precursore comune che differenzi in senso eritrocitico e megacariocitico. fino ai anni il pool di staminali rimane costante. perche ogni volta che una cellula staminale differenzia fa nascere una cellula differenziata ed un'altra cellula staminale. teoria dell'omeostaticità: nelle cellule staminali il concorso di due eventi opposti contribuisce al mantenimento del numero di staminali standard; avviene una divisione asimmetrica che da origine ad una cellula differenziata ed una staminale che ristabilisce il pool. nel 1979 vengono trovate da Steiman delle cellule non identificabili ne con i monociti ne con i granulociti. fino agli anni 80 le sue ricerce non vengono riconosciute dall'opinione medica pubblica. queste sono le cellule dendritiche. utilizzò cellule dendritiche per curarsi dal tumore al pancreas, questo gli permise di vivere quasi 4 anni rispetto ai tre mesi di vita che questo tumore garantisce. sono cellule chiamate così per il loro criterio morfologico(dendriti: estroflessioni, interdigitazioni del citoplasma). queste cellule sono di derivazione mieloide, ma sono posizionate nella periferia dell'organismo. la periferia del nostro organismo è la cute le mucose. le cellule di langerhans sono delle cellule dendritiche cosa fanno le cellule di langerhans? presentano antigeni ai linfociti T, respondabili della risposta immune specifica. mentre la cellula dendritica si trova in periferia, il linfocita T si trova nel linfonodo, nella regione paracorticale di questo. se la cellula dendritica vuole presentare un antigene ad un linfocita devono incontrarsi da qualche parte. si è ipotizzato che la cellula dendritica, riconosciuto l'antigene, migrando raggiunge la zona paracorticale del linfonodo. la cellula migra e si va a posizionare nella zona paracorticale del linfonodo. questa migrazione avviene per chemiotassi, cioè è mediata da una o piu chemiochine. dato che la chemiotassi avviene contro gradiente, il fatto che la cellula si posizioni alla fine nella parte corticale ci dice che la chemiochina è posizionata nella parte paracorticale del linfonodo. dato che anche il linfocita vergine, appena creato viene attratto grazie a chemiochine nella parte paracorticale, è evidente che la chemiochina è la stessa sia per la cellula dendritica che per la chemiochina. quindi la cellula dendritica esprime lo stesso recettore per una citochina espresso da un linfocita T. 1

8 maturazione e migrazione la cellula dendritica in periferia riconosce un antigene, lo lega attraverso recettori per profili molecolari, e attraverso il vaso linfatico afferente raggiunge la regione paracorticale del linfonodo, andrà a riconscere ed attivare il linfocita presentandogli l'antigene. in seguito ad attivazione dall'antigene, la cellula dendritica acquisisce mobilità. però ha anche una perdita di capacità funzionali: durante la migrazione, nel linfonodo perde la capacità di riconoscere un antigene, per acquisire la proprietà di riuscire ad attivare il linfocita t nella maniera piu appropriata possibile. quindi durante questa migrazione si ha un vcambiamento di molecole di membrana: questo meccanismo prende il nome di maturazione della cellula dendritica. cellula dendritica immatura: posizionata in periferia; cellulla dendritica matura: ha già legato l'antigene e si trova nella regione paracorticale in attesa del linfonodo. in una cellula perfettamente matura, il processo di maturazione appena accennato è riferibile a cambiamenti di aspetti funzionali, che acquisiscono capacità diverse, già insite nella cellula maturata. questa maturazione in cosa consiste? e da cosa è innescata? la funzione è innescata da una interazione di un antigene con un recettore per profili molecolari (TLR, recettore per il mannosio, DC-sign, recettori spazzino, ect...) l'interazione ligando recettore innesca nella cellula dendritica il processo detto maturazione, composto da varie fasi e particolarità: una volta che ha internalizzato il microrganismo inizia ad attivare il citoscheletro per acquisire motilità, per andare verso il linfonodo (la cellula è guidata per chemiotassi); la cellula dendritica quindi, per essere guidata nella giusta direzione ha bisogno di un recettore per le chemiochine. questo recettore viene sintetizzato ed esposto solo quando avviene il legame con l'antigene (altrimenti la cellula sarebbe soggetta alle chemiochine senza aver legato nulla, e inizierebbe in vano la migrazione). il recettore detto è chiamato ccr7, e lega due chemiochine che sono CCL9 e CCL21 un altro aspetto della maturazione è che una volta che è stato iniziato il processo di fagocitosi ed è iniziata la migrazione, la cellula dendritica non ha più motivo di mantenere proteine con funzione di recettori per profili molecolari, che non vengono più esposte od espresse. MA al contempo ha necessità di esprimerne altre per l'interazione con il linfocita t la capacità di stimolare un linfocita t dipende dall'incrementata espressione di molecole fondamentali di membrana, queste molecole sono dette MHC2 complesso maggiore di istocompatibilità di classe2 le mhc1 sono espresse ubiquitariamente su tutte le cellule linfoidi, le mhc2 sono espresse nelle cellule con funzione di presentare l'antigene a linfocita t le cellule dendritiche espongono poche mhc1, e molte mhc2 ciò che il linfocita riconosce non è l'interno organismo, ma una piccola parte di esso di natura proteica, e per conoscerlo ha bisogno che il microrganismo sia associato ad un mhc2 sulla parete della cellula dendritica. quando parliamo di riconoscimento antigenico di linfocita t parliamo di questa proprietà del linfocita stesso il riconoscimento e l'internalizzazione di un antigene nella cellula dendritica è seguito da un processamento dell'antigene: digerirlo, estrapolarne proteine, da queste generare piccoli frammenti peptidici, e legarli al mhc2 ed esprimere il complesso sulla membrana. il linfocita t alla fine riconosce un piccolo pezzettino di pochi amminoacidi legati al mhc2 esposti sulla membrana (condizione necessaria ma non sufficiente all'attivazione del linfocita t). la cellula dendritica deve esprimere oltre mhc2 sulla membrana anche delle molecole con funzioni costimolatorie (CD 40, CD80 e CD86) che devono legare anche esse il linfocita T, inducendo un secondo stimolo al riconoscimento. per completare il processo di maturazione la cellula dendritica deve acquisira la prorietà di produzione di citochine. queste citochine determineranno, a seconda della loro natura prodotta, il tipo e/o anche l'entità della risposta inducendo una "maturazione" del linfocita T verso una determinata strada di risposta immuntiaria :il linfocita matura nel timo, in seguito a presentazione dell'antigene da parte della cellula dendritica tramite MHC2, imparando a riconscere un antigene in altre cellule dell'organismo solo sotto forma di PEPTIDE ASSOCIATO ALL' MHC1: mai sei il peptide è dissociato, o l'mhc1 non presenta peptidi all'interno 2

