ESPERIENZE DI LABORATORIO

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1 ESPERIENZE DI LABORATORIO Determinazione dello zinco nei capelli..1 Determinazione di anioni inorganici presenti in acque potabili 4 Determinazione degli acidi grassi in lipidi di origine naturale..6 Determinazione della caffeina presente in bevande 9 Determinazione del punto isosbestico, 12

2 1 Determinazione dello zinco nei capelli mediante spettroscopia di assorbimento in fiamma Nei capelli sono presenti vari elementi in tracce (Mg, Al, Cl, Ca, Cr, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, etc.), la cui quantità varia durante la crescita dei capelli e dipende dal tipo di alimentazione. Lo zinco è presente nel corpo umano in combinazione con enzimi e peptici e il suo contenuto normale, che è di circa g/g ( ppm), dipende da diversi fattori quali età, sesso, colore, clima, lunghezza, zona del prelievo, shampoo antiforfora etc. Lo zinco assunto con il cibo è normalmente sufficiente al fabbisogno dell organismo umano; una sua concentrazione troppo bassa può causare disturbi quali ad esempio stanchezza e difficoltà di apprendimento, mentre livelli troppo alti di zinco possono causare ipercinesi. L esperienza ha come oggetto la determinazione della quantità di zinco nei capelli mediante misure di spettroscopia di assorbimento atomico in fiamma. A tale scopo, i capelli dovranno essere portati in soluzione con acido nitrico (HNO 3 ) e acido perclorico (HClO 4 ) e la concentrazione di zinco verrà determinata mediante confronto con una retta di taratura e con il metodo delle aggiunte standard. L intervallo di linearità è compreso tr 0 e 1,5 ppm. Apparecchiatura Spettrofotometro per assorbimento atomico (AA) Lampada a catodo cavo per Zn Capsula di porcellana Micropipette Matracci tarati da 100 ml Matracci tarati da 25 ml Buretta da 10 ml, divisione 1/20 ml Reagenti Acido nitrico al 65 % per spettrofotometria Acido perclorico al 65 % per spettrofotometria

3 2 Soluzione standard concentrata di Zn (1000 ppm) 25 ml di soluzione standard diluita di Zn (25 ppm) Procedimento per la costruzione della retta di taratura 1. Preparare 4 soluzioni standard a concentrazione di 0,50, 0,75, 1,00, 1,25 e 1,50 ppm rispettivamente in 5 matracci tarati da 25 ml per diluizione con acqua distillata di volumi appropriati della soluzione a 25 ppm. 2. Ottimizzare condizioni strumentali alla lunghezza d onda di lavoro di 213,9 nm secondo le specifiche riportate nelle apposite tabelle. 3. Azzerare lo strumento con acqua distillata prima di ogni misura. 4. Fare tre letture del valore di assorbanza per ogni soluzione (15 letture in totale). 5. Tracciare la retta di calibrazione esterna ricavata con il metodo dei minimi quadrati utilizzando tutte le quindici letture. 6. Tracciare l intervallo di fiducia per un valore di confidenza pari a 0,05. Trattamento dei campioni di capelli 1. Pesare circa 0,3 g di capelli puliti e tagliati alla radice 2. Trasferire i capelli in una capsula di porcellana assieme a 10 ml di HNO 3 (sotto cappa) 3. Scaldare blandamente fino a dimezzare all incirca il volume iniziale. 4. Lasciare raffreddare e aggiungere quindi 2 ml di HClO 4 (sottocappa). 5. Scaldare su bagnomaria o bagno a sabbia fino a disgregazione completa dei capelli e ad arrivare ad un volume finale di circa 2 ml di soluzione. 6. Raffreddare e trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 100 ml. 7. Portare a volume con acqua distillata, e lasciare riposare il sistema (le soluzioni all inizio possono essere di vari colori anche se provengono da uno tesso campione, poi, dopo il riposo tendono tutte al rosa).

