Progetto proposto dal Dr. Antonino Trizzino. Responsabile della ricerca: Dott. P. D Angelo

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1 Progetto proposto dal Dr. Antonino Trizzino Responsabile della ricerca: Dott. P. D Angelo L IMMUNITA INNATA E L INSORGENZA DELLE NEOPLASIE PEDIATRICHE: STUDIO DEI POLIMORFISMI DEI GENI TLR 1-11 E PROSPETTIVE DI IMMUNOTERAPIA Presentazione dello studio, con riferimento allo stato dell arte ed alla rilevanza del progetto. E noto che soggetti immunodeficienti hanno un maggiore rischio di sviluppare un tumore. L attività citotossica mediata dalle cellule natural killer (NK) e dai linfociti è coinvolta in una larga serie di meccanismi che garantiscono l omeostasi del sistema immunitario. Tra questi, in campo oncologico, di particolare interesse è l attività d immunosorveglianza nei confronti di cellule tumorali. Infatti cellule NK e linfociti citotossici sono capaci di distruggere le cellule tumorali senza una precedente sensibilizzazione e sono responsabili della difesa di prima linea contro l insorgenza del tumore. Le cellule dell immunità innata riconoscono strutture molecolari conservate, presenti ad esempio in un gran gruppo di patogeni, denominate PAMP (componenti molecolari dei patogeni), grazie ai Recettori Tolllike (TLR). I TLR attori principali dell immunità innata, sono inoltre virtualmente presenti in tutte le cellule: intestino, fegato, vescica, cervice uterina e rene. Prospetto dei recettori Toll-like conosciuti Recettore Ligando(i) Sede ligando TLR 1 politriacil-lipopetidi Sede recettore Tipo Alcuni ceppi di cellule dendritiche TLR 2 poliglicolipidi polilipopeptidi polilipoproteine acido lipoteicoico Monociti/macrofagi mieloidi peptidoglicano Grampositivi HSP70

2 zimosano Funghi Vari altri TLR 3 RNA a doppia elica (dsrna), poli I:C Virus endosomi TLR 4 lipopolisaccaride (LPS) varie heat shock proteins fibrinogeno residui di eparansolfato residui di acido ialuronico Vari altri Gramnegativi e cellule TLR 5 flagellina Monociti/macrofagi mieloidi Epitelio intestinale Alcuni ceppi di cellule dendritiche Epitelio intestinale TLR 6 polidiacyl-lipopeptidi Mycoplasma Monociti/macrofagi TLR 7 imidazochinolina loxoribina (un analogo della guanosina) bropirimina Piccoli composti sintetici Organelli intracellulari plasmacitoidi RNA a singola elica TLR 8 piccoli composti sintetici; RNA a singola elica Organelli cellulari Alcuni ceppi di cellule dendritiche TLR 9 DNA con CpG non metilate Endosomi plasmacitoidi TLR 10 sconosciuto sconosciuta TLR 11 Profilina

3 uropatogeni epatociti rene epitelio vescicale TLR 12 sconosciuto sconosciuta?? TLR 13 sconosciuto sconosciuta?? Nell uomo sono stati descritti sino ad oggi 11 TLR. Le funzioni scatenate dai TLR, attraverso vie di segnalazione non ancora completamente chiarite, portano alla rapida produzione di citochine proinfiammatorie e promuovono la maturazione delle cellule dendritiche. Da tempo è noto che l interazione tra l ambiente ed il sistema immunitario gioca un ruolo essenziale nell eziologia di alcune patologie come i linfomi. È stata recentemente messa in evidenza una correlazione tra la presenza di un particolare polimorfismo di TLR2 (16933T>A) ed il rischio di sviluppare un linfoma follicolare. Una delezione di TLR2 ( del) è associata ad un rischio aumentato di presentare un carcinoma della cervice uterina. Il polimorfismo Thr399Ile di TLR4 è associato ad una aumentata suscettibilità all insorgenza del cancro gastrico. La presenza invece di 2 particolari polimorfismi in TLR10 ed di altri 4 in TLR1 è associata ad un rischio ridotto del 29-38% di cancro prostatico. L esatto ruolo dei TLR nella cancerogenesi non è stato ancora del tutto chiarito e potrebbe essere alquanto eterogeneo. Nel caso della leucemia linfatica cronica si pensa che la stimolazione infettiva cronica possa determinare attraverso l attivazione dei TLR una resistenza delle cellule alla morte programmata (apoptosi) e favorire la crescita delle cellule maligne. In altri casi invece si ipotizza che la stimolazione dei TLR possa indurre ed aumentare la presentazione di antigeni e l espressione di molecole target, che possano essere poi riconosciute dal sistema immunitario, in modo da facilitare l eliminazione delle cellule neoplastiche. Sono attualmente stati avviati numerosi studi sull effetto di agonisti dei TLR e la risposta antitumorale nei tumori solidi. Ad esempio un agonista del TLR7 è stato utilizzato nella terapia del cancro della pelle. Nelle patologie ematologiche maligne spesso i recettori di linea B ed i TLR continuano ad essere espressi. In questo caso i TLR agonisti potrebbero aumentare l espressione del CD20, un recettore di linea B, che già viene utilizzato come target della terapia di alcuni linfomi. In tal modo si potrebbe potenziare l effetto di una immunoterapia diretta contro le emopatie maligne. Questo progetto di ricerca ha l obiettivo di verificare il ruolo dei TLR nella patologia tumorale pediatrica. Le informazioni ottenute da questo studio potrebbero chiarire se polimorfismi dei TLR si associano ad un maggiore rischio di sviluppare tumori in età pediatrica (leucemie acute mieloidi e linfoidi, neuroblastomi, tumori SNC etc). Potrebbero rappresentare una base razionale per la progettazione di strategie di immunomodulazione volte a potenziare o ripristinare le funzioni di