9 cellule stromali, migrazione e attivazione del linfocita t per migrare il linfocita t ha innanzi tutto necessità di legarsi, attraverso ad una l-selectina che lega un oligosaccaride esposto dalle cellule delle venule dell'endotelio alto; questo processo avviene affinchè possa attraversarlo con lo stesso procedimento con cui i fagociti migrano tra due cellule endoteliali nella loro migrazione. il linfocita t vergine che è partito dal timo ed è arrivato alla paracorticale è mantenuto in vita dalle cellule stromali del linfonodo grazie alla loro produzione di INTERLEUCHINA 7 le cellule stromali quindi assumono un ruolo attivo, diverso da quello che per tempo si è ipotizzato; infatti la produzione di chemiochine ed interleuchine è essenziale per l'attrazione di linfociti e cellule dendritiche, e per la sopravvivenza del linfocita in quella sede. le cellule stromali sono essenziali per il mantenimento della memoria immunologica affinchè un linfocita t si leghi ad una cellula dendritica in maniera appropriata devono avvenire una serie di interazioni, riassumibili in due generali interazioni: interazione tra mhc2 e il corrispettivo recettore dei linfociti t (segnale necessario ma non sufficiente) interazione costimolatorio (o secondo segnale) tra CD80 e CD86 della cellula dendritica con il recettore CD28 espresso dal linfocita T; questo è il segnale stimolatorio più importante. l'interazione di cd86 con cd28, in seguito all'attivazione del linfocita che si trovava vergine nel linfonodo, ha la funzione di stabilizzare il dna messaggero del linfocita T per l'interleuchina 2 e per il recettore della stessa interleuchina: cioè si evita che venga degradato, ed il segnale di questi rna messaggeri divengono stabili nel tempo, per un tempo sufficientemente lungo affinchè il linfocita prolifichi. quindi il linfocita dopo il legame sintetizza, grazie all'allungata emivita del mrna, sia la citochina stessa che il recettore per la citochina. il linfocita t inizia a produrre interleuchina 2, che gli serve per proliferare. come ogni chitochina, l'interlueuchina 2 deve legare sul linfocita un proprio recettore: interazione autocrina e paracrina se l'interazione avviene in maniera corretta il linfocita prolifera, si differenzia, ed è in grado di provvedere all'eliminazione del microrganismo. se l'intereazione non avviene in maniera corretta, coinvolgendo solo il primo segnale (MHC2 e recettore) può venire indotta l'apoptosi del linfocita T, o soprattutto l'anergia, cioè il linfocita T non sarà MAI PIU IN GRADO DI RISPONDERE A STIMOLI. se l'interazione non avviene in maniera corretta, coinvoltendo solo il secondo segnale (interazioni costimolatorie) può venire indotto l'arresto del ciclo cellulare del linfocita T la conseguenza funzionale tra queste due cellule è assolutamente differente se avviente interazione tra segnali stimolatori e costimolatori e se avvengono interazioni solo con segnali stimolatori tutti i fenomeni di immunologia non sono mai o soltato utili o soltanto dannosi. gli anticorpi ige causano allergie, e sono responsabili dei simoli delle allergie. allo stesso tempo queste ige ci proteggono da infezioni da particolari microrganismi,. tutti i fenomeni immunologici, come quelli biologici in generale, hanno sempre un lato positivo e uno negativo: di un solo elemento bisogna considerare le due faccie della medaglia. i segnali costimolatori sono molteplici: Interazione di icosl della cellula dendritica con icos del linfocita T; PD-l1 con PD1 del linfocita; in oltre sia pdl-2 e b7h3 della cellula dendritica sono altri tipi di recettori per interazioni costimolatorie. sul linfocita t vi sono circa 2 milioni di molecole recettoriali. affinchè sia possibile trasdurre, all'interno del linfocita almeno un milione di recettori deve essere legato all'antigene specifico per poter trasdurre un segnale sufficiente. quindi sulla cellula dendritica devono essere presentare almeno un milione di complesso mhc2 affinchè si possa indurre la risposta. la cellula denritica in realtà presenta solo 200 complessi. come può attivare un milione di recettori del linfocita t? meccanismo a ruota dentata: lega 200 recettori dal linfocita T, inizia a ruotare su se stessa a mo' di ruota dentata staccando alcuni recettori posteriori e lengandone altri anteriori. il legame tra complesso mhc2 e i recettori del linfocita t ha una affinità molto debole, quindi una Ka molto elevata, questo favorisce un distacco facilitato. 3