4 3 8. Azzerare lo strumento con acqua distillata e fare quindi tre letture del valore di assorbanza della soluzione. 9. Calcolare il valore medio e ricavare la concentrazione di zinco presenti nei 100 ml di soluzione per estrapolazione dalla retta di calibrazione. Se la concentrazione risulta fuori dell intervallo di concentrazione utilizzato per la calibrazione, procedere ad una adeguata diluizione. 10. Riportare il valore trovato alla quantità di capelli iniziali utilizzando la relazione 11. Zn (mg /Kg = /g) = C x 100/m 12. dove C è la concentrazione estrapolata espressa in mg/l e m la massa di capelli espressa in grammi. Metodo delle aggiunte standard 1. Trasferire in 5 matracci tarati da 25 ml, numerati dall uno al cinque, 12,5 ml di soluzione del campione di capelli. 2. Aggiungere ai matracci 1, 2, 3, 4 e 5 rispettivamente 0, 0,25, 0,5, 0,75 e 1,00 ml di soluzione diluita di zinco (25 ppm). 3. Portare a volume con acqua distillata. 4. Dopo azzeramento con acqua distillata, effettuare tre misure di assorbanza per ogni campione. 5. Tracciare la retta assorbanza contro concentrazione di zinco aggiunta ricavata con il metodo dei minimi quadrati. 6. Determinare la concentrazione di zinco presente nella soluzione proveniente dal trattamento dei capelli nel punto di intersezione della retta con l asse delle ordinate (asse dell assorbanza) al valore zero in assorbanza. 7. Calcolare il contenuto in zinco nel campione di capelli utilizzando la precedente relazione. Fare un confronto statistico dei dati (parametri della retta e contenuto di zinco) ottenuti con i due metodi e fare le opportune considerazioni.

5 4 Determinazione di anioni inorganici presenti in acque potabili per cromatografia ionica e rivelazione conduttimetrica soppressa. Questa esperienza vuole introdurre lo studente alla cromatografia ionica (IC). Questa tecnica riveste oggi un ruolo estremamente importante in quanto con essa è stato possibile determinare specie non facilmente determinabili per altra via come ad esempio lo ione solfato, ammonio, fluoruro, fosfato e molti altri. La grande versatilità della tecnica è data sia dall odierna tecnologia delle resine a scambio ionico che dalla possibilità di utilizzare la tecnica conduttimetrica per la rivelazione degli analiti. Quest ultima circostanza è dovuta alla possibilità di «sopprimere» la conducibilità del fondo, dovuta all eluente utilizzato, ma non all analita il cui segnale viene anzi aumentato. La IC viene qui usata per la quantificazione degli anioni inorganici presenti nell acqua di rete (o di un acqua oligominerale) ed in particolare di Cl -, NO - 3, SO 2-4, (PO 3-4 ). La quantificazione di tali ioni è effettuata per mezzo di una calibrazione esterna. Strumentazione Cromatografo liquido inerte ad alta pressione dotato di rivelatore conduttimetrico. Colonna analitica ionica DIONEX AS4A-SC con precolonna AG4A-SC. Soppressore a micromembrana DIONEX AMMS II o DIONEX SRS. 3 o 4 matracci tarati da 100 ml 5 matracci tarati da 25 ml pipette tarate da 10 ml. Reagenti Soluzione eluente costituita da una miscela di carbonato/bicarbonato 1.8/1.7 mm. Soluzioni di 1000 p.p.m. di NaCl, NaNO 3, (NaH 2 PO 4 ), Na 2 SO 4 per analisi. Soluzione di H 2 SO 4 25 mm per la rigenerazione della membrana di soppressione.