4 immunoregolazione. La cooperazione fra i diversi effettori dell'immunità naturale (eventualmente potenziata dall'uso immunoterapeutico dei ligandi dei TLR) potrebbe essere anche efficace nel superare le strategie di evasione dei tumori. Lo studio delle mutazioni e dei polimorfismi dei geni TLR1-11 verrà programmato con un approccio sequenziale. In una prima fase verranno ricercate mediante minisequencing, un metodo che permette la contemporanea identificazione di numerose mutazioni note, le mutazioni più frequenti. Le anomalie identificate verranno confermate con la sequenza standard del segmento di DNA interessato dalla mutazione. Nei soggetti affetti da neoplasie e nei soggetti controllo, verrà effettuato lo screening delle mutazioni note, al fine di valutare se esiste una correlazione tra genotipo e rischio di insorgenza del tumore, l analisi dell intera sequenza dei geni verrà effettuata esclusivamente in quei soggetti affetti da neoplasia che mostrato alterazioni delle funzioni citotossiche. Questo progetto costituisce il primo studio di correlazione tra il genotipo dei TLR e rischio tumorale, svolto in età pediatrica e sarà in grado di chiarire il ruolo dell immunità innata nella determinazione della predisposizione allo sviluppo di malattia tumorale in età pediatrica. Nel caso in cui venisse confermata questa correlazione, come già avvenuto in molti tumori dell adulto, si aprirebbe la strada a nuovi schemi terapeutici immunoterapici con la possibilità di migliorare la prognosi di molti pazienti. Metodologia Il progetto verrà svolto presso il laboratorio della U.O. di Oncoematologia Pediatrica dell Ospedale dei Bambini; questa struttura, Centro di riferimento dell AIEOP (Associazione Italiana di Ematologia ed Oncologia Pediatrica), accoglie la maggior parte dei bambini affetti da leucemie e tumori solidi della Sicilia centro-occidentale; inoltre il Laboratorio è di riferimento per lo studio genetico della LEF, della sindrome da Iper IgE e delle encefaliti erpetiche; le caratteristiche dell Unità Operativa garantiscono la selezione nell arco dell anno di circa 50 casi tra leucemie e tumori solidi e la disponibilità attuale di una cospicua DNA-teca di soggetti leucemici per studi retrospettivi. Inoltre, grazie alla collaborazione con l AIEOP, si potrebbe avere accesso a campioni di DNA costituzionale di pazienti con tumori in età pediatrica seguiti in altri centri AIEOP in Italia. Metodologia applicata per lo svolgimento del progetto: Reazione di Polimerizzazione a Catena utilizzando enzimi ad alta specificità (HotStart-PCR); Sequenziamento: l analisi di sequenza verrà effettuata direttamente sui prodotti di amplificazione purificati (GFX- PCR purification columns, Amersham) applicando la metodologia di Sanger modificata (Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystem); i prodotti di sequenza verranno visualizzati mediante elettroforesi capillare e l analisi verrà effettuata mediante software specifici

5 (ABI PRISM Sequencing Analysis, SeqScape). Le sequenze ottenute verranno comparate a quelle esistenti in banca dati (NCBI-BLAST). Minisequenziamento: questo tipo di tecnica è stato studiato per l individuazione di mutazioni puntiformi e polimorfismi noti. La reazione è basata sull estensione di una singola base di un primer oligonucleotidico utilizzato per la minisequenza single nucleotide extension. La reazione è stata standardizzata per l identificazione contemporanea di diverse posizioni nucleotidiche di interesse (ABI PRISM SNaPshot Multiplex Kit). Durante la reazione di sequenza il primer con il 3 prossimale alla posizione da indagare, in presenza di dideossinucleotidi marcati con fluorocromi che fungono da terminatori della reazione, potrà incorporare un singolo nucleotide; i prodotti di reazione verranno visualizzati come picchi di emissione di fluorescenza mediante elettroforesi capillare (ABI PRISM 3130 Applied Biosystems) ed analizzati con un software specifico (GeneMapper Applied Biosystems). Il colore dei picchi di emissione permetterà di individuare la base nucleotidica incorporata. Le sequenze dei primers verranno dedotte dalla sequenza genomica dei geni TLR1-11. Obiettivi del progetto selezione dei pazienti affetti da neoplasia in età pediatrica; screening dei polimorfismi dei TLR nelle neoplasie e nei soggetti controllo; valutazione di eventuali correlazioni fra genotipo e rischio di insorgenza dei tumori infantili; in particolare verifica dell associazione di polimorfismi noti con il rischio relativo delle singole patologie neoplastiche pediatriche. L associazione di un particolare polimorfismo ad una data patologia potrà meglio chiarire i meccanismi patogenetici. Valutazioni terapeutiche mediante immunoterapia; Utilizzando agonisti dei TLR può essere possibile aumentare l espressione di antigeni bersaglio da parte delle cellule neoplastiche che diventano più sensibili all immunoterapia. Fattibilità. Il progetto è immediatamente applicabile grazie alla possibilità di usufruire delle elevatissime competenze di biologia molecolare del laboratorio della U.O.; in particolare è già stata avviata la metodica di sequenziamento del TLR3 ed è già disponibile una ricca DNA teca in cui sono conservati numerosi campioni che consentiranno di avviare il lavoro in tempi rapidissimi. Ricadute applicative. Le ricadute applicative sono potenzialmente molto importanti perché consentono, con uno sforzo ed un costo relativamente limitati, la possibilità immediata di cambiare la prognosi di alcune patologie pediatriche in cui la terapia convenzionale riesce tuttora a raggiungere risultati modesti. Il neuroblastoma ad esempio ne casi ad alto rischio ha tuttora un event free survival intorno al 30%.

6 Bibliografia. 1. Wolska A, Lech-Maranda E, Robak T. Toll-like receptors and their role in hematologic malignancies. Curr Mol Med Apr;9(3): Muzio M, Scielzo C, Bertilaccio MT, Frenquelli M, Ghia P, Caligaris-Cappio F. Expression and function of toll like receptors in chronic lymphocytic leukaemia cells. Br J Haematol Feb;144(4): Chiron D, Bekeredjian-Ding I, Pellat-Deceunynck C, Bataille R, Jego G. Toll-like receptors: lessons to learn from normal and malignant human B cells. Blood Sep 15;112(6): Nieters A, Beckmann L, Deeg E, Becker N. Gene polymorphisms in Toll-like receptors, interleukin-10, and interleukin-10 receptor alpha and lymphoma risk. Genes Immun Dec;7(8): Pandey S, Mittal RD, Srivastava M, Srivastava K, Singh S, Srivastava S, Mittal B. Impact of Tolllike receptors [TLR] 2 (-196 to -174 del) and TLR 4 (Asp299Gly, Thr399Ile) in cervical cancer susceptibility in North Indian women. Gynecol Oncol Sep;114(3): Epub 2009 Jun Santini D, Angeletti S, Ruzzo A, Dicuonzo G, Galluzzo S, Vincenzi B, Calvieri A, Pizzagalli F, Graziano N, Ferraro E, Lorino G, Altomare A, Magnani M, Graziano F, Tonini G. Toll-like receptor 4 Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms in gastric cancer of intestinal and diffuse histotypes. Clin Exp Immunol Dec;154(3): Stevens VL, Hsing AW, Talbot JT, Zheng SL, Sun J, Chen J, Thun MJ, Xu J, Calle EE, Rodriguez C. Genetic variation in the toll-like receptor gene cluster (TLR10-TLR1-TLR6) and prostate cancer risk. : Int J Cancer Dec 1;123(11): Achyut BR, Ghoshal UC, Moorchung N, Mittal B. Association of Toll-like receptor-4 (Asp299Gly and Thr399Ileu) gene polymorphisms with gastritis and precancerous lesions. Hum Immunol Nov; 68(11):901-7.

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