10 complesso maggiore di istocompatibilità nel cromosoma sei nell'uomo vi sono i geni che codificano per il complesso maggiore di istocompatibilità. esistono geni per molecola di istocompatibilità solo di classe prima e di classe seconda. le molecole per il mhc3 che si trovano nello stesso cromosoma non hanno un ruolo approssimabile a quello dei mhc1 e 2: i geni mhc3 codificano per diversi elementi che fanno parte del complemento (21-idrossilasi ad esempio, che non è neanche coinvolto nella risposta immunitaria) sono quindi chiamati mhc di classe 3 impropriamente. esistono 3 geni per mhc1 e 3 per mhc2. quindi ogni gene codifica per una proteina. se ogni cromosoma codifica 3 molecole per complesso, dato che abbiamo due cromosomi avremo 6 molecole per ogni tipo di complesso. le molecole mhc nell'uomo prendono il nome di HLA Human Leucotice Antigen. le tre molecole che compongono l'hla classe seconda saranno HLA-DP HLA-DQ e HLA-DR (hla-dr1 dal cromosoma di mamma e hla-dr4 dal cromosoma di papà). le tre molecole che compongono l'hla di classe prima saranno HLA-A, HLA-B e HLA-C. ogni HLA di classe prima è composta da due catene: alfa e beta la catena alfa è divisa in 3 domini: 1, 2 e 3.il dominio 3 è il più vicino alla membrana, e prende rapporti con essa, i domini alfa 1 e 2, che sono più lotani dalla membrana, si organizzano a formare una piccola tasca, all'interno della quale si lega l'oligopolipeptide antigenico da presentare al linfocita. la catena beta è identica in tutte le mhc di classe 1, ed è costituita dalla beta-2-microglobulina. il locus per questa proteina si trova su un altro cromosoma. gli HLA di classe seconda presenta qualche differenza: è sempre composta da due catene: alfa e beta; sia le catene alfa che beta presentano due domini. la tasca è formata sia da un dominio alfa che da un dominio beta; il locus per la sintesi della catena beta del complesso di classe seconda si trova sul sesto cromosoma; il dominio alfa 2 e beta 2 sono i più vicini alla membrana e prendono rapporti con essa; i domini alfa1 e beta 1 concorrono alla formazione della tasca di legame. la differenza sostanziale che si presenta nella tasca è che nella classe seconda il peptide è parzialmente esposto fuori dalla tasca, tra l'altro il peptide per la mhc di classe seconda è più lungo di quello di classe prima: un peptide che lega una molecola di classe prima è lungo generalmente da 7 a 9 amminoacidi; comunque non più lungo di 9 amminoacidi perchè la tasta è chiusa alle estremità. ma non tutti e sette hanno funzione di riconoscimento antigenico, alcuni amminoacidi sono necessari per fare i legami: sono due amminoacidi posti in posizione chiave e prendono il nome di residui di ancoraggio o residui ancora. tutti gli altri amminoacidi sono irrilevanti, possono essere sostituiti. classe due lega peptidi piu lunghi, in media amminoacidi, e dato che la tasca è bucata possono esserci residui di 30 amminoacidi. anche qui non tutti i peptidi sono essenziali, vi sono i soliti 3-4 amminoacidi di ancoraggio. le molecole di classe prima sono esposte su tutte le cellule nucleate dell'organismo le molecole di classe seconda sono espresse massimalmente nelle cellule dendritiche, linfociti B e cellule epiteliali del timo (quindi tutte le cellule con funzione di presentazione dell'antigene); le molecole di classe prima non sono essenziali solo nell'ativazione del linfocita, ma anche nella parte finale della risposta. ipotizziamo che il virus influenzale abbia infettato un individuo, e che un linfocita sia stato attivato contro questo antigene. il linfocita deve recarsi nel luogo d'infezione, deve riconoscere la cellula epiteliale infettata, e deve uccidere la cellula. nella discriminazione tra cellula infetta e cellula sana è essenziale mhc di classe 1. le cellule infettate, se nucleate, espongono mhc1 con il peptide antigenico, facendosi riconoscere dal linfocita. il linfocita matura nel timo, in seguito a presentazione dell'antigene da parte della cellula dendritica tramite peptide associato a MHC2, imparando a riconscere un antigene solo sotto forma di PEPTIDE ASSOCIATO ALL' MHC1: mai sei il peptide è dissociato, o l'mhc1 non presenta peptidi all'interno. 4

11 polimorfismo di MHC l'ultima delle caratteristiche dei mhc è il polimorfismo: presenza in una popolazione di numeriose varianti alleliche di uno stesso gene. la molecola più polimorfica è la molecola HLA B, della quale esistono 559 varianti alleliche molecole che differiscono tra loro per la sequenza amminoacidica). esempio: io esprimo 6 mhc1: 3 ereditate dal padre e 3 ereditate dalla madre. per quanto riguarda le molecole b esprimerò delle molecole che chiamoerò per convezione b1 quella di orginie paterna e b2 quella di origine materna. quanti esprimeranno la stessa molecola che esprimo io? non considerando legami di parentela (dato che la trasmissione di queste molecole è autosomica)? queste molecole sono essenziali nei trapianti di organo, in primis trapianto di midollo. se non vi è assoluta compatibilità il risultato sarebbe il rigetto dell'organo. si chiama di istocompatibilità perchè è il piu importante dei sistemi che determina la compatibilità istologica, compatibilità nei trapianti. la possibilità di riscontrare due individui non correlati con compatibilità istologiche è di 1 su un milione. la presenza di varianti alleliche è particolarmente spiccata per le molecole di classe prima. per la classe seconda, la molecola più polimorefica è HLA DR, in particolare la sua catena beta. le catene alfa presentano una variabilità molto minore rispetto alle beta. le differenze della variabilità sono identificabili soprattutto in una piccola porzione della molecola: nella tasca. la regione dove è localizzata la grande maggioranza della differenza tra le HLA di classe 1 è la tasca, in entrambe le catene alfa. dato che nella hla classe seconda la tasca è formata da due catene, vi sono altre differenze: la variabilità riguarda solo la catena beta. quindi, una variabilità ancora più selettiva. il fatto che la tasca di due molecole abbia differenze sostanziali, fa si che queste molecole non possono legare lo stesso peptide: alcune molecole avranno una maggiore specificità per qualcosa, altri per qualcos'altro ATTRAVERSO PEPTIDI DI ANCORAGGIO SPECIFICI PER GLI MHC DI UN PARTICOLARE INDIVIDUO: questo accade a causa della regolazione genetica della risposta immune. avendo 6 mhc1 e 6 mhc2, dato che un individuo può essere omozite o eterozigote, per quanto riguarda le molecole di istocompatibilità l'omozigosi implica il fatto che molecole codificate da geni che si trovano sullo stesso locus di cromosomi omologhi siano uguali; l'eterozigosi per queste molecole implica la differenza dei geni nei cromosomi omologhi; quindi avrò un tipo di hla b1 e un tipo hla b2. per quanto riguarda la risposta immunitaria, chi è in vantaggio? sicuramente l'eterozigote: infatti l'eterozigosi da vantaggio selettivo per quanto riguarda le molecole hla. infatti si sostiene che nel corso del'evoluzione tutti coloro che avevano omozigosi per certe hla non sono riusciti a sopravvivere a particolari tipi di infezioni. si racconta di un intera popolazione delle odierne antille olandesi che sarebbe morta a causa dell'omozigosi di alcune hla, che non sarebbero state in grado di resistere all'agente eziologico della malaria. la possibilità di legame dell'eterozigote è maggiore rispetto a quella dell'omozigote. buco del repertorio: nel repertorio delle molecole di istocompatibilità possono esserci dei buchi, cioè possono esserci peptidi che non possono essere legati neanche in eterozigosi. questo fenomeno è molto raramente osservabile. 5