6 5 Procedura 1. Utilizzando i matracci tarati da 100 ml siano fatte tre soluzioni madre contenenti 1000 p.p.m. di Cl -, NO - 3 e SO 2-4, (PO 3-4 ). 2. In 5 matracci tarati da 25 ml si preparino le soluzioni standard di Cl - in ragione di 1, 5, 10, 20, 50 p.p.m., NO - 3 in ragione di 1, 2, 5, 10, 20 p.p.m. e SO 2-4 (e PO 3-4 ) in ragione di 1, 5, 10, 20, 50 p.p.m. portando a volume con acqua bidistillata. 3. Accendere il cromatografo ed impostare una velocità di flusso di 2.0 ml/min. Accendere il rivelatore conduttimetrico ed impostare 300 S a fondo scala. Avviare la rigenerazione del soppressore. 4. Prima delle iniezioni fare stabilizzare il segnale del fondo lasciando fluire l eluente per almeno una decina di minuti (conducibilità di fondo minore di 25 S). 5. Accendere l integratore impostando l attenuazione a 1024 ed attivare la procedura PTeval. 6. Avvinare 3 volte la siringa di iniezione con la soluzione da iniettare. Si inizi con il bianco (acqua) e si proceda con la soluzione standard più diluita. 7. Introdotta la siringa nell apposito alloggiamento dell iniettore si riempia il «loop» assicurandosi di essere nella posizione «LOAD». 8. Commutare la valvola di iniezione nella posizione «INJECT» attivando simultaneamente l integratore. 9. Lasciare eluire i picchi e poi ripetere l iniezione dello stesso standard per tre volte 10. Graficare le aree trovate contro le concentrazioni 11. Analizzare con la stessa procedura i campioni incogniti preoccupandosi di filtrare in linea la soluzione se richiesto (acque di scarico o superficiali piuttosto che acque potabili).

7 6 Determinazione degli acidi grassi in lipidi di origine naturale I grassi naturali (lipidi) sono costituiti quasi esclusivamente da esteri degli acidi grassi con la glicerina (trigliceridi) nei quali la composizione acidica è rappresentativa dell origine e/o della trasformazione del prodotto. La determinazione della composizione acidica in campioni quali olio, burro, margarina, così come in prodotti contenenti frazioni significative di sostanza grassa (alimenti, cosmetici, farmaci, ecc ) risulta pertanto essenziale per una loro caratterizzazione sia in termini di composizione che di qualità del prodotto. L analisi degli acidi grassi può essere convenientemente eseguita per via gas-cromatografica, sfruttando la volatilità dei loro esteri metilici che risulta maggiore sia rispetto agli stessi acidi grassi che agli originali trigliceridi costituenti il campione in esame. Se efficacemente separati, la loro quantificazione può inoltre risultare estremamente semplice in virtù di due importanti considerazioni: 1. I prodotti naturali quali l olio di oliva, di semi o il burro possono essere considerati come costituiti al 100% da trigliceridi. 2. Utilizzando, dopo separazione GC, un rivelatore a ionizzazione di fiamma, la risposta strumentale (sensibilità) risulta praticamente identica per tutti gli acidi grassi di interesse (C4-C24) se si esprime la concentrazione di ogni analita in % (w/w). Ciò produce un caratteristico cromatogramma rappresentativo dell intero campione, nel quale l area relativa (A%) di ogni picco cromatografico risulta una buona stima della concentrazione (% w/w) del singolo acido grasso contenuto nel campione originale. Reagenti Acido solforico 98% Metanolo n- Pentano o Etere di Petrolio C

8 7 Attrezzature Gas-Cromatografo equipaggiato con colonna capillare EC-WAX 20 M, idonea alla separazione degli esteri metilici degli acidi grassi e rivelatore FID. Integratore Bagno riscaldante Fiala da 20 ml munita di setto rivestito in teflon e ghiera in allumino Rivettatore Pipetta graduata Siringhe Siringa da GC Analisi gas-cromatografica Individuare i vari moduli della strumentazione (bombole, riduttori, iniettore, colonna, rivelatore e integratore) e, con l aiuto del docente, cercare di impostare le condizioni operative di analisi sulla base delle proprietà degli analiti in esame (volatilità) e delle disponibilità strumentali. Scegliere in particolare: T iniettore, T rivelatore, T colonna o programmare un gradiente di T, flusso del carrier, parametri di acquisizione ed integrazione del segnale. Adattare le condizioni sperimentali mediante l analisi degli estratti ottimizzando la risoluzione cromatografica e i tempi di analisi. I valori normalmente impiegati con una colonna EC-WAX sono: T iniettore = C, T rivelatore = 260 C, T colonna = C Nelle condizioni ottimali, acquisire più cromatogrammi dello stesso campione per determinare, sia qualitativamente che quantitativamente, la composizione acidica del campione. Il primo aspetto può essere affrontato analizzando un campione sintetico, contenente cioè solo alcuni acidi grassi a composizione nota e/o conoscendo a priori le caratteristiche della fase stazionaria utilizzata (precedenti esperienze). In questo caso preparare gli esteri metilici L analisi quantitativa si basa invece sulla misura dell area di ogni picco di interesse (in pratica tutti tranne quelli attribuibili al solvente), esprimendo ogni concentrazione (% w/w), e propria incertezza, come area relativa

