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1 Nuovi metodi molecolari per l identificazione dei batteri basati sul DNA ribosomico: amplified rrn RFLP e sequenziamento a confronto New ribosomal DNA based molecular methods for bacterial identification: amplified rrn RFLP vs sequencing GIMMOC Vol.V N o 1, 2001 Giornale Italiano di Microbiologia Medica Odontoiatrica e Clinica Vol. V, N o 1, 2001 p Organo ufficiale della S.I.M.M.O.C. Copyright INTRODUZIONE 1 Dipartimento di Igiene e Microbiologia, Università degli Studi di Palermo. I procarioti hanno iniziato la loro evoluzione 3,8 miliardi di anni fa ed hanno continuato ad evolversi sino ad occupare ogni nicchia ecologica sul nostro pianeta, dai ghiacci polari alle profondità oceaniche. Le circa 2500 specie batteriche comprese nelle Approved Lists of Bacterial Names [Skerman et al., 1989] non riflettono la reale varietà di batteri nell ambiente, ed ogni tentativo di stimarne la reale consistenza sarebbe presuntuoso. È ragionevole, quindi, affermare che la maggior parte delle specie è oggi ancora sconosciuta. I procarioti attualmente conosciuti rappresentano in realtà quella piccola frazione delle comunità microbiche che hanno storicamente attirato l attenzione dell uomo in quanto coinvolte nella patologia umana o animale o perché in qualche modo rientrano nella sfera di interesse dell uomo. Fino a tempi recenti, inoltre, le nostre conoscenze sulla diversità microbica erano limitate ai germi coltivabili nei comuni terreni batteriologici. In questi ultimi anni, i progressi nelle tecniche mediche e chirurgiche sono stati accompagnati da un corrispondente incremento delle patologie sostenute da germi opportunisti con habitat ambientale, da qui la necessità anche per il microbiologo clinico di identificare microrganismi che in passato non erano di suo interesse. Classicamente, la distinzione di generi e specie è stata effettuata in base a caratteri fenotipici e schemi di identificazione basati su di essi sono ancora oggi utilizzati nella maggior parte dei laboratori. Questi test hanno però il grave limite di non essere applicabili indifferentemente a qualunque specie batterica e vanno selezionati di volta in volta in base all orientamento diagnostico. Inoltre, alcuni gruppi batterici esprimono assai pochi dei caratteri fenotipici normalmente utilizzati a scopo identificativo e sono quindi difficili da differenziare. Infine, non è possibile studiare il fenotipo di batteri non coltivabili. Più recentemente, tecniche chemotassonomiche, basate su diversi metodi analitici volti a raccogliere informazioni sui costituenti chimici della cellula batterica, acidi grassi, proteine, polisaccaridi, hanno rappresentato una alternativa alla fenotipizzazione classica dei batteri al fine di ottenerne una corretta identificazione. Esse però sono spesso laboriose, necessitano della coltivazione del germe per ottenere grosse quantità di materiale da sottoporre all analisi e sono utili solo per alcuni gruppi batterici. I progressi fatti nel campo della biologia molecolare hanno messo a disposizione un certo numero di tecniche (clonaggio, PCR, sonde di DNA, etc.) che prescindono dalla coltivabilità del germe e che si sono rivelate capaci di dare una visione unitaria della genealogia delle diverse specie batteriche, mediante l utilizzo di molecole semantiche per gli studi filogenetici. È oggi universalmente accettato che l RNA ribosomico (rrna) ed i suoi geni (rdna), sono delle molecole in grado di essere utilizzate come cronometro molecolare [Weisburg et al., 1991; Woese, G.M. Giammanco 1 *Autore di riferimento: F. Genovese

2 54 GIMMOC Vol.V N o 1, 2001 Giammanco Figura 1 Allineamenti di sequenze del gene rrs con evidenziata nel riquadro un frammento di sequenza altamente conservato in Staphylococcus aureus. Figura 2 Albero filogenetico prodotto dall allineamento di sequenze di rdna 16S. Nel riquadro un raggruppamento di ceppi di Staphylococcus aureus.