12 sintesi di MHC di classe prima e processamento dell'antigene nella cellula dendritica il processamento di determinati organismi produrrà dei peptidi che si possono legare ai processi di istocompatibilità APPARTENENTI SOLTANTO a quel determinato individuo, data la grande varietà allelica data dal polimorfismo. se in seguito a processamento del virus influenzale il complesso mhc del mio corpo lega un peptide particolare; a parità di virus, il processamento che subirà lo stesso virus in un altra persona produrrà un peptide diverso che sarà in grado di essere legato dal mch della persona stessa. la molecola di classe prima viene sintetizzata nel reticolo prima tappa: sintesi della catena alfa, e legame di questa alla calnexina (una chaperonina accompagnatrice). che se la tiene legata nel reticolo endoplasmico fino alla sintesi della beta, 2-microglobulina; che costituisce la catena beta nelle molecole di classe prima.ricordiamo che le catene alfa sono polimorfiche nei complessi di classe 1, mentre le catene beta sono rappresentate dalla beta-2-microglobulina. nel momento in cui viene sintetizzata questa beta 2-microglobulina si etra nella seconda tappa seconda tappa: la catena alfa si dissocia dalla calnexina, e (la catena alfa) e si lega alla beta due microgrobulina formando la molecola di classe1; nel reticolo alcune molecole, in particolare la tapasina, porta la molecola di classe prima a contatto con strutture della membrana del reticolo chiamate tap: trasportatore di peptidi. i peptidi che possono presentare le molecole di classe prima sono adibite alla presentazione di peptidi generati da qualcosa che ha sede intracellulare (organismo fagocitato, o in generale intracellulare come tipicamente i virus; la cellula tumorale in oltre assume caratteristiche diverse dalla cellula normale che la possono anche rendere antigenica). i peptidi antigenici vengono generati nel citosol ad opera di una struttura multimolecolare chiamato proteasoma. le proteine penetrano nel proteasoma, vengono digerite e vengono generati peptidi antigenici. il trasportatore di peptidi TAP, prende i peptidi e vengono trasportato all'interno del reticolo endoplasmico. uno o due di questi peptidi legeranno la tasca della molecola di classe prima. questa si stacca da tutte le altre proteine (sia tapasina che tap) e attravesco una vescicola si posiziona sulla membrana cellulare. l'esposizione di questo complesso interagisce con i recettori di un linfocita T CD8 citotossico, che induce l'uccisione della cellula bersaglio. l'uccisione della cellula deve rispettare delle caratteristiche ben precise affinchè parassiti non escano ed invadano l'organismo. 6

13 sintesi di MHC di classe seconda mentre classe 1: processamento e presentazione di peptidi generati in sede intracellulare, classe 2: processamento e presentazione di peptidi generati in sede extracellulari nel R.E si sintetizzano sia la catena alfa sia la catena beta insieme. può accadere che dei peptidi self si possano già legare alla molecola di classe seconda: per impedire questo interviene un meccanismo molecolare "Ii" catena invariante. la catena invariante impedisce che eventuali peptidi self si vadano a legare alla tasca della molecola di classe 2. è un meccanismo di tutela. la mhc2 con la catena invariante, attraverso una vescicola va nel citosol e si fonde con un endosoma. dentro l'endosoma si trovano degli enzimi, delle proteasi in particolare. man manco che il l'endosoma matura, e acidifica il suo ph, le proteasi digeriscono la catena invariante. la catena invariante è idrolizzata tutta meno che la porzione che è all'interno della tasca. questo frammento che rimane a proteggere la tasca è chiamato CLIP. (piccola porzione di Ii, che rimane legata alla tasca di mhc2). al contrario di mhc di classe1, le molecole di classe seconda presenteranno molecole che si trovano in genere in sede extracellulare. molecola esogena viene internalizzata, e la vescicola processa i peptidi e li prepara con il legame con mhc2, e si fonde con la vescicola che contiene mhc2. ma mhc2 ha hancora la clip. una molecola chiamata HLA-DM prende clip, e lo toglie dalla tasca, libera la tasca, e permette ad un peptide antigenico batterico di legarsi alla tasca. ora il complesso con il peptide nella tasca si sposta sulla membrana, e sarà pronto ad interagire con il recettore di alcuni linfociti T, in particolare i linfociti T CD4 Helper: questi non hanno funzioni effettrici immediate, ma aiutano i macrofagi (e i linfociti b) e tutte le altre cellule dell'organismo attraverso la produzione di citochine. grazie a questa produzione può collaboare con tutte le altre cellule dell'organismo in svariate maniere. la vera cellula effettrice però non è il linfocita Helper. mhc1 attivano linfociti citotossici, mhc2 attivano linfociti helper: quindi questi due sistemi attivano diversi tipi di risposta immunitaria. ogni complesso attiva la risposta migliore possibile di un determinato organismo, a se conda se intra o extracellulare. 7

