David Caramelli Dipartimento di Biologia Evoluzionistica Laboratori di Antropologia.

Transcript

1 Nuovi metodi di analisi negli studi sul DNA antico David Caramelli Dipartimento di Biologia Evoluzionistica Laboratori di Antropologia UnitàdiAntropologia Molecolare /Paleogenetica, Università difirenze Piacenza 2012

2 sviluppare un percorso che va dal recupero del reperto agli esperimenti in laboratorio e all interpretazioni t i i didti dei dati

3 Il recupero

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19 In lb laboratorio

20 WORK FLOW

21

22

23 +

24 Illumina GA2 ~10 8 fragments per run GS20 ~10 5 fragments per run ABI 3730 ~10 2 fragments per run

25 PRIMER L PRIMER H

26

27

28 Ovviamente analizzare il DNA da reperti antichi non è facile a causa della degradazione del DNA

29 Che cosa è il DNA antico Nel mezzo del cammin di nostra vita mi ritrovai per una selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa dura esta selva selvaggia e aspra e forte che nel pensier rinova la paura! Tant'è amara che poco è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte. Io non so ben ridir com'i' v'intrai, tant'era pien di sonno a quel punto che la verace via abbandonai. Nel selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte che la verace via abbandonai. DNA moderno DNA antico

30 Nel mezzo del cammin di nostra vita mi ritrovai per una selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa dura esta selva selvaggia e aspra e forte che nel pensier rinova la paura! Tant'è amara che poco è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte. Io non so ben ridir com'i' v'intrai, tant'era pien di sonno a quel punto che la verace via abbandonai.

31 Nel selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte che la verace via abbandonai.

32 Nel selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte che la verace via abbandonai.

33 Nel - Imagine there's no heaven I' It's easy if you try No hell below us Above us only sky, Imagine all the people Living for today selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa ثم الى ربكم ترجعون * ولو ترى اذ المجرمون - è più رؤوسھم عند ربھم ربنا ابصرنا وسمعنا morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte. Respiri piano per non far rumore ti addormenti di sera ti risvegli con il sole sei chiara come un'alba sei frescacome come l'aria laria che la verace via abbandonai.

34 Nel - Imagine there's no heaven I' It's easy if you try No hell below us Above us only sky, Imagine all the people Living for today selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa ثم الى ربكم ترجعون * ولو ترى اذ المجرمون - è più رؤوسھم عند ربھم ربنا ابصرنا وسمعنا morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte. Respiri piano per non far rumore ti addormenti di sera ti risvegli con il sole sei chiara come un'alba sei frescacome come l'aria laria che la verace via abbandonai.

35 Nel - Imagine there's no heaven I' It's easy if you try No hell below us Above us only sky, Imagine all the people Living for today selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa ثم الى ربكم ترجعون * ولو ترى اذ المجرمون - è più رؤوسھم عند ربھم ربنا ابصرنا وسمعنا morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte. Respiri piano per non far rumore ti addormenti di sera ti risvegli con il sole sei chiara come un'alba sei frescacome come l'aria laria che la verace via abbandonai.

36 Nel - Imagine there's no heaven I' It's easy if you try No hell below us Above us only sky, Imagine all the people Living for today selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa ثم الى ربكم ترجعون * ولو ترى اذ المجرمون - è più رؤوسھم عند ربھم ربنا ابصرنا وسمعنا morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte. Respiri piano per non far rumore ti addormenti di sera ti risvegli con il sole sei chiara come un'alba sei frescacome come l'aria laria che la verace via abbandonai.

37 Quindi è molto complicato studiare il DNA antico ma non impossibile! Qualità del materiale biologico di partenza Problema delle contaminazioni che Problema delle contaminazioni che possono portare a dei falsi risultati

38 Ancient DNA lab

39 Classical approach: PCR, Cloning, and sequencing

40 Classical approach: PCR, Cloning, and sequencing Limits: Ancient Human DNA Only a maximum of several thousand base pairs A big amount of fossil material in the DNA extraction

41 Humans : a lot of problems if the sample is not directly excavated and if we don t known the taphonomic history

42 How to work with the classical approach Homo sapiens Neandertal Taphonomic history Loci mtdna, ndna Sequences comparing Ok? Ok mtdna Taphonomic history Loci ndna Sequences comparing Ok? Recovering ancestral alleles Ok?

43 I dati e le analisi

44 0 1 H. sapiens H. neanderthalensis H. heidelbergensis H. antecessor H. floresiensis ybp H. erectus Au. habilis Au. rudolfensis P. boisei P. robustus 2 H. ergaster Au. garhi 3 4 unknown Anatomically modern Homo Au. bahrelghazali K. platyops Au. anamensis Au. africanus Au. afarensis P. aethiopicus Ar. ramidus 5 Ar. kadabba Pre-modern Homo Millions of Years Ago Transitional hominins Megadont archaic hominins Archaic hominins Possible and probable early hominins S. tchadensis O. tugenensis

45 Homo floresiensis Homo sapiens Homo neandertalensis Homo erectus Homo heidelbergensis

46 Homo floresiensis Homo heidelbergensis Homo erectus

47 Homo sapiens Homo neandertalensis Desinova

48 Tanto interesse nei confronti dei Neandertaliani Interazioni con Homo sapiens: culturali genetiche

49

50 Il loro scheletro

51 DOVE VIVEVANO THE NEANDERTAL WORLD (250,000 28,000 YBP)

52

53

54 Ma chi erano i Neandertal?

55 Parlavano come noi?

56

57 Fisicamente come erano?

58 NGS (NEW GENERATION SEQUENICING) REVOLUTIONS A B

59 Classical approach NGS approach

60 +

61 2005 Illumina GA2 ~10 8 fragments per run GS20 ~10 5 fragments per run

62 Double stranded adna Adapters ligation Library immobilization Melting 5 sstdna recovery 3 A B Biotin 5 Capture Beads A B 3 Capture Amplification primer Pyrosequencing sstdna Quantitation PTP Bead Deposition Emulsion PCR Enrichment and priming Beads Recovery and Count 454/Roche NGS procedure

63 Double stranded adna Adaptor ligation Bridge amplification DNA polymerase Surface immobilization g t c g c g t a a a c t c t a CTR sequencing Cluster generation Illumina sample procedure

64

65

66

67

68 Improvement of NGS work flow

69

70 MIS CODING LESION MIS CODING LESION

71

72

73

74 Primer extension capture

75 Starting DNA Discarded aspecific fragments NGS library preparation Hybridization SeqCap Microarray Washing elution Enriched library NGS work flow Figure 4. Nimblegen sequence capture workflow

76

77 Figure 5. Agilent SureSelect sequence capture workflow

78

79

80 Possibile mescolamento

81

82

83

84

85 DENISOVA

86

87

88

89

90

91 Homo sapiens Homo neandertalensis Desinova

92

93

94

95

96

97

98

99 Third Generation Sequencers, an overview Company Name TGS sequencing chemistry Helicos Genetic Analysis Platform Pacific Biosciences VisiGen Biotechnologies Halcyon Molecular ZS Genetics Oxford Nanopore Virtual Terminator nucleotides Anchored DNA polymerase+zero-mode waveguide (ZMW) Modified DNA polymerase + Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Transmission Electron Microscopy (TEM) modified d α-hemolysinh l i pore + Measure of Ionic current

100

101