3 GIMMOC Vol.V N o 1, ]. L rdna contiene regioni altamente conservate a causa dei suoi obblighi strutturali e funzionali ma anche sequenze variabili. Ciò ha permesso di utilizzarlo a fini tassonomici, per la definizione su base genetica di generi e specie, a fini diagnostici, per il sicuro riconoscimento anche di batteri di difficile diagnosi o di ceppi con caratteristiche fenotipiche aberranti, e a fini epidemiologici, come strumento per caratterizzare e differenziare ceppi appartenenti alla stessa specie. Il metodo più diretto per determinare le relazioni filogenetiche fra gli organismi è rappresentato dal confronto delle sequenze primarie dell rrna o rdna (Figura 1) ottenute mediante sequenziamento [Lane, 1991]. Più di 4000 sequenze di rrna della piccola subunità (SSU) ribosomica e più di 400 della grande subunità (LSU) sono state finora depositate nella banca dati del Ribosomal Database Project (RDP) [Maidak et al., 1999]. Questo gran numero di sequenze consente la costruzione di alberi filogenetici in cui andare a posizionare una sequenza ignota in modo tale da giungere ad una sua identificazione per approssimazione. Un esempio relativo al genere Staphylococcus viene mostrato nella Figura 2: il dendrogramma calcolato in base alla distanza genetica fra le sequenze dei ceppi in esame permette di correlare facilmente i 5 ceppi clinici di S. aureus con il ceppo tipo. Usando questo approccio è stato possibile dimostrare che nel mondo degli organismi viventi esistono tre domini: Archea, Bacteria ed Eucarya [Woese et al., 1990] e che all interno del dominio Bacteria è possibile individuare diverse linee di discendenza maggiori (Tabella I). La sistematica batterica in passato è stata basata fonda- Nuovi metodi molecolari per l identificazione dei batteri basati sul DNA ribosomico: amplified rrn RFLP e sequenziamento a confronto New ribosomal DNA based molecular methods for bacterial identification: amplified rrn RFLP vs sequencing Tabella I Linee maggiori di discendenza all interno del dominio Bacteria (adattato da Busse et al., 1996). Branch Subbranch Taxa rappresentativi Proteobacteria -subclass Agrobacterium/Rhizobium/Sphingomonas -subclass Alcaligenes/Neisseria/Comamonas -subclass Pseudomonas/Enterobacteriaceae -subclass Bdellovibrio/Desulfovibrio -subclass Helicobacter/Campylobacter Flavobacterium/Cytophaga/ Bacteroides/Cytophaga/Sphingobacterium/ Bacteroides-branch Flexibacter Gram-positivi Bacillus/Clostridium Bacillus/Clostridium/Mycoplasma/Listeria Actinomycetes Corynebacterium/Mycobacterium/Nocardia Gram-positivi con parete Veillonella/Heliobacterium/Selenomonas cellulare anomala Cyanobacteria/ Cyanobacteria/cloroplasti chloroplast-branch Spirochaetales Spirochaetaceae/ Borrelia/Spirochaeta/Treponema/ Leptospiraceae Leptospira/Leptonema Chlorobiaceae-branch Planctomyces-branch Thermus/Deinococcus-branch Chloroflexus/ Thermomicrobium-branch Verrucomicrobium-branch Propiogenium-branch Thermotoga-branch Aquifer/ Hydrogenobacter-branch Chlorobium Planctomyces/Pirellula/Gemmata Thermus/Deinococcus Chloroflexus/Thermomicrobium Verrucomicrobium Propiogenium Thermotoga/Fervidobacterium Aquifer/Hydrogenobacter