9 8 % AG = A AG / i A AGi F. Tateo, Analisi dei prodotti alimentari, Chiriotti editore, 1978, Vol. 1, pag Procedimento 1. Introdurre nella fiala circa 0.5 g di campione 2. Aggiungere 2 ml di metanolo e 80 l di acido solforico 98 %. Seguire questo ordine introducendo con cautela l acido solforico la cui idratazione risulta fortemente esotermica. 3. Chiudere con setto e ghiera la fiala 4. Porre la fiala in un termostato ad acqua o stufa posta alla temperatura di 80 C e lasciare il campione per 40 minuti 5. Raffreddare a temperatura ambiente con acqua 6. Forare il setto con un ago e mediante una siringa introdurre 5 ml di n-pentano 7. Agitare bene in modo da estrarre completamente i poliesteri nella fase 8. Togliere la chiusura senza farsi male 9. Iniettare direttamente 0,5 l di fase organica nel gas-cromatografo

10 9 Determinazione della caffeina presente in bevande (caffè, te, Coca-Cola, farmaci analgesici) per cromatografia liquida ad alta pressione con rivelazione UV. La presente esperienza prevede l uso dell HPLC per determinare la concentrazione della caffeina in bevande nella cui formulazione essa è presente come per esempio nel caffè, nel te, nella Coca-Cola, ecc.. Il metodo tradizionale per la determinazione della caffeina prevede un estrazione e la determinazione spettrofotometrica. L uso dell HPLC permette una veloce e facile separazione della caffeina da altre sostanze come acido tannico, acido caffeico e saccarosio normalmente presenti. La procedura qui suggerita prevede di analizzare direttamente il campione di interesse (eventualmente previa diluizione) e di quantificarlo per mezzo di una calibrazione esterna. H 3 C N O N CH 3 O N CH 3 N Caffeina Reagenti Caffeina (soluzione madre da 100 ppm.) in eluente. Composizione della fase mobile per analisi in isocratica: metanolo/acqua 40/60 a ph 3.5 per H 3 PO 4 (una goccia di concentrato in un litro) Composizione della fase mobile per analisi in gradiente: (A) metanolo/acqua 20/80 a ph 3.5 per H 3 PO 4 (una goccia di concentrato in un litro); (B) metanolo. Caffè, Te, Coca-Cola, farmaci analgesici. Strumentazione Cromatografo liquido ad alta pressione (isocratico) Cromatografo liquido ad alta pressione (a gradiente).

