BATTERI E SALUTE DELL INTESTINO: DAL LATTANTE ALL ADULTO IL PUNTO SU PROBIOTICI E MALATTIA INFIAMMATORIA INTESTINALE NEL BAMBINO

Transcript

1 - BATTERI E SALUTE DELL INTESTINO: DAL LATTANTE ALL ADULTO IL PUNTO SU PROBIOTICI E MALATTIA INFIAMMATORIA INTESTINALE NEL BAMBINO Prof. F. M. Paone DIRETTORE U.O.S.D. Pediatria e Gastroenterologia Pediatrica Policlinico Tor Vergata, Roma Sebbene la maggior parte delle malattie infiammatorie croniche dell intestino interessi l età adulta, circa il 20% di queste esordisce in soggetti di età inferiore a 16 anni Negli ultimi anni si è assistito ad un aumento di diagnosi di MICI in età pediatrica Probabilmente c è un aumento della reale incidenza di queste patologie L incidenza stimata è di 3-20 casi per /anno Il picco di massima incidenza di MICI si manifesta tuttavia tra la seconda e la terza decade di vita. LA FAMILIARITA NELLE MALATTIE INFIAMMATORIE CRONICHE INTESTINALI -E maggiore il rischio di sviluppare una MICI se c è una storia familiare positiva -L incidenza di MICI tra parenti di 1 grado di pazienti con MICI è volte maggiore rispetto alla popolazione generale. -Il 15% circa di pazienti MICI ha parenti di 1 grado colpiti da MICI. -Il rischio stimato di sviluppare MICI in parenti di 1 grado di soggetti colpiti è 8.9% per i figli, 8.8% per i fratelli, 3.5% per i genitori. -Associazione di alcuni geni HLA classe II con la malattia di Crohn (DR1/DQw5 DRB3*0301) e con la colite ulcerosa (HLADR2). PATOGENESI E fondamentale cercare di capire se l attività infiammatoria cronica e ricorrente rifletta una risposta adeguata ad uno stimolo abnorme. oppure sia espressione di una risposta anormalmente prolungata ad uno stimolo normale cioè una alterata regolazione della risposta immunitaria. Varie le ipotesi: Persistenza di un patogeno specifico Induzione da parte di un patogeno e in seguito permanenza dell infiammazione Patologia anomala indotta da patogeni enterici endogeni Risposta immunitaria dell ospite anomala verso microrganismi ubiquitari o verso componenti di questi Tuttavia, l ipotesi dominante è che si verifichi un anomala risposta immunologica/infiammatoria da parte dell ospite verso antigeni comunemente presenti nel lume intestinale. Probabilmente a causa di una perdita della tolleranza o di un alterata permeabilità intestinale, viene attivata la risposta immune ma soprattutto non si verificano i normali meccanismi di controllo della risposta infiammatoria e, pertanto, si determina la cronicità del processo infiammatorio. Uno dei fondamentali meccanismi di regolazione della risposta immunologica ed infiammatoria risiede nel patrimonio genetico del paziente. Nonostante l'eziologia rimanga sconosciuta, è generalmente riconosciuto che la patogenesi delle MICI sia multifattoriale, coinvolgendo fattori genetici, ambientali ed immunologici L'infiammazione sarebbe il risultato soprattutto di una disregolazione del sistema immunitario adattativo, che porterebbe alla perdita di tolleranza verso la flora batterica

2 intestinale e ad una risposta aberrante alla flora normalmente residente nel lume intestinale IPOTESI INFETTIVA Numerosi i patogeni chiamati in causa: per il MC: i micobatteri, il Paramixovirus, la Listeria, la Clamidia. Per la CU: i Bacterioides, la Shigella, i virus a RNA e il diplostreptococco La flora intestinale sembra importante nella patogenesi delle MICI:è infatti dimostrato che in animali germ-free queste malattie non si sviluppano. Del resto si è visto che il MC migliora con la decontaminazione batterica. L intestino svolge una duplice funzione: permette l assorbimento dei nutrienti contrasta l eventuale effetto lesivo di microbi (sia saprofiti che patogeni) e antigeni estranei per mezzo di: MECCANISMI NON IMMUNOLOGICI -acidità gastrica -secrezioni enzimatiche e muco -peristalsi intestinale -epitelio e tight junctions MECCANISMI IMMUNOLOGICI -GALT (gut-associated lymphoid tissue) costituito da tessuto linfatico organizzato nelle Placche del Peyer, nell epitelio, nella lamina propria e nei linfonodi mesenterici. I bambini sani sono sterili prima della nascita. Durante il parto e nei primi giorni di vita i batteri colonizzano rapidamente l intestino. La maggior parte del tessuto linfatico umano è localizzato all interno e intorno al tratto gastrointestinale e la colonizzazione batterica della sua mucosa rappresenta uno stimolo immunologico chiave per lo sviluppo del sistema immunitario. La colonizzazione dell intestino sterile da parte di batteri commensali è anche essenziale per l induzione della tolleranza verso gli allergeni orali. Il gold standard della nutrizione iniziale del bambino è il latte materno. L allattamento al seno è associato a una ridotta prevalenza di allergia in numerosi studi epidemiologici. Il latte materno promuove la colonizzazione dell intestino con batteri commensali non patogeni (probiotici). I Bifidobacterium, come rappresentanti dei probiotici, sono prevalenti nelle feci degli allattati al seno, mentre i Clostridiae, come rappresentanti dei batteri più patogeni, sono più abbondanti nelle feci degli allattati artificialmente. Studi epidemiologici condotti a partire dal 1990 hanno mostrato una associazione di più alte cariche di batteri probiotici e più basse di batteri patogeni nelle feci di popolazioni a bassa prevalenza di allergia. L'intestino umano contiene una biomassa di almeno 100 trilioni di microbi viventi e si è passati dalla conoscenza di circa 400 specie batteriche residenti nell'intestino a circa generi, che includono tra le e le specie L'intestino è infatti una nicchia tutta speciale per la vita microbica, essendo una cavità priva di luce e di ossigeno, con alcune zone acide, altre basiche, altre ancora neutre, ricca di acqua, minerali e nutrienti: è quindi favorevole alla crescita di microrganismi anaerobi, che vi trovano un'enorme superficie d'impianto, pari, con lo sviluppo di pliche, villi e microvilli, a 300 metri quadrati! L intestino contiene oltre il 60% delle cellule immunitarie del corpo umano e la sua flora incrementa la produzione di IgA.

3 La microflora ha un ruolo immunitario importante poiché ha la funzione di evitare che batteri intestinali patogeni possano attraversare la mucosa ed arrivare ai tessuti. La risposta immunitaria ai micro organismi è a livello delle placche di Peyer dove i linfociti migrano e maturano e si diffondono in tutto l organismo. Il corpo umano è costituito da circa miliardi di cellule e ospita una popolazione batterica di circa miliardi di cellule, in rapporto di 1: In termini evoluzionistici, i 10 batteri presenti nell'intestino hanno una varietà di geni superiore di 100 volte a quelli dell'uomo e questa varietà di geni apre la possibilità di una miriade di funzioni che per le cellule umane non sarebbero altrimenti possibili. Il contributo dei geni di origine batterica è chiaramente un vantaggio ecologico ed evolutivo ed è confermato da numerose prove sperimentali e cliniche. I BATTERI I BATTERI sono organismi VEGETALI, PROCARIOTI (senza nucleo organizzato), le reazioni biochimiche avvengono nel loro citoplasma e non possiedono organuli. Oltre al filamento di DNA che codifica le funzioni principali hanno un frammento di DNA a forma di anello detto PLASMIDE che trasmette alcuni caratteri secondari. Hanno una lunghezza che varia tra 1µ e 10µ. In genetica, si definisce plasmide (anche plasmidio) un frammento di DNA presente nel citoplasma di numerosi batteri, capace di replicazione autonoma all'interno di una cellula (batterica oppure eucariotica). È di fatto un piccolo cromosoma indipendente. La maggior parte dei plasmidi conosciuti sono molecole circolari, ma ne esistono anche lineari. Spesso porta geni che codificano caratteristiche non essenziali ma