Genotipizzazione virale

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1 Genotipizzazione virale Typing Separazione basata su maggiori differenze genetiche tra i membri di una singola specie virale Subtyping Individuazione di differenze stabili all interno di un gruppo di virus identificati mediante tipizzazione Fingerprinting Individuazione di isolati individuali di alcuni virus scaricato da 1

2 Sierotipizzazione virale Uso di specifici anticorpi che definiscono differenze antigeniche stabili Influenza virus A C Parainfluenza types 1 4 Poliovirus types 1 3 Herpes Simplex virus types 1 2 Adenovirus types 1 49 Più di 100 Rhinovirus types Hepatitis B virus Subtypes: ayw ayr adw adr Anticorpi Monoclonali Centres for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta USA 8 MAbs contro la proteina N del virus della rabbia Volpe Volpe Pipistrello Moffetta Moffetta Pipistrelloi Procione Moffetta Volpe Volpe Pipistrello Procione Coyote scaricato da 2

3 Antibody-based virus typing Metodi tradizionali Fissazione del complemento Inibizione dell emagglutinazione Inibizione dell emadsorbimento Neutralizzazione Metodi attuali Immunofluorescenza Saggi immunoenzimatici Limiti: - assenza di differenze antigeniche significative - impossibilità di distinguere tra isolati individuali all interno di un sierotipo Avvento delle tecniche di biologia molecolare Resistenza ai farmaci antivirali Difficoltà di valutare la resistenza ai farmaci antivirali mediante metodi basati su coltura Fallimento nel trattamento dei pazienti infetti da HIV Identificazione di mutazioni specifiche in geni che codificano per proteine bersaglio di antivirali i HIV trascrittasi inversa HIV genotipizzazione HIV proteasi scaricato da 3

4 Metodi molecolari per la caratterizzazione dei virus Metodo Restriction fragment lenght polymorphism (RFLP) Enzimi di restrizione Sonda Southern blot SI SI Oligonucleotide fingerprinting NO NO Tipo di risoluzione Livello di risoluzione SI NO Siti di restrizione Subtypes Siti di restrizione e siti nella sonda Siti di clivaggio dell RNase T1 PCR products analysis NO SI Siti nella sonda Subtypes Subtypes Quasispecies Subtypes Ribonuclease protection assay NO SI Siti nella sonda Subtypes Single-strand conformation polymorphism (SSCP) NO NO Heteroduplex mobility assay (HMA) NO NO Differenze di mobilità Differenze di mobilità Subtypes Quasispecies Nucleotide sequencing NO NO Genome segment lenght polymorphism NO NO Sequenza nucleotidica Lunghezza della sequenza Single genome Subtypes Applicazione dei metodi di genotipizzazione per specifici virus Virus Adenovirus Cytomegalovirus Epstein-Barr virus Enterovirus Hepatitis B virus Hepatitis C virus HIV Herpes simplex virus Influenza Rabies Respiratory syncytial virus Rhinovirus Rotavirus Varicella-zoster virus Metodo RFLP RFLP, PCR-RFLP, Southern blot, Glycoprotein B genotyping RFLP, Analysis of termini RFLP, RT-PCR RFLP, Olig. Fingerprinting, SSCP, Nucleotide sequencing Southern blot, SSCP, PCR-SSCP, Nucleotide sequencing SSCP, PCR-SSCP, Reverse hybridization, Nucleotide sequencing HMA, HTA, Nucleotide sequencing RFLP, PCR-RFLP, Southern blot Ribonuclease protection assay, HMA, Nucleotide sequencing Monoclonal antibody typing, Nucleotide sequencing Ribonuclease protection assay, PCR-RFLP, Nucleotide sequencing Serotyping, Nucleotide sequencing Genome segment lenght polymorphism RFLP, PCR-RFLP scaricato da 4

5 RESTRICTION FRAGMENT LENGHT POLYMORPHISM Digestione con enzima di restrizione X X X X Frammenti Sito perso per mutazione 1.2 kbp 1.4 kbp Tecnica semplice Vasta applicabilità Elevata quantità di DNA purificato RFLP Data Genotipo A Genotipo B 1.4 kbp 1.2 kbp Enzimi di restrizione adeguati Difficile da utilizzare con virus a RNA 0.2 kbp RESTRICTION FRAGMENT LENGHT POLYMORPHISM Screening Digests Confirmatory Digests M Papillomavirus scaricato da 5

6 SOUTHERN BLOT Campione Estrazione Digestione con enzimi di restrizione Separazione su gel di agarosio Trasferimento su nitrocellulosa Vasta applicabilità Possibilità di analizzare genomi complessi Ibridizzazione con la sonda marcata Autoradiografia Limitata dalla scelta degli enzimi di restrizione Può richiedere radioisotopi Le bande visibili rappresentano quelle ibridizzate con la sonda radioattiva Southern blotting di ceppi di HSV-1 mutati scaricato da 6

7 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 1 copia Ciclo 1 dntps Taq qpol Ciclo 2 Ciclo 3 + di 2 milioni di copie Cicli +20 PCR-RFLP Reverse Hybridization DNA Enzyme Immunoassay PCR-RFLP UZ9 UZ27 UZ30 UZ32 D M UZ57 UZ57 UZ57 -type A -type B A D M Genotipi del virus dell epatite B scaricato da 7

8 Single strand conformation polymorphism analysis Genotipo A CCTGAGGAG GGACTCCTC Genotipo B CCTGTGGAG GGACACCTC Amplificazione di un frammento contenente una mutazione puntiforme mediante PCR Milioni di copie Le eliche dei prodotti della PCR vengono separate mediante denaturazione A B Elettroforesi su gel di poliacrilamide SSCP analisi Glicoproteina B del Cytomegalovirus Gel di poliacrilamide al 20% scaricato da 8

9 RNA viruses Oligonucleotide fingerprint analysis Marcatura del virus con 32 P Estrazione dell RNA Ribonuclease T1 (Aspergillus oryzae) 2D elettroforesi 1D 2D Autoradiografia Oligonucleotide fingerprint analysis Bunyaviruses Genoma a RNA L, M ed S RNA L: RNA trascrittasi M: glicoproteine g1 e g2, proteina non strutturale NSm L M S S: Proteina del nucleocapside N e proteina non strutturale NSs scaricato da 9

10 RNA normale + RNA mutato 32P-single-stranded probe Ribonuclease protection assay Anneal Digestione con RNase A Denaturazione A B Elettroforesi su gel di poliacrilamide Ribonuclease protection assay scaricato da 10

11 Ribonuclease protection assay Genome segment length polymorphism Pattern genomico di Rotavirus umani isolati in Sud Africa scaricato da 11

12 Heteroduplex mobility assay DNA provirale di HIV da cellule mononucleate del sangue periferico Prodotti della PCR PCR per amplificare una regione variabile Elettroforesi: 2.5% gel di agarosio 5% gel di poliacrilamide Heteroduplexes Banda singola contenente sia hetero- homoduplexes Homoduplexes Heteroduplex mobility assay Misurazione della distanza genetica Organismo DNA provirale di HIV da: A B C PCR con gli stessi primers Prodotti della PCR Combinare, denaturare e rinaturare i prodotti Analizzare su gel di poliacrilamide al 5% A + B A + C Heteroduplexes Heteroduplexes Homoduplexes Homoduplexes scaricato da 12

13 Infezioni con due genotipi della stessa specie virale Sensibilità dell HMA per evidenziare infezioni miste Virus dell epatite A HAV: - singolo sierotipo - genotipi da I a VII - sottogenotipi A e B 80% degli isolati umani appartiene al genotipo I Sottogenotipi IA e IB sono stati osservati in Francia, Italia, Spagna, Olanda, Sud Africa scaricato da 13

14 HMA per studiare l evoluzione dei virus Heteroduplex tracking assay Modificazione dell HMA I prodotti della PCR vengono ibridizzati ad una sonda a DNA marcata SI non-si Sonda: V3 di gp120 Heteroduplexes HMA: tutte le heteroduplex che si formano HTA: solo le heteroduplex che si formano con la sonda radioattiva scaricato da 14

15 Sanger ddntp chain termination sequencing Template: GCATTGGGAACC Primer: CGTA 3 dntps + ddgtp dntps + ddatp dntps + ddttp dntps + ddgtp G A T C G G T T C C C A scaricato da 15

16 I prodotti delle quattro reazioni vengono marcati diversi coloranti fluorescenti e vengono rilevati dal detector del sequenziatore automatico Microarrays Method scaricato da 16

17 Esempio di un HPV DNA chip in grado di differenziare 22 genotipi di HPV clinicamente significativi A B C D E F G scaricato da 17