4 56 GIMMOC Vol.V N o 1, 2001 Giammanco Tabella II Confronto delle apparecchiature e reagenti necessari e dei costi stimati per l acquisto delle apparecchiature e per ogni singola reazione utilizzando il metodo RFLP e il DNA-sequencing (adattato da Olive & Bean, 1999). RFLP DNA sequencing Apparecchiature Thermocycler Thermocycler Gel box DNA sequencer Alimentatore Computer Sistema fotografico Software di analisi Materiali Reagenti per PCR Kit PCR sequenziamento Primers Enzimi di restrizione Costi stimati RFLP DNA-sequencing Apparecchiature $ $ Materiali di consumo/reazione $ 5 $ 20 Lavoro/reazione $ 9 $ 20 Totale/reazione $ 14 $ 40 mentalmente su caratteri fenotipici biochimici e morfologici. Attualmente, i nuovi ordinamenti filogenetici, basati sullo studio dell rrna, hanno spesso contraddetto i classici schemi tassonomici ed hanno permesso di classificare nuove specie batteriche, facendo sì che esse potessero essere incluse nel genere e nella famiglia di appartenenza [Yabuuchi et al., 1990; Busse et al., 1992; Denner et al., 1994]. Per quanto ora detto, il sequenziamento dell rdna sembrerebbe la migliore strategia da seguire per l identificazione molecolare di ceppi sconosciuti. Uno dei principali inconvenienti di questo approccio è, però, rappresentato dalla complessità della determinazione delle sequenze e degli allineamenti che, benché largamente automatizzato, permette di analizzare limitate quantità di ceppi clinici, richiede personale tecnico qualificato e costose apparecchiature non alla portata di tutti i laboratori. Inoltre, l assenza di criteri di selezione per il deposito di sequenze nell RDP determina inconvenienti legati alla scarsa affidabilità di alcune delle sequenze presenti nella banca. Una via alternativa per sfruttare l informazione filogenetica presente nelle molecole di rdna è rappresentata dall analisi con enzimi di restrizione del gene amplificato mediante Polymerase Chain Reaction (PCR). Questo metodo, chiamato RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism), permette di calcolare velocemente ed in maniera semplice la diversità genetica fra i ceppi in base al numero di frammenti di DNA condivisi. L analisi genetica può essere effettuata su regioni codificanti molto più lunghe di quelle che possono essere agevolmente sequenziate ed in questa analisi verranno in gran parte ignorate le variazioni minori del codice genetico. Esso risulta particolarmente a- datto per lo studio di gruppi cospicui di stipiti, in quanto la complessità del metodo è ridotta dal punto di vista tecnico. Inoltre, le apparecchiature necessarie sono alla portata della maggior parte dei laboratori e il costo di una identificazione effettuata con questo metodo risulta nettamente inferiore rispetto al sequenziamento [Olive & Bean, 1999] (Tabella II). Negli ultimi dieci anni lo studio dei profili elettroforetici ottenuti dopo digestione con endonucleasi della sequenza dell rd- NA 16S (rrs) amplificata mediante PCR (16S - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) è stato utilizzato ampiamente e con successo per l identificazione di molti microrganismi e per studi filogenetici e di ecologia microbica. Uno o più enzimi di restrizione in combinazione sono stati usati nei diversi studi e si è fatto sempre più ampio ricorso alla analisi computerizzata dei profili di restrizione. Ma l analisi dell rrs, a causa delle piccole dimensioni del frammento amplificato

5 GIMMOC Vol.V N o 1, Tabella III Variabilità nella lunghezza della regione spacer IGS dei 7 alleli rrn di Escherichia coli [Young et al., 1979; Brosius et al., 1981; Harvey et al., 1988]. Denominazione allele Lunghezza spacer rrna 437 rrnb 441 rrnc 355 rrnd 437 rrne 355 rrng 431 Nuovi metodi molecolari per l identificazione dei batteri basati sul DNA ribosomico: amplified rrn RFLP e sequenziamento a confronto New ribosomal DNA based molecular methods for bacterial identification: amplified rrn RFLP vs sequencing rrnh 447 (~1500 paia di basi (pb)), ha un potere di risoluzione troppo basso per essere applicata a specie batteriche molto vicine come è stato rilevato dal confronto di sequenze complete