11 10 Rivelatore spettrofotometrico UV-VIS ( =270 nm). Colonna analitica da fase inversa Lichrosorb RP-18 5 matracci tarati da 25 ml. pipette tarate. Procedura 1. In 5 matracci tarati da 25 ml si preparino soluzioni a concentrazione 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 50.0 p.p.m. di caffeina e si porti a volume con la soluzione eluente. 2. Accendere il cromatografo ed impostare una velocità di flusso di 2.0 ml/min raggiungendo gradualmente tale valore. Accendere il rivelatore, impostare = 254 nm e 0.64 aufs. 3. Fare stabilizzare il segnale del fondo lasciando fluire l eluente per almeno una decina di minuti. 4. Accendere l integratore impostando l attenuazione a 128 ed attivare la procedura PTeval. 5. Avvinare 3 volte la siringa di iniezione con la soluzione da iniettare. Si inizi con il bianco (eluente) e si proceda con la soluzione standard più diluita. 6. Introdotta la siringa nell apposito alloggiamento dell iniettore si riempia il «loop» assicurandosi di essere nella posizione «LOAD». 7. Commutare la valvola di iniezione nella posizione «INJECT» attivando simultaneamente l integratore. 8. Lasciare eluire i picchi e poi ripetere l iniezione dello stesso standard per tre volte, mediare i valori delle tre aree relative e porre il valore in grafico. 9. Analizzare con la stessa procedura i campioni incogniti (eventualmente diluiti) preoccupandosi di filtrare in linea la soluzione se richiesto. Preparazione dei campioni di caffeina da caffè, te e coca cola Alcune bevande possono essere analizzate direttamente (iniezione diretta). Le bevande gasate devono essere preventivamente degasate ad esempio utilizzando con cautela un bagno ad ultrasuuoni.

12 11 _ Per il caffè e per il te si suggerisce di prelevare 2 ml di bevanda, e diluirli a 25 ml portando a volume con la soluzione eluente. _ Per la Coca-Cola si esegua la stessa operazione prelevando però 10 ml di bevanda degasata. Si inietti il campione incognito per tre volte. _ Il contenuto di caffeina nel caffè macinato può essere determinato attraverso la completa estrazione dell analita. Ciò si ottiene trattando 2 g di caffè con 20 ml di CH 2 Cl 2 a ricadere per 2 ore. l estratto viene filtrato, portato a secchezza in evaporatore rotante (dotato di trappola per il recupero del solvente) e ripreso in metanolo. La soluzione (eventualmente diluita con acqua) viene iniettata direttamente. _ L estrazione da farmaci si ottiene macinando la compressa in mortaio trasferendo il tutto in beuta e trattando con 50 ml di metanolo (eventualmente portare in bagno ad ultrasuoni per 10 min). Filtrare su carta e raccogliere la soluzione in matraccio da 100 ml. Lavare il filtro con qualche aliquota di metanolo e portare a volume. La soluzione può essere direttamente iniettata eventualmente diluita con acqua. 1. Stimare l errore per un intervallo di fiducia pari a 0,05.

13 12 Determinazione del coefficiente di assorbività molare ε e del punto isosbestico di rosso fenolo e verde di bromocresolo (e costante di equilibrio). Loro determinazione in una miscela. Quando uno spettro cambia in seguito ad una reazione chimica a carico del cromoforo, ossia del gruppo responsabile dell assorbimento, e vi sono sovrapposizioni tra lo spettro iniziale e quello della specie prodotta nella reazione, nello spettro esiste almeno una lunghezza d onda alla quale le assorbività molari delle due specie sono uguali. Tale lunghezza d onda, identifica il punto isosbestico. L importanza di tale punto consiste nel fatto che questo risulta indipendente dalla concentrazione delle due specie, ma solo dalla concentrazione iniziale totale di analita e può quindi essere utilizzato per determinazioni quantitative. Infatti, a tale lunghezza d onda non si hanno deviazioni dalla legge di Beer in conseguenza della reazione di spostamento chimico. Il rosso fenolo (fenolsolfonftaleina) ed il verde di bromocresolo (tetrabromo-mcresolsolfonftaleina) riportate in figura sottostante, sono due acidi deboli organici utilizzabili come indicatori cromatici nelle titolazioni acido-base. O O O S O Br O S O Br HO OH HO OH Br Br Rosso fenolo Verde di bromocresolo Sebbene siano acidi poliprotici, ossia aventi più costanti di dissociazione acida, ai fini della presente esperienza possono essere considerati acidi monoprotici aventi pka = 7.8 e 4.7 rispettivamente. Il rosso fenolo vira da giallo a rosso, il verde di bromocresolo da giallo a blu. Per questa loro capacità

14 13 di variare il colore a seconda del ph, il loro spettro di assorbimento mostrerà dei massimi collocati a lunghezze d onda considerevolmente differenti, corrispondenti alla forma protonata HIn e deprotonata In -. HIn H + + In - Essendo questo un caso di cromofori interconvertibili, lo spettro deve mostrare un punto isosbestico, cioè una lunghezza d onda in cui l assorbività molare ε sia indipendente dal ph. Inoltre, se la concentrazione totale della forma protonata e deprotonata nei diversi tamponi è uguale, tutti gli spettri si intersecheranno tutti in tale punto. Sperimentalmente., il punto isosbestico si individuerà mediante la registrazione degli spettri di assorbimento nella regione del visibile compresa tra 300 e 700 nm, mantenendo rigorosamente costante la concentrazione di indicatore al variare del ph. L esperienza si sviluppa in due fasi: a) Determinazione delle costanti di assorbività molari massime (ε max ) del rosso fenolo e del verde di bromocresolo al variare del ph. Il valore viene determinato dagli spettri di assorbimento registrati a vari ph e relativi alla stessa concentrazione di analita. Quest ultimo accorgimento ci permetterà di osservare i punti isosbestici dei due coloranti e le relative lunghezza d onda. Inoltre, si tenterà di determinare la costante di equilibrio dei due acidi. b) Determinazione delle quantità dei due coloranti presenti in una miscela incognita a due differenti lunghezze d onda mediante retta di calibrazione e opportuna scelta del ph di lavoro. Reagenti Soluzione di rosso fenolo M in acqua; Soluzione di verde di bromocresolo M in acqua; Soluzioni ai seguenti ph tamponati o controllati: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10;

15 14 Soluzioni di acido acetico (CH 3 COOH), acido fosforico (H 3 PO 4 ), carbonato acido di sodio (NaHCO 3 ) e NaOH Standard di ph per la calibrazione dell elettrodo a vetro per la misura di ph. Strumentazione Spettrofotometro UV-Visibile a doppio raggio; Cuvette in vetro da un centimetro (1 cm) di cammino ottico; ph-metro; Elettrodo a vetro. Procedura 1. In 8 matracci da 25 ml trasferire 1 ml di soluzione di rosso fenolo M e portare a volume con le otto soluzioni tampone a ph 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 precedentemente preparate 2. Azzerare lo spettrofotometro nell intero intervallo di lunghezze d onda riempiendo entrambe le cuvette (quella di misura e quella di riferimento) con acqua, selezionando la procedura BASE-LINE CORRECTION (n. 23 nel menù METODI); 3. Avvinare bene e quindi riempire la cuvetta di misura con la soluzione a ph 3, lasciando acqua nella cuvetta di riferimento; 4. Registrare lo spettro di assorbimento tra 300 e 700 nm; 5. Lavare bene la cuvetta di misura con acqua; 6. Ripetere i punti 3-5 per le altre soluzioni; 7. Identificare la lunghezza d onda del punto isosbestico e le lunghezze d onda dei due massimi di assorbimento relativi alla forma protonata e deprotonata; 8. calcolare le assorbività molari ε corrispondenti;

16 15 9. In otto matracci da 25 ml trasferire 2 ml della soluzione M di verde di bromocresolo e portare a volume con le otto soluzioni tampone a ph 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 precedentemente preparate; 10. Ripeter i punti 2 8 per le soluzioni di verde di bromocresolo. Procedura per l analisi della soluzione incognita 1. Azzerare lo spettrofotometro come al punto 2 della precedente procedura; 2. Preparare una soluzione a concentrazione nota nei due indicatori, prelevando ml di soluzione di rosso fenolo M e 1 2 ml di soluzione di verde di bromocresolo M; 3. Registrare lo spettro di assorbimento ed individuare i valori di assorbenza A utili alla contemporanea determinazione dei due indicatori. Calcolo della costante Ka Il calcolo della costante Ka dei due indicatori è possibile una volta determinati i valori dei coefficienti di assorbimento ε ai valori estremi di ph, ossia 3 e 10, utilizzando la relazione Ka In H HIn Si calcolano i valori di costante Ka per i valori intermedi di ph, e si esegue la media

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