che, in situazioni specifiche, possono conferire un vantaggio evolutivo (es., resistenza agli antibiotici, resistenza a sostanze tossiche, capacitá metaboliche aggiuntive). Alcuni plasmidi sono trasmissibili (da una cellula donatrice a una ricevente) tra cellule della stessa specie o anche tra cellule di specie diverse. Per questa ragione si suppone che i plasmidi siano responsabili di buona parte del fenomeno del trasferimento laterale o orizzontale di geni (lateral o horizontal gene transfer), meccanismo che permette lo scambio e la diffusione di geni. I microbi possono essere divisi in utili, dannosi oppure indifferenti. Nell'individuo che sia e voglia mantenersi sano devono prevalere i batteri utili, che producono nutrienti essenziali, come vitamine e acidi organici, e inibiscono l'impianto e la crescita di batteri patogeni nell'intestino. I batteri dannosi invece mettono in pericolo la salute dell'ospite attraverso la produzione di tossine, che agiscono sull'invecchiamento,sulla cancerogenesi sulle funzioni renali, epatiche, cerebrali, immunitarie. I BATTERI INTESTINALI SERVONO? Il ruolo della microflora intestinale è in corso di totale rivalutazione negli ultimi anni. Si è passati dalla paura dei batteri, visti come una minaccia per la salute e per la vita stessa delle persone, che rendeva necessaria la "sterilità" come condizione di benessere, all'attuale più moderna concezione che i batteri non solo non sono tutti e sempre pericolosi, ma che sono, anzi, generalmente necessari per un normale sviluppo e funzionamento di numerose funzioni biologiche. Elia Metchnikoff (Nobel del 1908) aveva prospettato nel suo "Essais Optimistic" (tradotto nella più nota edizione Inglese "The prolongation of life") la possibilità di ottimizzare la microflora, a suo avviso costituita solo da germi putrefattivi, utilizzando prodotti lattierocaseari fermentati: "... dato che la fermentazione del latte è cosi utile nell'arrestare i fenomeni putrefattivi, perché non utilizzarla per lo stesso scopo nel tubo digerente?.. coloro che non conoscono

4 questi problemi potrebbero essere sorpresi dalla raccomandazione di ingerire grandi quantità di microbi, visto che è convinzione comune che essi siano dannosi... vi sono molti germi utili e tra questi i lattobacilli rivestono un ruolo determinante" (1906!). In Francia nel 1906 la società "Le Ferment" iniziò a commercializzare un latte fermentato "Lactobacilline" prodotto con ceppi batterici selezionati dallo stesso Metchnikoff, qualche anno dopo, nel 1925 il termine "youghourt" entrò nel dizionario "Petit Larousse" per ricapitolare le difese naturali dell intestino Sono rappresentate da : Microflora batterica intestinale probiotica Mucosa ed epitelio intestinale Sistema immunitario intestinale Requisiti richiesti ai probiotici essere sicuri per l'impiego umano resistere a ph bassi e al sistema immunitario intestinale resistere al succo gastrico, pancreatico e sali biliari essere vivi e vitali Inoltre il probiotico deve rimanere metabolicamente attivo nel lume intestinale dove dovrebbe transitoriamente poter sopravvivere. I PROBIOTICI: Aiutano la digestione e l assorbimento delle sostanze nutritive Supportano le funzioni immunitarie Sintetizzano le vitamine del gruppo B e sono fondamentali per i vegetariani stretti La vitamina K che producono è di qualità migliore di quella che assorbiamo con la dieta Producono il 10% del nostro fabbisogno di aminoacidi Riparano le pareti dell intestino; senza, le pareti intestinali sarebbero più permeabili e quindi più attaccabili da agenti patogeni Trasformano parte del materiale di scarto in aminoacidi utili alla riparazione Sintetizzano gli Acidi Grassi Essenziali, in particolare l Acido Butirrico e Acetico, per produrre energia dal 10 al 30% Producono enzimi: Lactasi Disintossicano Legano ed espellono i metalli pesanti Controllano i grassi e gli zuccheri Aiutano l equilibrio ormonale perché aiutano ad eliminare parti di ormoni in eccesso Aiutano l autodisintossicazione del fegato perché i batteri cattivi sciolgono il legame delle sostanze tossiche che devono essere espulse Prevengono i calcoli della cistifellea Effetto anticoagulante Aiutano nelle affezioni cardiologiche Possono vivere in un ambiente molto acido e quindi partecipano all espulsione della Salmonella. Senza probiotici anche 10 batteri di Salmonella creano un infezione

