Nuove prospettive nella diagnostica molecolare delle malattie rare: l'uso del Next Generation Sequencing per l'identificazione dei geni causativi

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1 Nuove prospettive nella diagnostica molecolare delle malattie rare: l'uso del Next Generation Sequencing per l'identificazione dei geni causativi Marco Seri (sottotitolo preso in prestito dal Prof. R. Hennekam: Next Generation Sequencing needs Next Generation Clinicians!)

2 Genetica Clinica L introduzione delle tecnologie avanzate stanno cambiando l approccio allo studio delle malattie genetiche mendeliane e conseguentemente anche l atteggiamento del genetista clinico.

3 Clinici di nuova generazione La Genetica Clinica sta diventando il nucleo di questo cambiamento, mettendo assieme le innovazioni tecnologiche e la ricerca alle competenze cliniche Proprio per questo il compito del Genetista Clinico non è mai stato così complesso come oggi: non è cosa semplice trasferire a livello clinico l enorme quantità di informazioni provenienti dall attività di ricerca.

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5 MENDELIAN INHERITANCE IN MAN ( MIM ) 1^ edizione 1966: 1500 voci oggi: >20000 Dal 1998: solo in forma elettronica OMIM: On-lineMIM

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8 Genetic Medicine Paradigm DNA RNA Modified Proteins Proteins Biological Function Y Y Transcription Genes Translation Post-Translation Modification > 1,000,000 Proteins Information: Critical to Understanding Disease Mechanisms

9 Geni e malattie: una nuova dimensione sano Malattia monofattoriale normale Variazione 1: Mutazione Variazione 2: polimorfismo Sano, ma con una proteina che funziona di più o di meno: suscettibilità

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11 NGS DNA SEQUENCING EXPERIMENTAL DESIGNS TARGETED REGION TARGETED GENES WHOLE EXOME WHOLE GENOME X EXOME

12 Next Generation Sequencing e sue possibili applicazioni in campo clinico

13 NGS per Diagnostica

14 Eterogeneità Genetica Il concetto classico di Eterogeneità genetica implica il fatto che la stessa condizione può essere causata da mutazioni in geni differenti e questo sta divenendo un problema consistente in Genetica Medica Per alcune malattie il grado di eterogeneità genetica è tale che ci sono più di 100 geni che possono causare la stessa malattia

15 La Retinite Pigmentosa (RP) è un gruppo eterogeneo di malattie ereditarie caratterizzato dalla progressiva perdita della vista, cecità notturna e depositi di pigmento nella retina.

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17 NGS per Ricerca

18 Geography of exome sequencing Schinzel-Giedion N a tg e n e t A pr 1 0 Miller syndrome Na t G e ne t N ov 0 9 HPMR N a tg e n e t A u g 1 0 Kabuki syndrome N a tg e n e t A ug 1 0 DFNB82 A m J H u m G e n e t J un 1 0 Perrault syndrome A m J Hu m G e n e t J ul 1 0 Brain Malformation N a tu re A u g 1 0

19 UNITED WE STAND

20 DE NOVO

21 COMPOUND HETEROZYGOSITY

22 HOMOZYGOSITY

23 Sindromi malformative

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25 Malattie Mendeliane non Sindromiche

26 FA2H causes SPG35 and leukodystrophy

27 Two affected sibs from a consanguineous family carry a c.270+3a>t mutation in the FA2H gene exon 1 exon 2 L R G E Q Q G S M E N E P V L R G E Q Q V Q P G R G P P

28 Single Nucleotide Variants SNVs Sib1 Sib 2 Validated Transition to transversion ratio In dbsnp (94%) (94%) Heterozygous in dbsnp Homozygous in dbsnp Not in dbsnp 1240 (6%) 1414 (6%) Heterozygous not in dbsnp Homozygous not in dbsnp

29 Candidate variants filtering Cumulative total calls: ROHs in common: 28 No 1000 genomes: 8 NS, in UTRs, SS, nonsense: 28 Cumulative no dbsnps: NS (1 gene) damaging by at least one prediction tool (SNP&GO, Polyphen, SIFT) 1 altering SS by at least one prediction tool (NetGene2, GDB) +1bp del

30 A novel FA2H c.270+3a>t splice site mutation in an Italian consanguineous pedigree

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32 Malattie legate al cromosoma X

33 TARGETED RESEQUENCING OF X CHROMOSOME EXONS Length (Mb) ~ 150 CCDS entries 1153 RefSeq entries 2036 OMIM loci/genes 716 Agilent SureSelect human X chromosome probes 7664 Probe/CCDS genomic regions overlap 95% Probe/RefSeq genomic regions overlap 94% I II

34 A CASE STUDIED WITH BOTH CLASSICAL AND NEXT GENERATION APPROACHES X-linked recurrence of a previously undescribed neurocutaneous phenotype ndividuals III-2 and III-4: microcephaly, neurodevelopmental delay, ichthyosis, epilepsy, tetraparesis and ACC Male fetus III-3: ACC callosum and hyperkeratosis of epidermis with desquamation at the autoptic examination after voluntary abortion ndividuals I-2, II-2 and II-3: mild ichthyosis limited to the extensor surfaces of Limbs compatible with a balanced chromosome X inactivation pattern

35 POSITIONAL CLONING OF A PAK3 VARIANT. Magini et al., submitted

36 NGS-BASED DETECTION OF A PAK3 VARIANT CHR BAND GEN E hg19 Xp22.31 STS Xp22.12 MAP3K15. Xq13.1 STARD8. Xq23 PAK3 CHANGE SANGER p.l515 P + LINKAG E? - p.p477t + - p.g582fs - - p.k389 N + +

37 NGS per Malattie Complesse Personal Geneticist

38 DISCOVERY STRATEGIES IN COMMON DISEASES

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40 Patient Family history of vascular disease and early sudden death

41 Challenges Poche conoscenze della genetica da parte del paziente Nonostante l interpretazione corretta del genoma del paziente Un genoma è interpretato secondo le conoscenze attuali Se sono predette per ogni persona circa 100 mutazioni recanti un ipotetico rischio; Se impieghiamo 3 min per disordine occorrono circa 5 ore di consulenza diretta con il paziente. Come acquisire il consenso informato? Come trasferire con successo l informazione dei risultati? Come ricontattare il paziente per i cambiamenti che possono sopravvenire? Chi fa tutto ciò? Chi paga per tutto ciò?

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45 Nuovi problemi per vecchie ricette Consulenza genetica asp e t t a ti v e a mi l i a re du b b i sentimenti e t s e i h c ri st o r i a f Obiettivo: Processo di comunicazione bidirezionale Non-direttivo ne o i z a e du c d i e r e d o à t i l i b p r o b a i l i ar i t à fam rischio individuale o pz io n i p r e v en t i ve mettere il paziente in condizione di compiere scelte informate e consapevoli

46 Genetic Counselling discuss the possibility that clinical assessment might uncover high risk of a serious disease, including some for which there is no treatment describe the reproductive implications of heterozygous status for autosomal recessive diseases such as cystic fibrosis, which might not be predictable from family history warn of increases or decreases in genetic risk for common diseases. note that most of the sequence information is difficult to interpret, and discuss error rates and validation processes discuss that risk alleles might be discovered that have reproductive or familial importance rather than personal importance (such as those for breast or ovarian cancer) address the possibility of discrimination on the basis of genetics

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