del 16S di specie appartenenti ai generi Bacillus [Fox et al., 1992] ed Aeromonas [Martinez-Murcia et al., 1992]. Il gene che codifica per l RNA ribosomico 23S (rrl) è più grande (~3000 pb) e presenta per questo un potere di risoluzione maggiore rispetto all rrs [Olsen & Woese, 1993]. La regione spaziatrice intergenica fra rrs ed rrl (16S-23S Intergenic Spacer Region (IGS)) ha un tasso di mutazione molto più elevato rispetto ad rrs ed rrl [Gurtler & Stanisich, 1996]. La sua lunghezza varia notevolmente a seconda della specie, da 60 pb (Thermoproteus tenax) fino a 1500 (Bartonella elizabethae), e varia persino, sebbene in misura più ridotta, fra le diverse copie dell operone rrn che possono essere presenti nello stesso genoma batterico (da una sola copia in Mycobacterium tuberculosis [Bercovier et al., 1986] e Mycoplasma pneumoniae [Amikam et al., 1984] a 10 copie in Bacillus subtilis [Loughney et al., 1982]). Anche le sette copie o alleli rrn presenti in Escherichia coli hanno regioni 16S-23S IGS di diversa lunghezza e sequenza [Young et al., 1979; Brosius et al., 1981; Harvey et al., 1988] (Tabella III). Grazie all elevata variabilità di questa regione, l analisi dei prodotti di amplificazione della 16S-23S IGS (PCR-ribotyping) si è dimostrata in grado di differenziare ceppi appartenenti alla stessa specie [Jensen et al., 1993; Kostman et al., 1995]. Applicando l analisi di restrizione ad un unico frammento amplificato comprendente rrs, 16S-23S IGS, ed rrl si possono ottenere contemporaneamente informazioni sia dalle regioni più conservate (identificazione al livello di specie) sia da quelle con maggiore tasso di mutazione (tipizzazione intraspecie). Questo approccio si è dimostrato efficace nell identificazione di Comamonadaceae [Vaneechoutte et al., 1992], Francisella spp. [Ibrahim et al., 1996] and Acinetobacter spp. [Ibrahim et al., 1996; Garcìa-Arata et al., 1997; Dijkshoorn et al., 1998]. Un metodo standardizzato di identificazione su base genetica e di genotipizzazione basato sull analisi mediante enzimi di restrizione dei prodotti di amplificazione (PCR) dell intero operone che codifica per l rrna (rrn), comprendente il gene rrs, il gene rrl e la regione intergenica 16S-23S IGS, è stato recentemente messo a punto e denominato amplified rrn RFLP [Giammanco et al., in preparazione]. Il metodo amplified rrn RFLP. La genotipizzazione tramite amplified rrn RFLP è un metodo universale utilizzabile per l identificazione di qualsiasi batterio. Infatti, gli stessi primer possono essere utilizzati per amplificare l operone rrn sia per i batteri Gram-positivi sia per quelli Gram-negativi, aerobi obbligati, anaerobi facoltativi, anaerobi obbligati. Trattandosi di un metodo molecolare, esso fornisce risultati affidabili anche nel caso di ceppi con caratteri fenotipici anomali che ne impediscono l identificazione con le metodiche tradizionali.

6 58 GIMMOC Vol.V N o 1, 2001 Giammanco Figura 3 Struttura dell operone rrn in Escherichia coli e posizione dei primer rrn RFLP (Ad ed O24/3). Figura 4 Profili di restrizione calcolati in silico per ognuno dei sette operoni rrn e profilo in silico risultante dalla somma dei sette operoni (virtuale) paragonato al risultato sperimentale (sperimentale). La procedura, dopo una tappa iniziale di estrazione del DNA batterico, prevede l amplificazione mediante PCR dell operone rrn usando due primer universali situati rispettivamente all estremità iniziale 5 del gene rrs e vicino all estremità terminale 3 del gene rrl (Figura 3), in regioni altamente conservate. Si ottiene così un unico frammento amplificato sul quale si potrà operare l analisi di restrizione.