14 recettori dei linfociti B i linfociti b utilizzano come recettore di membrana degli anticorpi (immunoglobuline). l'anticorpo stesso è anche la molecola che secernono una volta attivati per eliminare un microrganismo. è composto da due catene, una alfa e una beta. ogni catena è composto da due domini: C(vicina alla membrana) e V(quella più lontana) c=costante, V=variabile. vi è anche una porzione intramembranaria, una transmembranaria e una intracitoplasmatica (che serve per la trasduzione del segnale) la porzione intracitoplasmatica è molto corta rispetto a quella esterna alla cellula. dato che è corta avrà difficoltà nelle attivazioni di secondi messaggeri. il fatto che la porzione intracitoplasmatica sia talmente corta che non possa essere trasdotto il segnale, fa si che debbano cooperare altre molecoe. le molecole che si integrano con questo recettore sono sei molecole chiamate molecole del complesso CD3: formata da 6 catene (epsilon, delta - gamma, epsilon - e due catene ZETA) le catene zeta sono le piu importanti per la trasmissione di segnale cd3 è una molecola che utilizziamo per identificare tutti i linfociti t. se vogliamo sapere quanti linfociti ci sono in un tessuto sfruttiamo l'espressione di questa molecola. soltanto i linfociti t esprimono sulla membrana questa molecola cd3. le catene di cd3 hanno sequenze nelle regioni intracitoplasmatiche, dette sequenze ITAM, che identificano dei segnali di attivaizone (IMMUNORECETTOREN RICCO DI TIROSINA ASSOCIATO AlLLA MEMBRANA) vi possono essere anche delle sequenze ITIM che trasducono segnali inibitori. le sequenze itam sono presenti in tutte e sei le molecole di CD3; le catene zeta, che sono le molecole con coda intracitoplasmatica più lunga presentano tre sequenze itam per ogni catena. nell'ambito della porzione variabile del recettore in cui la variabilità è particolarmente sostenuta: è così sostenuta che vengono definite regioni ipervariabili, che sono in tutto tre nelle catene alfa, e tre regioni ipervariabili nella catena beta. queste tre regioni prendono il nome di regioni CDR, e vengono indicate con CDR1 2 e 3. CDR significa regione che determina la complementarietà. queste regioni formano il sito del recettore che lega il complesso peptide-mhc. a formare il sito quindi concorrono una piccola parte delle catene beta e una piccola parte delle catene alfa. la CDR3, che è la regione più variabile di tutte, è la porzione del recettore che prende più intimamente contatto con il complesso peptide-mhc, corrisponde quindi realmente al sito di contatto con il ligando sia le catene alfa che le catene beta contribuiscono a formare i complessi CDR1, 2 e 3. sappiamo che esistono 10^18 recettori alfa-beta. sappiamo che il genoma contiene 10^4 geni per i recettori. come può un numero così piccolo di geni codificare per tutti questi recettori? 8

15 ricombinazione somatica grazie ad un fenomeno detto ricombinazione somatica (Susumo Tonegawa, premio nobel, attualmente il rettore del MIT) Susumo ci ha spiegato come viene generata questa diversità di recettori, con un esperimento molto semplice che fece negli anni 70 in svizzera, che era l'unico paese dove fosse consentito fare esami sul dna. un gene C e un gene V si trovano molto distanti l'uno dall'altro in una cellula qualsiasi; in un linfocita i geni C e V sono giustapposti: nella maturazione di una cellula, di un linfocita, due geni che si trovano molto distanti tra loro, nel momento in uci la cellula staminale decide di maturare, due geni si posizionano uno accanto all'altro: questo fenomeno si chiama ricombinazione somatica o riarrangiamento. mentre la porzione varbiabile della catena alfa è sintetizzata da due geni V e J, la porzione della catena variabile beta è sintetizzata da 3 geni V, J e D. in una cellula staminale midollare la differenziazione verso la serie linfocitaria T, riguardo la ricombinazione genica, accade la ricombinazione somatica in manieara del tutto casuale. in un singolo linfocita T, casualmente, un gene V e un gene J(joining) si giustappongono grazie a degli enzimi detti ricombinasi (rag1 e rag2), formando la ricombinazione V-J. tutto ciò che c'è tra il vj riarrangianto ed il gene costante viene eliminato per splicing, e il gene VJ viene unito al gene C per la porzione costante: questo porta alla sintesi di una catena alfa. dato che nella catene beta vi sono 3 geni, sono necessari due riarrangiamenti. il primo riarrangiamento riguarda J e D, e il segmento J-D viene giustapposto a V, con conseguente formazione di V-D-J. quindi verràm spliceato tutt ciò che si trova tra la porzione VDJ e la porzine variabile, e da questo nasceranno delle catene beta una volta che sono sintetizzate le catene alfa e beta, possono essere esposte sulla membrana per formare un recettore maturo. in questo modo possiamo avere un numero di ricombinazioni possibili pari a 1352 combinazioni beta e 4275 combinazioni alfa. tutti i possibili recettori combinati possono avere circa combinazioni. mancano ancora 10^13 combinazioni. come possono arrivare a tanti? i fenomeni di giustapposizione non sono mai precisi, anzi sono talmente sbagliati che molto spesso c'è la necessità per fare appaiare due estremi di aggiugere qualche nucleotide o di tagliarne qualcuno: fenomi di n-addiction o n-delection. la diversità creata viene denominata diversità giunzionale, perchè si verifica tra le giunzioni di VJ e VDJ. la diversità giunzionale genera il grosso della variabilità dei recettori. 9