5 Eliminano gli eccessi di estrogeni Occupano totalmente lo spazio nel quale potrebbero invece patogeni; in pratica vincono la competizione nel substrato Con una buona dieta diventano più efficaci Producono sostanze antibiotiche annidarsi i batteri Impediscono che gli acidi biliari si trasformino in agenti cancerogeni Per i bambini è fondamentale alla nascita l imprinting che danno i Probiotici al sistema immunitario e li previene dalle allergie Sono fondamentali, specie perché viviamo in un era in cui i batteri patogeni sono sempre più resistenti agli antibiotici Quelli stabili possono essere considerati totalmente non patogeni cioè, non mutano in batteri pericolosi I batteri e la salute dell intestino Il colon umano contiene oltre specie di batteri e attualmente gli scienziati stanno studiando gli effetti delle varie specie e il ruolo che svolgono nella salute intestinale. Nell intestino degli adulti è presente oltre un chilo di batteri e ogni anno viene espulsa una quantità di batteri fecali pari al proprio peso corporeo! Ci aiutano a digerire e ci proteggono da infezioni, chiedendo in cambio 'vitto e alloggio'. Alcune ricerche suggeriscono che questi batteri buoni, o cosiddetti "probiotici", possono aiutare a mantenere un salutare equilibrio batterico, stimolare l immunità intestinale e prevenire la colonizzazione da parte di organismi patogeni che causano disturbi allo stomaco e all intestino e provocano la diarrea. Si stanno conducendo ulteriori studi sul possibile ruolo dei probiotici nella prevenzione di allergie, nel miglioramento della peristalsi e nella partecipazione alla formazione di alcune vitamine. La loro capacità di sopravvivere nel passaggio attraverso il tratto gastroenterico è stata studiata approfonditamente in questi anni La sopravvivenza per alcuni ceppi è stata stimata intorno al 20-40%. Lattobacillo GG, Lattobacillo LG, Lattobacillo Reuteri, Rhamnosus, acidofilo e Bifidobatterio spp., e Saccaromices Boulardii, Paracasei F19 sono i ceppi di cui possediamo maggiori informazioni. Accertato e molto rilevante, è l effetto dei probiotici su alcune patologie gastrointestinali, in particolare, questi determinano un effetto benefico nelle patologie infettive del tratto gastroenterico e in tutte le patologie su base infiammatoria. (1-2) La ragione di ciò è dovuta alle numerose interazioni, ben documentate da numerosi trials clinici, dei probiotici con i vari costituenti del tratto gastrointestinale. (3-4) È evidente, oggi, come il trattamento con un preparato che contenga probiotici in concentrazioni elevate, abbia un'altissima probabilità di indurre effetti fisiopatologici e quindi la risposta clinica desiderata In pazienti con colite ulcerosa in remissione si è dimostrato che l'uso dei probiotici modifica positivamente le condizioni della microflora batterica intestinale e, soprattutto, il numero delle ricadute era sovrapponibile a quello ottenibile con i farmaci tradizionali (5) Un altro dato piuttosto recente è che, anche in pazienti con il morbo di Crohn, la somministrazione dei probiotici ad alte dosi e per lunghi periodi ha mantenuto la malattia quiescente senza bisogno di ulteriori farmaci. Quest'ultimo dato è particolarmente significativo, soprattutto in quanto renderebbe possibile un buon livello di benessere solo con l'impiego di sostanze naturali. PROBLEMI APERTI E PROSPETTIVE