7 GIMMOC Vol.V N o 1, La scelta delle endonucleasi di restrizione per la digestione enzimatica dei prodotti di amplificazione dell operone rrn è fondamentale nel determinare la sensibilità dell analisi stessa, giacché endonucleasi che tagliano poche volte la sequenza amplificata daranno luogo a pochi frammenti di restrizione e ciò implicherà una minore variabilità nei profili. Questa scelta può essere profiquamente indirizzata dall analisi della sequenza dell operone rrn in un ceppo di riferimento appartenente al genere o alla specie che si intende studiare. Recentemente il ceppo di Escherichia coli K-12 MG1655 è stato interamente sequenziato [Blattner et al., 1997] e la sua sequenza completa è disponibile nella banca dati EMBL (accession no. U00096). I frammenti della sequenza corrispondenti ai tratti amplificabili nelle sette copie dell operone rrn (da A ad E, G ed H) sono stati da noi utilizzati per selezionare le endonucleasi più interessanti. Su ognuna delle sette sequenze sono state effettuate delle restrizioni virtuali (in silico) con il software Geneman (DNAStar, Inc., Madison, WI). Nell ambito di una serie di enzimi di restrizione, sono state selezionate le endonucleasi Hha I e Mbo II poiché le loro sequenze di attacco si presentavano con una appropriata frequenza nella sequenza amplificabile. Combinando tutti i frammenti di restrizione virtuali ottenuti dai sette operoni, è stato quindi ottenuto un profilo di restrizione in silico per ognuno dei due enzimi (Figura 4). I profili calcolati in silico con i due enzimi suddetti sono stati utilizzati per convalidare i risultati sperimentali. Il ceppo di E. coli K-12 la cui sequenza era stata utilizzata per produrre i profili in silico, è stato sottoposto ad analisi sperimentale mediante amplified rrn RFLP utilizzando le due endonucleasi, Hha I e Mbo II, selezionate in silico. I prodotti di restrizione sono stati sottoposti a separazione elettroforetica in gel di agarosio. I frammenti di restrizione così separati sono stati colorati con bromuro di etidio e visualizzati su transilluminatore UV. L immagine (Figura 5) catturata tramite videocamera è stata analizzata (numero di bande e peso molecolare dei frammenti) mediante i moduli RestrictoScan e RestrictoTyper del programma Taxotron (Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France). L accuratezza del metodo è stata dimostrata mediante il confronto dei profili sperimentali con i rispettivi profili in silico la cui corrispondenza è stata perfetta (Figura 4). Mediante lo stesso approccio comparativo è stato addirittura possibile valutare l importanza di alcuni parametri inerenti le caratteristiche delle endonucleasi e le condizioni di migrazione elettroforetica nel determinare la comparsa di artefatti. In particolare, è stata dimostrata la necessità di inattivare termicamente l endonucleasi Mbo II prima di procedere alla migrazione elettroforetica dei prodotti di restrizione [Giammanco et al., 1999]. Se non inattivato, questo enzima, come tutte le endonucleasi della classe II-S, rimane legato al frammento di DNA clivato e ne altera così il peso molecolare determi- Figura 5 Profili di restrizione sperimentali del ceppo Escherichia coli K-12 MG1655 ottenuti con Hha I (H) ed Mbo II (M). A, P, N: standard di pesi molecolari. Nuovi metodi molecolari per l identificazione dei batteri basati sul DNA ribosomico: amplified rrn RFLP e sequenziamento a confronto New ribosomal DNA based molecular methods for bacterial identification: amplified rrn RFLP vs sequencing

8 60 GIMMOC Vol.V N o 1, 2001 Giammanco Figura 6 L inattivazione dell enzima Mbo II impedisce la formazione di artefatti. L: standard di pesi molecolari; A: enzima inattivato; B: bassa concentrazione di enzima attivo; C: alta concentrazione di enzima attivo. Frecce: artefatti. nando la comparsa di alcune bande come conseguenza di artefatti e la scomparsa di altre (Figura 6). Il programma Taxotron è stato utilizzato per analizzare i profili di restrizione sperimentali e per calcolare la taglia dei frammenti di restrizione di una serie di ceppi di collezione appartenenti a diverse famiglie e generi batterici ed è stata verificata la possibilità di identificarli a livello di specie [Giammanco et al., 1998]. Particolare interesse è stato rivolto alla famiglia delle Enterobacteriaceae [Giammanco et al., 1998b], al genere Acinetobacter ed agli Streptococchi [Schlegel et al., 1999]. Nel caso del genere Acinetobacter, è stato possibile differenziare chiaramente le quattro genospecie, A. calcoaceticus, A. baumannii, A. specie 3, e DNAgruppo 13, che compongono il cosiddetto calcoaceticus-baumannii complex (Figura 7) così denominato proprio per la difficoltà nel distinguere le specie che lo compongono in base ai soli caratteri fenotipici. Negli enterobatteri è stato possibile individuare profili tipici per ogni specie, anche nell ambito di quei generi Figura 7 Profili di restrizione ottenuti con l enzima di restrizione Mbo II da ceppi di riferimento appartenenti alle 4 genospecie all interno di Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex.