16 maturazione dei linfociti T una cellula staminale si orienta verso una linea di differenziazione grazie alla presenza, nel midollo osseo, di fattori di crescita, la gran parte dei quali sono prodotti in loco dalle cellule stromali del midollo osseo. interleuchina 7 : coinvolta nella maturazione, e nel mantenimento della vtalità dei linfociti t nella paracorticale del linfonodo. questa è la citochina che al livello del midollo osseo più di tutte determina la differenziazione di una cellula staminale a linfocita (T, helper e forse b). l'interleuchina è prodotta dalle celule stromali del midollo osseo. perchè non siamo sicuri che intervenga anche nella maturazione dei linfociti b? si genera un topo knok-out per quella molecola o quel recettore, cioè un topo che può far tutto tranne produrre una molecola selezionata. e così possiamo studiare come si omporta un organismo in assenza di alcune molecole. quindi esistono topi knok-out per l'interleuchina 7 o per il suo recettore. questi topi non ha linfociti T, B e natural killer. è un topo immunodeficiente. da questo studio deduciamo che l'interleuchina è essenziale per la maturazione dei linfociti. una malattia può rendere un uomo "knok-out" per certe molecole, e può indurre delle immunodeficienze a causa di errori nella sintesi dell'interleuchina 7. nell'uomo che deficita di interleuchina 7 non vi sono linfociti fuorichè linfociti B. per il linfocita t questa citochina è importante; mentre tutte le cellule maturano nel midollo, nel linfocita t la maggior parte della maturazione del linfocita t matura nel TIMO (linfocita T(imo)). linfocita t fuoriesce immaturo dal midollo osseo. non è considerabile linfocita t ancora, finchè non completa la fase maturativa nel timo, dove acquisirà funzioni e caratteristiche molecolari di riconoscimento dell'antigene. queste caratteristiche di differenziazione nel timo passano attraverso due fasi:selezione positiva e selezione negativa, che si realizzano in diverse sedi del timo. il linfocita t per maturare attraverserà tutte le parti del timo, interagendo con molte cellule (residenti o meno) secondo tappe ben precise. una cellula che il linfocita t immaturo incontrerà è la cellula epiteliale della corticale del timo, con la caratteristica di esprimere molecole MHC1 E ANCHE MOLECOLE DI CLASSE SECONDA. se arriviamo alla giunzione corticomidollare il linfocita interagisce con delle cellule dendritiche, che non sono cellule epiteliali, sono di origine mieloide, e quindi non residenti, che esprimono MHC1 e 2. successivamente il linfocita incontra cellule epiteliali della midollare del timo. anche queste cellule esprimono sia molecole di classe prima, come normalmente atteso, ma anche molecole di classe 2. cellule epiteliali della corticale, della midollare e dendritiche svolgono un ruolo fondamentale nella maturazione del linfocita t. la cellula che perviene nel timo non è assolutamente destinata a diventare necessariamente un linfocita è chiamata precursore timico precoce, che può diventare linfocita natural killer (si è scoperto recentemente che può diventare linfocita b), monocita, una cellula dendritica (può orientarsi sia in senso linfoide che mieloide) ecc.. questa cellula inizia a maturare e la identifichiamo con la sigla DN che significa cellula doppio negativo; doppio negativo significa che non esprime due molecole di membrana: CD4 e CD8. l'assenza di queste molecole essenziali per l'identificazione di un linfocita è indice di generalizzata mancanza di tutte le caratteristiche di membrana che sono associate ai linfociti. questa cellula doppionegativa è caratterizzata da un elevata proliferazione proteica intracellulare, in quanto "blasto". questa elevata proliferazione può portare ad errori nella duplicazione e indurre apoptosi. il 95% di tutti i precursiori che arrivano nel timo dal midollo muoiono per apoptosi per "negligenza del timo". c'è una sola possibilità che il linfocita t non muoia, e possa maturare:che abbia la possibilità di interagire con le cellule epitali della corticale. un doppio positovo esprime entrambe le proteine, un singolo positivo ne esprime una soltanto. esistono diverse fasi maturative: DN1, DN2a, DN2b ecc... in una fase chiamata stadio DN3 la cellula smette di essere pluripotente, quindi il vero e proprio orientamento avviene nel timo quando la cellula ha già iniziato a differenziare il primo segnale nello stadio dn3 che fa capire che sta differenziando per linfocita è che si ha un riarrangiamento nel gene per la catena beta del recettore mhc. la cellula, a questo punto, ha una sotto- scelta di differenziazione: se il riarrangiamento prodotto è un riarrangiamento produttivo, si riarrangerà anche il gene per la catena alfa e ne conseguirà la sintesi di recettori alfa-beta; se il riarrangiamento di beta non è produttivo, è possibile operare dei riarrangiamenti per esprimere dei recettori gamma-delta (invece che formati da alfa-beta). 10

17 selettività positiva selezione negativa a questo punto allo stadio doppio negativo segue direttamente uno stadio doppio positivo dopo itnerazione con le epiteliali della corticale: nella corticale questa cellula in maturazione interagisce con cellule epiteliali della corticale che esprimono sulla membrana molecole di istocompatibilità di classe 1 e 2. questi complessi espongono dei peptidi-self (o timici) che pervengono al timo tramite sangue o linfa (che derivano dal sangue, dalla linfa etc). questa interazione salva il linfocita t dalla morte programmata. l'interazione tra un dato linfocita maturativo con i complessi mhc1 o 2 che esprimono peptidi self è assolutamente aleatoria. poichè il risultato finale di queste interazioni producono la "salvezza" della cellula, queste prendono il nome di selezione positiva. questo è un processo di educazione chimica: il linfocita impara che da maturo dovrà riconoscere l'antigene in forma di peptide legato a mhc 1 o 2 (restrizione genetica a livello dell'antigene); il linfocita deve imparare a stinguere self e non self. il risultato della selezione positiva darà che per la semplice intearzione con cellule epiteliali della corticale che espongo peptidi-self da mhc1 e 2 renderà il linfocita t capace di riconoscere peptidi non-self..come fanno poche centinaia di recettori mhc self a educare al riconoscimento di 1*10^18 non self? come fa un self a educare il riconoscimento di un non-self? la cellula che ha subito la selezione positiva, a livello della giunzione corticomidollare, adesso inizia ad interagire con le cellule dendritiche. i linfociti t che interagiscono ad alta affinità con le cellule dendritiche muoiono per apoptosi. questa è detta selezione negativa. la conseguenza della selezione negativa è l'eliminazione di linfociti che presentano recettori ad alta affinità per cellule self, quali le cellule dendritiche. questo meccanismo contribuisce alla tolleranza delle nostre strutture. viene chiamato tolleranza immunologica: eliminazione di linfociti t ad alta affinità per le strutture self. i linfociti a bassa e media affinità sopravvivono e diventano maturi. dopo l'interazione con le cellule dendritiche il linfocita diventa o solo cd4 positivo o solo cd8 positivo. un linfocita è doppio positivo solo a livello della corticale. la doppiapositività è indotta da un programma della cellula, che produce oltre i riarrangiamenti dei geni per le catene beta-alfa, causa la sintesi dei recettori CD di membrana. come fa il timo ad esprimere antigeni self, inclusi antigeni self tessuto-specifici, propri di alcuni tessuti specializzati? come facciamo a diventare tolleranti a questi antigeni? un gene espresso dalle epiteliali della midollare del timo permette l'espressione nel timo di peptidi tessuto-specifici. il gene si chiama AIRE: gene regolatore di processi autoimmunitari, è un gene espresso dalle cellule epiteliali della midollare. AIRE codifica per un fattore di trascrizione che permette la trascrizione di geni codificanti per peptidi tessuto specifici. (domanda della prova in itinere: dove è espresso aire? sulle cellule epiteliali della midollare). dal punto di vista anatomico aquisiamo che la selezione negativa prosegue anche nella midollare, dove il linfociti t con recettori ad elevata specificità per peptidi tessuto-specifici, espressi nelle epiteliali della midollare che eprimono aire, vengono eliminati. mutazioni di aire costituiscono conseguenze di immunodeficienza generalizzata: la malattia è autosomica recessiva, il gene per aire si trova sul cromosoma 21. questa malattia interessa molteplici ghiandole endocrine: APS. AIRE NON è ESPRESSO COSTITUTIVAMENTE: AIRE VIENE ESPRESSO IN SEGUITO A INTERAZIONI DELLE CELLULE EPITELIALI DELLA MIDOLLARE CON UN LINFOCITA CHIAMATO LINFOCITA TIMICO INDUTTORE, CHE SAPPIAMO ESSERE UN LINFOCITA NATURAL KILLER, attraverso il segnale che è dato da l'interazione tra RANKL e il legando di RANKL. questa interazione fa si che si esprima AIRE. man mano che la cellula epiteliale della midollare esprime aire, aumenta l'espressione di antigeni tessuto ristretti, cioè antigeni non ubiquitari, la cui espressione è ristretta ad alcune cellule di alcuni tessuti. 11

18 modalità di induzione della selezione un meccanismo legato all'affinità di legame tra il complesso peptide mhc ed il recettore del linfocita: non sappiamo con certezza sia vero. parliamo di ipotesi. sta di fatto che chi interagisce si salva, chi non interagisce muore. solo il 5% ha la possibilità di interagire con peptidi mhc-self. anche nella selezione positiva il risultato della selettività è data dall'affinità di legame. se è estremamente bassa o estremamente alta viene eliminato il linfocita nascente. l'affinità di legame deve essere intermedia, affinchè il linfocita sia selezionato correttamente. il modello oggi più accettato è il modello di affinità di legame per spiegare i fenomeni di selezione sia positiva che negativa. un'affinità intermedia induce il linfocita a proseguire nella sua maturazione. immaginamo che la selezione positiva e negaticva siano due eventi che avvengano in successione: non c'è nessuna prova che sia vero, queste selezioni potrebbero avvenire comtemporaneamente. selezione positiva:primo aspetto: abbiamo detto che dobbiamo selezionare 10^18 recettori. quindi dovremmo avere 10^18 peptidi self nelle cellule del timo, nel caso in cui il rapporto fosse 1:1. ma non è così. come avviene quindi la selezione positiva? è un metodo stocastico, che un singolo complesso mhc può selezionare più di 100 recettori differenti. questo può essere utile a spiegare un altro fenomeno: il sorcio pacchione. secondo aspetto: il ruolo del peptide self non si esaurisce solo nel timo, è utile anche in periferia. lo stesso peptide che ha indotto la maturazione nel timo si trova in periferia, nel linfonodo, e funge da co-stimolatore dei linfociti. terzo aspetto: il topo pacchione di 5kg. in periferia abbiamo 10^18 recettori. questi dovrebberoessere in grado di riconoscere tutti i potenziali peptidi non self che penetrano nel nostro organismo. il problema che nasce è che il numero di potenziali peptidi di origine microbica può essere di gran lunga maggiore a 10^18. quindi abbiamo un numero di recettori specifici inferiore ai peptidi antigenici. il topo pacchione ha un linfocita per ogni peptide batterico. per questo pesa 5kg invece che 20gr. avessimo un numero di linfociti tali nella condizione che ogni linfocita possa riconoscere un solo peptide antigenico peseremmo centinaia di chili. nell'uomo un linfocita non riconosce un solo peptide, ma molti: CROSS-REATTIVITA', questa cross-reattività naturalmente può portare a degli errori: degli antigeni self potrebbero non essere riconosciuti. il rigetto di alcuni trapianti avviene a causa anche della cross-reattività. quarto aspetto: per il processamento di peptidi per il complesso mhc 1,bisogna usare un proteosoma. il proteosoma delle cellule epiteliali della corticale è particolare, ed è presente solo in queste cellule; questo proteosoma così specifico prende il nome di timo-proteosoma, che è molto più complesso del proteosoma delle cellule dendritiche. per il complesso mhc2 il peptide viene processato da un solo ed unico enzima che si trova in un endosoma di una cellula epiteliale della corditale: si chiama catepsina-l. nelle cellule dendritiche invece c'erano molte proteasi, e molte proteine. il fatto che intervenga solo un enzima comporta che i peptidi antigenici siano un numero ristretto rispetto ai peptidi antigenici che potrebbe processare un a cellula dendritica. N.B.: aspetto 4 possibile domande della prova. 12

19 il risultato finale della selezione timica le molecole di classe prima presentano peptidi di piccola dimensione a linfociti cd8 o citotossici. l'espressione di cd8 ha qualcosa in relazione con il timo. il precursore che viene nella corticale è all'inizio doppio negativo, che non esprime ne cd4 ne cd8. dopo aver superato la fase dn4 diventa doppio positivo nella zona corticale del timo dopo di che il linfocita diventerà singolo positivo. la funzione di riconoscimento di queste cellule viene acquisita nel timo ad opera della selezione timica. cd4 e cd8 sono popolazioni rispettivamente di linfociti helper (aiutano i macrofaci i linfociti b, i linfociti cd8), e i linfociti cd8 hanno una funzione effettrice diretta: uccidere una cellula bersaglio, natural killer. in realtà cd4 e cd8 non identificano una funzione: cd4 e cd8 servono ad altre cose. cd4 lega la porzione costante di mhc2, mentre cd8 lega le porzioni costanti di mhc1. da cio possiamo dedurre che sia i linfocti cd4 che cd8 però riconscono antigeni di natura proteica. la capacità di poter riconoscere un antigene associato ad un certo mhc è chiamata restrizione genetica del riconoscimento dell'antigene: i cd4 sono ristretti per classe 2, i cd8 sono ristretti per classe1. tutti gli antigeni sono di natura proteica? se per caso in periferia ognuno di noi avesse dei linfociti t che non esprimono ne cd4 ne cd8? tutti gli antigeni di natura microbica sono proteici? pensiamo a batteri la cui maggior parte del corpo batterico è composta da lipidi. quindi non tutti gli antigeni sono di natura proteica. nei confronti di antigeni di natura lipidica o glicolipidica non siamo in grado di rispondere? in periferia riscontriamo linfociti t doppio negativi (non esprimono ne cd4 ne cd8), evidentemente dato che questo linfocita non è in grado di riconoscere peptidi associati ne a mhc1 ne a mhc 2, riconoscerà qualcos'altro. dal timo avremo anche diverse popolazioni di linfociti doppionegativi: queste popolazioni sono 5 che emergono dalla selezione positiva e negativa, che poi, una volta maturati vanno nei linfonodi della milza. più del 50% dei linfociti t sono linfociti cd4 helper. questo è importante dal punto di vista pratico. i linfociti cd8 rappresentano circa il 30% della popolazione di linfociti t. una percentuale minore di linfociti t sono doppio negativi, che non esprimono ne cd4 ne cd8. una di queste popolazioni si caratterizza per il fatto che esprime un recettore che non è quello alfa-beta, ma è un recettore gamma-delta. il recettore espresso prende quindi il nome di recettore gamma-delta, conferendo ai linfociti il nome di linfociti gamma-delta (meno del 5% della popolazione di linfociti t). altre due popolazioni di linfociti t sono doppio negative ma esprimono un recettore alfa-beta; una di queste due popolazioni svolge delle funzioni simili a quelle dei recettori natural killer e a quelle dei linfociti t. dato che questa popolazione ha caratteristiche simili alle due popolazioni questa popolazione prende il nome di Natural Killer T (NKT). le tre popolazioni doppionegative, dato che mancano di cd4 e cd8 non possono quindi riconoscere antigeni di natura proteica. 13

20 linfociti alfa-beta doppionegativi processamento dei glicolipidi per i linfociti a-b DN sia quelli classici sia i natural killer t riconoscono glicolipidi: antigeni con una componente glicidica e una coda lipidica. non li riconoscono da soli, ma quando sono associati ad una molecola molto simile alle molecole mhc1. anche questa molecola, chiamata cd1 è un dimero alfa beta: la catena alfa è formata da 3 domini, e la catena beta da un solo dominio di beta 2 microglobulina. la tasca è formata dalle due catene alfa. questa tasca è molto più profonda rispetto a quella della mhc1 perchè deve alloggiarvi la coda lipidica. la profondità della tasca è ciò che differenzia sostanzialmente queste molecole. la tasca di CD1 LEGA SOLO LA PORZIONE LIPIDICA. IL GLICIDE RIMANTE ALL'ESTERNO DELLA TASCA. un esempio di una molecola, la prima sintetizzata, riconosciuta dai NKT è la alfa galattosilcerammide. questa molecola esiste solo nelle spugne di mare. ci si è chiesti perhè madre natura ci avesse fornito protezione contro le spugne di mare. 0_0 allora perchè abbiamo questo recettore dato che la molecola non è presenta altrove in natura? una parte della molecola antigenica, il lipide, si inserisce nella tasca. il recettore alfa-beta riconosce soltanto il glidice. la molecola simile alla alfa galattosilcerammide è la beta galattosilcerammide, molto abbondante nel snc. verosimilmente il fenomeno per cui viene riconosciuta l'alfa galattosilcerammide è un fenomeno di cross-reattività. in realtà il vero ligando è la beta galattosilcerammide. la alfa galattosilcerammide è stata sintetizzata, forse per sbaglio, in un laboratiorio di una fabrica di birra asiatica (Kirin). quando ha scoperto che a che serviva questa molecola ha iniziato la produzione su scala industriale perchè questa molecola stimoli i recettori cd1 durante tumori, rendendoli più reattivi a cellule tumorali mentre molecole di hla hanno molte varianti alleliche, cd1 presenta solo 4 varianti alleliche :CD1a CD1b CD1c e CD1d. queste variazioni alleliche riguardano piccole variazioni a livello dei domin alfa1 e 2. inlfuenza in pratica il tipo di glicolipide che si può legare. i linfociti alfa-beta classici riconoscono glicolipidi associati a molecole cd1 a, b, c. i NTK riconoscono glicolipidi associati a CD1d. come avviene il processamento dei glicolipidi? cd1 è espresso prevalentemente dalle cellule dendritiche. l'espressione di cd1 non è costitutiva. processamento che avviene in due fasi: prima parte: quello che accade fisiologicamente è che cd1 viene sintetizzata a livello endoplasmico, legando un lipide endogeno. legato questo glicolipide va sulla membrana. il complesso glicolipide-cd1 è altamente instabile, cioè tendono a dissociarsi rapidamente: la molecola è così instabile che il complesso si divide. cd1 viene riciclata attraverso AP2 e AP3, dentro degli endosomi, e viene quindi condotta in un lisosoma. può capitare che non tutto il glicolipide si sia dissociato, e cd1 arrivi al lisosoma con una porzione di glicolipide endogeno ancora legato. seconda parte: all'interno del lisosoma una molecola chiamata saposina (nelle mhc questa funzione è data da HLACM) toglie il glicolipide endogeno, ed inserisce nella tasca un glicolipide esogeno, proveniente da un microrganismo. cd1 va di nuovo esposto sulla membrana in attesa di un legame con un linfocita t a-b DN. NKT dopo il legame produce citochine e uccide. 14