6 Tra i vari probiotici disponibili sul mercato non tutti possiedono i requisiti fondamentali elaborati da un gruppo di esperti della FAO e OMS le cui caratteristiche devono includere la sopravvivenza al transito gastro-pancreatico e la persistenza nel colon umano. Ciò deriva dal fatto che non disponiamo di dati sull'uso a lungo termine dei probiotici e suoi rischi connessi al loro uso. Infatti sono stati descritti casi di traslocazione batterica e sepsi a seguito del loro utilizzo. (6-7) Gli esperti hanno identificato 4 ordini di effetti avversi: infezioni sistemiche attività metaboliche dannose eccessiva stimolazione del sistema immune in individui suscettibili trasferimento di materiale genetico ( ) REQUISITI FONDAMENTALI PER DEFINIRE UN PROBIOTICO Essere di origine umana Resistere all attacco delle secrezioni bilio-gastriche Non perdere le caratteristiche durante la conservazione Colonizzare l intestino umano ed adire alle cellule mucose Produrre sostanze antimicrobiche Inibire i batteri patogeni Essere validato clinicamente nei suoi effetti terapeutici Essere stabile geneticamente Non indurre antibiotico-resistenza Pertanto un ulteriore elemento che deve caratterizzare un probiotico deve includere anche la dimostrata stabilità genetica e la sua capacità di non sviluppare antibiotico-resistenza. Tale requisito non trova oggi riscontro nella maggioranza dei probiotici disponibili sul mercato non offrendo così la necessaria garanzia di sicurezza. (13) Da oltre 14 anni si è reso disponibile il Lactobacillus F19 (species paracasei subsp. paracasei F 19) che è stato sviluppato in accordo con i requisiti fondamentali sopracitati in particolare la stabilità genetica e la sua capacità di non sviluppare antibiotico-resistenza. (14-15) Ciò è particolarmente importante per alcune malattie del tratto digestivo quali: le malattie infiammatorie intestinali, la MD e la SII, nelle quali i pazienti dovrebbero usare probiotici per lunghi periodi di tempo. Inoltre studi recentissimi hanno osservato, mediante lo studio della GENOMlCA, l'interazione positiva e benefica tra la flora batterica intestinale e il sistema immunitario, mediata da batteri intelligenti che possiamo definire anche NUTRIGENOMIC.I I Nutrigenomici possono inoltre offrire un ulteriore vantaggio, poiché migliorano sia le proprietà organolettiche degli alimenti sia perché capaci di interagire sul metabolismo umano anche quando assunti con gli alimenti ristabilendo la corretta connessione tra cibi e normale microflora. NUTRIGENOMICA

7 Tecnica utilizzata per la prima volta nell Ottobre 2004 e che esprime quanto segue: CAPACITA DI UN ALIMENTO FUNZIONALE DI INTERAGIRE IN MANIERA DOCUMENTATA SULLO STATO DI BENESSERE DELL ORGANISMO SENZA ALTERARE LE CARATTERISTICHE GENETICHE DELLA FLORA RESIDENTE Alimento Funzionale (Functional Food) Può essere ottenuto con : Aggiunta al cibo ordinario di ingredienti attivi (probiotici) Agenti antiossidanti (alcune vitamine e minerali ) Oligosaccaridi ( prebiotici) Eliminazione dal cibo ordinario di certi ingredienti indesiderati (ad es. componenti allergenici) NUTRIGENOMICA Applicata ai batteri E la capacità dimostrata e/o dimostrabile di effetti salutari ove è indicata la somministrazione di batteri (patologia dell intestino) e l interazione degli stessi con altri organi, sistemi ed apparati dell organismo senza indurre antibiotico-resistenza. I Nutrigenomici - Lactobacillus F19 (species paracasei subsp. paracasei F19) sono probiotici di nuova generazione che possono rappresentare un importante progresso terapeutico con elevati profili di sicurezza nelle malattie digestive utilizzabili per controllare il fenomeno della antibiotico-resistenza ed evitare il trasferimento di materiale genetico. Antibiotico-resistenza E DIVENTATA UNA EMERGENZA MONDIALE L OMS sta da tempo sconsigliando l uso indiscriminato degli antibiotici