9 GIMMOC Vol.V N o 1, Figura 8 Dendrogramma di ceppi di riferimento appartenenti alle 11 specie genomiche del genere Citrobacter prodotto dal confronto dei profili ottenuti con 3 enzimi di restrizione (HhaI, Sau3A I, ed Mbo II). Nuovi metodi molecolari per l identificazione dei batteri basati sul DNA ribosomico: amplified rrn RFLP e sequenziamento a confronto New ribosomal DNA based molecular methods for bacterial identification: amplified rrn RFLP vs sequencing in cui le differenze fenotipiche sono ridotte, come nel caso del genere Citrobacter (Figura 8). Tutti i profili ottenuti sono stati integrati in una banca dati per permettere l identificazione di ceppi selvaggi. In questo modo, l identificazione di un ceppo isolato da materiale clinico può essere ottenuta per confronto con un archivio di immagini relative alle varie specie batteriche, in gran parte già costituito. CONCLUSIONI L amplified rrn RFLP è una metodica semplice e veloce che si è dimostrata in grado di distinguere specie geneticamente molto vicine come le genospecie appartenenti ai generi Acinetobacter e Citrobacter. Le apparecchiature necessarie per l amplified rrn RFLP sono presenti nella maggior parte dei laboratori che si occupano di biologia molecolare, mentre il costo degli apparecchi di sequenziamento è ancora elevato. Inoltre, nell amplified rrn RFLP il costo di ogni singola reazione, in termini di materiali di consumo e di costo della manodopera, è inferiore di due terzi rispetto al sequenziamento. Diversi software per l analisi di immagini di profili di restrizione sono oggi disponibili sul mercato. Fra i più diffusi vi sono: BioGene (Vilber-Lourmat, Marne-la-Vallèe, France), GelCompar (Applied Maths, Kourtrai, Belgium) e Taxotron (Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France). Il programma Taxotron, originariamente sviluppato per la ribotipizzazione, permette di acquisire i profili di restrizione in maniera semi-automatica e di confrontarli con i profili precedentemente memorizzati, consentendo di ottenere una identificazione del profilo in esame in tempi ridottissimi. L amplified rrn RFLP dimostra di poter essere standardizzato e può permettere quindi lo scambio di dati fra diversi laboratori e la creazione di banche dati inter-laboratorio per il confronto dei profili di restrizione. In attesa, quindi, di una diminuizione dei costi relativi al sequenziamento, l utilizzo della metodica amplified rrn RFLP può essere suggerito in tutti quei casi in cui si ritenga necessario ricorrere alla analisi dell RNA ribosomico per identifi-

10 62 GIMMOC Vol.V N o 1, 2001 Giammanco care un ceppo batterico sconosciuto. La capacità dell amplified rrn RFLP di tipizzare i ceppi batterici permettendo di caratterizzare stipiti appartenenti alla stessa specie è ancora in corso di valutazione e dipende certamente dalla scelta degli enzimi di restrizione. È però possibile che l informazione genetica derivante dallo studio dei siti di restrizione all interno dell operone rrn sia insufficiente per questo tipo di analisi per la quale il sequenziamento potrebbe essere un approccio più efficace. BIBLIOGRAFIA Amikam D., Glaser G., Razin S. Mycoplasmas (Mollicutes) have a low number of rrna genes. J. Bacteriol., 158: , Bercovier H., Kafri O., Sela S. Mycobacteria possess a surprisingly small number of ribosomal RNA genes in relation to the size of their genome. Biochem. Biophys. Res. Commun., 136: , Blattner F.R., Plunkett G. 3 rd, Bloch C.A., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. 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