e la somministrazione di sostanze o prodotti che possano avere attivita di induzione di antibiotico-resistenza. PROBIOTICI:TUTTI UGUALI? Erika Mileti e Maria Rescigno (16), nel loro lavoro concludono: Abbiamo scoperto che L. plantarum e LGG, coerenti con le loro capacità di attivare fortemente le cellule dendritiche, non solo si sono dimostrati inefficaci nella protezione contro la colite, ma si sono in realtà dimostrati dannosi. infatti, i topi con colite trattati con LGG e L. plantarum hanno mostrato un aumento dell'indice di attività della malattia (DAI) e tutti sono morti tra i 10 e i 12 giorni dalla somministrazione. Al contrario, i topi che hanno ricevuto L. paracasei F19, hanno mostrato un ritardo nella comparsa della colite e una riduzione della gravità della malattia (come dimostrato dal DAI ridotto). In conclusione, i probiotici dovrebbero essere suddivisi in immunostimolanti e immunomodulanti in base alla loro capacità di interagire con le cellule immunitarie e non immunitarie, e il loro uso clinico dovrebbe essere applicato di conseguenza (17). Per esempio, LGG, che risulta essere immunostimolante, ha dimostrato di essere più appropriato nella prevenzione delle infezioni nosocomiali di diarrea da rotavirus nei neonati o nel ridurre l'incidenza della dermatite atopica piuttosto che come terapia di supporto nei bambini con CD o in pazienti con CD dopo un intervento chirurgico (18). al contrario L. paracasei F19, che risulta essere immunomodulante, può essere utilizzato in corso di malattie infiammatorie e può essere consigliato per mantenere la fase

8 di remissione di malattia infiammatoria intestinale. Quindi, ogni ceppo probiotico dovrebbe essere utilizzato in base alla sua attività immunitaria, prima di essere proposto per applicazioni cliniche (19-20). RICORDIAMO INOLTRE: 1) Non tutti i probiotici sono uguali 2) Non tutti i probiotici sono in grado di fermentare fibre semi-resistenti 3) Non tutti i probiotici sono in grado di poter scindere glicoproteine 4) Non tutti i probiotici sono in grado di controllare le infezioni 5) Non tutti i probiotici sono in grado di svolgere un ruolo positivo sul sistema immune 6) Non tutti i probiotici sopravvivono al passaggio attraverso il tratto gastrointestinale INOLTRE: 1) Alcuni probiotici causano antibiotico-resistenza 2) Alcuni probiotici sono pro-infiammatori 3) Alcuni probiotici sono anti-infiammatori 4) Alcuni probiotici sono causa di trasferimento genico orizzontale Per queste ragioni, è sempre preferibile scegliere batteri probiotici di nuova generazione, dalla certificata stabilità genetica e validati da studi di farmacogenomica. La stabilità genetica è la garanzia di un prodotto stabile in grado di conservare le proprie caratterische salutari. Esprime la stabilità del componente plasmidico di un batterio che deve conservare nel tempo il tipico profilo originale Tenendo presente il concetto della "evidence based medicine" possiamo affermare che oggi, in alcune condizioni cliniche e per alcuni quadri patologici, la somministrazione dei probiotici trova un reale razionale scientifico mentre per altri l'effetto dei probiotici e l'evidenza di efficacia deve essere ancora chiarita e confermata. CONCLUSIONI: l ideale sarebbe individuare e realizzare: -Meccanismi molecolari specifici con cui la flora endogena attiva processi di difesa immunologica a livello intestinale -Meccanismi di interazione batteri-epitelio intestinale (cross-talk) -Studi clinici rigorosi controllati (randomizzati - placebo) sull uso dei probiotici in patologie di natura intestinale ed extraintestinale -Miglioramento delle modalità di produzione e conservazione -Migliore controllo di qualità dei prodotti in commercio -Migliore definizione di dosi e modalità di somministrazione -Probiotici geneticamente modificati per un uso mirato contro particolari patogeni

9 BIBLIOGRAFIA 1) Balfour Sartor R. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology 2008;134: ) Ruemmele F, Bier O, Marteau P, Rechkemmer G, Bourder-Sicard R, Wolker WA, Goulet o. Clinical evidence far immunomodulatory effects of probiotic bacteria. JPediatr Gastroenterol Nutr Feb;48(2): ) Tao Y, Drabik KA, Waypa TS, et al. Soluble factors from Lactobacillus activate MAPKs and induce cytoprotective heat shock proteins in intestinal epithelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 2006;290: ) Petrof EO, Kojima K, Ropeleski MJ, et al. Probiotics inhibit nuclear factor-kappab and induce heat shock proteins in colonic epithelial cells through proteasome inhibition. Gastroenterology 2004;127: ) Stephani J, Radulovic K, Niess JH. Gut microbiota, probiotics and inflammatory bowel disease.arch Immunol Ther Exp (Warsz) Jun;59 (3): ) FAO/WHO. Guidelines for the eva!uation of probiotics in food Expert consultation report: London Ontario, Canada: Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization. 30 April - 1 May, ) Borriello SP, Hammes WP. Holzapfel W, er al. Safety of probiotics that contain lactobacilli or bifidobacteria. Clin Infect Dis 2003; 15;36: ) De Groote MA, Frank DN, Dowell E, Glode MP, Pace NR. Lactobacillus rhamnosus GG bacteremia associated with probiotic use in a child with short gut syndrome. Pediatr Infect Dis J Mar;24(3): ) Huys G, D'Haene K, Swings J Genetic basis of tetracycline and minocycline resistance in potentially probiotic Lactobacillus plantarum strain CCUG Antimicrob Agents Chemother Apr;50(4): ) Herbrecht R, Nivoix Y. Saccharomyces cerevisiae fungemia: an adverse effect of Saccharomyces boulardii probiotic administration. Clin Infect Dis Jun 1;40(11): ). Salminen MK, Rautelin H, Tynkkynen S, Poussa T, Saxelin M, Valtonen V, Järvinen A. Lactobacillus bacteremia, clinical significance, and patient outcome, with special focus on probiotic L. rhamnosus GG. Clin Infect Dis Jan 1;38(1): ) Zein EF, Karaa S, Chemaly A, Saidi I, Daou-Chahine W, Rohban R. Lactobacillus rhamnosus septicemia in a diabetic patient associated with probiotic use: a case report]. Ann Biol Clin (Paris) Mar-Apr;66(2): ) FAO/WHO. Guidelines for the eva!uation of probiotics in food Expert consultation report: London Ontario, Canada: Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization. 30 April - 1 May, 2002.

10 14) Sullivan A. Johansson A. Svenungsson B, Nord CE. Effect of Lactobacillus F 19 on the emergence of antibiotic-rcsistant microorganisms in the intestinal microflora. J Antimicrob Chemother 2004;54(4): ) Sullivan A. Barkholt L. Nord CE. Lactobacillus acidophihus, Bifidobacterium lactis and Lactobacillus F 19 prevent antibiotic-associated ecological disturbances of Bacteroides fragilis in the intestine. J Antimicrob Chemother 2003:52(2): ) Erika Mileti, Gianluca Matteoli, Iliyan D. Iliev, Maria Rescigno Comparison of the Immunomodulatory Properties of Three Probiotic Strains of Lactobacilli Using Complex Culture Systems: Prediction for In Vivo Efficacy PLoS ONE - September 2009 Volume 4 Issue 9 e ) Szajewska H, Kotowska M, Mrukowicz JZ, Armanska M, Mikolajczyk W (2001) Efficacy of Lactobacillus GG in prevention of nosocomial diarrhea in infants. J Pediatr 138: ) Kalliomaki M, Salminen S, Arvilommi H, Kero P, Koskinen P, et al. (2001) Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo controlled trial. Lancet 357: ) Bousvaros A, Guandalini S, Baldassano RN, Botelho C, Evans J, et al. (2005) A randomized, double-blind trial of Lactobacillus GG versus placebo in addition to standard maintenance therapy for children with Crohn s disease. Inflamm Bowel Dis 11: ) Prantera C, Scribano ML, Falasco G, Andreoli A, Luzi C (2002) Ineffectiveness of probiotics in preventing recurrence after curative resection for Crohn s disease: a randomised controlled trial with Lactobacillus GG. Gut 51: