Li idi pidi idi li idi popro i ruolo del laboratorio nelle dislipidemie

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1 Lipidi idi e lipoproteine: i ruolo del laboratorio nelle dislipidemie Anna Maria Eleuteri

2 Lipidi I lipidi del sangue sono, principalmente: - fosfolipidi, - trigliceridi, - colesterolo libero ed esterificato. Si trovano aggregati, a causa della loro idrofobicità, a specifiche proteine di trasporto, le apolipoproteine.

3 Lipidi: colesterolo - Costituente delle membrane e precursore di acidi biliari i e di ormoni steroidei; i - Associato a patologie cardiovascolari e ictus; - Equilibrio tra biosintesi, utilizzo e trasporto riducono la deposizione in placche aterosclerotiche al minimo.

4 Lipidi: colesterolo

5 Lipoproteine Apolipoproteine e lipidi associati costituiscono le lipoproteine. Funzioni proteine (apo): - di trasportot - strutturali ( guscio polare solubilità), - attivazione enzimatica e regolazione (cofattori) di enzimi correlati al metabolismo lipidico, - interazione con recettori di membrana (consentono endocitosi).

6 Lipoproteine In base a separazione all ultracentrifuga vengono classificate in 4 frazioni: chilomicroni hanno densita inferiore a 1 g/ml, trasportano i trigliceridi di origine alimentare quindi sono presenti nel plasma durante la fase di assorbimento intestinale; lipoproteine a bassissima densita o VLDL (very low density lipoproteins) con densita inferiore a g/ml, contengono i trigliceridi endogeni, sintetizzati nel fegato a partire da altri substrati; lipoproteine a bassa densita o LDL (low density lipoproteins) con densita compresa tra e g/ml, costituite da colesterolo libero ed esterificato e da fosfolipidi; lipoproteine i ad elevata densita o HDL (high h density lipoproteins) i hanno densita compresa tra e 1.21 g/ml e contengono, in ugual misura, colesterolo e fosfolipidi; il contenuto proteico si aggira intorno al 50%.

7 Lipoproteine Le singole frazioni i lipoproteiche i possono essere separate mediante elettroforesi; su supporti come carta, acetato di cellulosa o agarosio le VLDL, le LDL e le HDL migrano in posizione pre-beta, beta ed alfa.

8 Lipoproteine Sono state riconosciute delle sottofrazioni di quelle già menzionate tra cui: - IDL, con caratteristiche intermedie tra le VLDL e le LDL - lipoproteine i beta-flottanti o beta larghe riscontrate in pazienti affetti da iperlipoproteinemia primitiva familiare (Fredrickson, tipo III) - lipoproteine pre-beta sinking, la cui parte proteica è costituita da apolipoproteina B e da Lp(a), dimostrata essere in correlazione on positiva con l aterosclerosi; la parte lipidica è rappresentata da fosfolipidi, colesterolo libero ed esterificato. - lipoproteine X (Lp-X) X), ritrovate in soggetti affetti da malattie ostruttive delle vie biliari.

9 PRINCIPALI LIPOPROTEINE DEL PLASMA

10 Le proprietà delle classi di lipoproteine Chilomicroni: si formano nelle cellule intestinali, passano nella linfa intestinale e da qui nel sistema circolatorio, i principali lipidi presenti nel core sono i trigliceridi; in superficie contengono diverse apoproteine (Apo A, Apo B, Apo C ed Apo E). si legano all endotelio dove Apo C-II attiva la lipoproteina p lipasi si liberano acidi grassi, monoacligliceroli ed altri prodotti di parziale digestione che entrano nei miociti per essere ossidati o negli adipociti iti per essere conservati come trigliceridi idi si formano chilomicroni rimanenti (chilomicroni residui) che portano il colesterolo della dieta al fegato funzione: trasportare acidi grassi a muscolo e tessuto adiposo, portare colesterolo al fegato

11 Le proprietà delle classi di lipoproteine VLDL= Very Low Density Lipoproteins i si formano nel fegato portano ai tessuti trigliceridi e colesterolo endogeno si trasformano in IDL e LDL che tornano al fegato e vengono internalizzate t per endocitosi i mediata da recettori

12 Le proprietà delle classi di lipoproteine IDL = Intermediate t Density Lipoprotein i IDL (intermediate density lipoprotein) p hanno densità intermedia, e minor rapporto lipidi/proteine rispetto alle VLDL. Derivano dalle VLDL dopo che queste hanno ceduto una quota di trigliceridi al tessuto adiposo, quindi, rispetto alle VLDL contengono una minor quota di trigliceridi; contengono inoltre colesterolo. La principale apoproteina di superficie è l Apo B. Le IDL sono a loro volta i precursori delle LDL.

13 Le proprietà p delle classi di lipoproteine p LDL = Low Density Lipoprotein i contengono, come quota lipidica, soprattutto esteri del colesterolo; derivano dalle IDL (rispetto alle quali sono molto più piccole) ed hanno la funzione di trasportare il colesterolo al fegato; in superficie contengono ngono principalmente pa nt l Apo B che serve ad interagire con un recettore specifico localizzato sulla superficie dell epatocita; attraverso questa interazione la LDL viene internalizzata dall epatocita e trasporta il colesterolo all interno della cellula epatica.

14 Le proprietà delle classi di lipoproteine HDL= High Density Lipoprotein i si forma nel plasma dalla rielaborazione di altre lipoproteine e contiene la minor quota percentuale di lipidi rispetto alle proteine (principalmente fosfolipidi e colesterolo); rimuove il colesterolo dai tessuti estraendolo dalle membrane plasmatiche trasforma il colesterolo in esteri del colesterolo mediante LCAT (lecitina-colesterolo acil transferasi) che, attivata da apoa-1, aggiunge un gruppo acile al carbonio 3 del colesterolo, rendendo il colesterolo più liposolubile, favorendo il suo ingresso nel core della HDL. si lega a recettori dell epatocita e trasferisce selettivamente colesterolo nel fegato priva di colesterolo torna in circolo Funzione: recuperare colesterolo dai tessuti, come ad esempio dai vasi arteriosi. Per questo motivo viene considerata lipoproteina buona poiché protegge dallo sviluppo di aterosclerosi.

15 Funzione delle apolipoproteine Le diverse apoproteine presenti sulla superficie i della lipoproteina i non hanno soltanto la funzione di favorire la solubilizzazione dei lipidi e quindi il loro trasporto nel sangue, ma hanno anche numerose funzioni specifiche. A titolo di esempio vengono citate alcune: Apo B 48, presente sui chilomicroni, serve a riconoscere il recettore per i chilomicroni sulla cellula adiposa, e quindi favorisce il rilascio di trigliceridi al tessuto adiposo; Apo CII, presente sulla superficie del chilomicrone, attiva l enzima lipoprotein-lipasi, che serve a scindere il legame tra glicerolo ed acidi grassi presenti nei trigliceridi e facilitando così l ingresso degli acidi grassi nel tessuto adiposo; Apo B 100, presente sulle LDL, serve a riconoscere il recettore presente sulla superficie dell epatocita, consentendo così l ingresso della LDL nella cellula epatica

16 Funzione delle apolipoproteine

17 Trasporto dei trigliceridi e del colesterolo

18 Trasporto dei trigliceridi e del colesterolo

19 Correlazioni cliniche La lipoprotein-lipasi presente in corrispondenza dell endotelio vasale, è anche sotto il controllo dell insulina, liberata nel sangue dalle cellule beta del pancreas endogeno dopo assunzione di zuccheri. La carenza di insulina stimola la lipoprotein lipasi con conseguente eccessiva degradazione delle riserve adipose ed aumento dei livelli di acidi grassi liberi. I trigliceridi dei chilomicroni non sono depositati adeguatamente nel tessuto adiposo, e questo può causare l aumento dei livelli sierici di trigliceridi.

20 Correlazioni cliniche Le LDL entrano nel fegato (uptake mediato da recettore specifico per l ApoB) trasportando colesterolo e trigliceridi, i quali vengono idrolizzati. Il colesterolo libero determina 3 effetti: 1. Inibizione della sintesi ex novo di colesterolo endogeno, 2. Inibizione della sintesi del recettore epatico per Apo B-100, riducendo l ulteriore ingresso di LDL nel fegato 3. attivazione di ACAT. Per questo motivo, l assunzione di grosse quantità di colesterolo l con la dieta, provoca l aumento di LDL nel sangue e predispone alla deposizione i di colesterolo l nei vasi.

21 Correlazioni cliniche - La difettosa interazione tra Apo B e recettore epatico dovuta a mutazioni che alterano la struttura dell Apo B o più raramente del recettore riducono l interazione e riducono l ingresso dell Apo B nel fegato. - Di conseguenza una maggior quantità di Apo B resta in circolo, ed il colesterolo in esse contenuto tende a depositarsi nei vasi arteriosi favorendo lo sviluppo di aterosclerosi. - L alterazione congenita dell interazione tra Apo B 100 e recettore epatico è responsabile dell ipercolesterolemia familiare, a trasmissione autosomica dominante, molto frequente nella razza caucasica (incidenza: 1:500). - Le HDL svolgono un azione di recupero del colesterolo depositato a livello dell endotelio d l vascolare, per questo motivo il colesterolo l contenuto nelle HDL è definito colesterolo buono.

22 Aterosclerosi L Aterosclerosi è il risultato di un processo infiammatorio scatenato da macrofagi che fagocitano colesterolo e formano "foam cells".

23 La digestione parziale delle LDL danneggiate porta ad accumulo di larghe quantità di esteri del colesterolo che si riuniscono in goccioline dando alla cellula l aspetto di essere riempita di schiuma. Queste "foam cells" si accumulano nello spazio subendoteliale delle pareti delle arterie portando alla formazione di strisce grasse, la forma più precoce di placche ateromasiche.

24 Sezione di arteria che mostra il graduale sviluppo della placca atosclerotica. L infiammazione i causa l adesione dei macrofagi alle pareti delle arterie, assorbimento del colesterolo, la secrezione di fattori di crescita che spingono le cellule a dividersi. La placca può divenire instabile e dar luogo ad un coagulo.

25 Parametri di riferimento e classificazione delle iperlipidemie Gli intervalli di riferimento dei parametri lipemici plasmatici non sono facilmente definibili poichè ci sono grosse variazioni intra- ed interindividuali. Variazioni i i interindividuali: i id eta', sesso, caratteristiche ti genetiche, abitudini alimentari e di vita. Infatti i lipidi aumentano con l'età, nella donna anche in relazione con la menopausa; livelli lipemici bassi possono essere mantenuti con una dieta opportuna e l'attivita' fisica. Variazioni intraindividuali: fluttuazioni stagionali (in inverno aumentano i livelli lipemici), i cambiamenti di dieta, lo stress, la gravidanza, l'abuso di alcool e di tabacco. Il paziente a cui vanno dosati i lipidi andrebbe preparato 3 giorni prima con una dieta normale ed il prelievo va fatto dopo un digiuno prolungato (12-14 ore), nel soggetto a riposo evitando la stasi venosa. Nel soggetto normale dopo un digiuno di parecchie ore sono assenti i chilomicroni mentre le altre frazioni lipoproteiche sono presenti in rapporti determinati. ti

26 Parametri di riferimento e classificazione delle iperlipidemie Per i pazienti iperlipemici si considera la classificazione delle iperlipidemie di Fredrickson: Iperlipoproteinemia di tipo I presenza di chilomicroni anche dopo digiuno i prolungato Iperlipoproteinemia di tipo II notevole aumento delle LDL; in un sottogruppo il II b aumentano anche le VLDL Iperlipoproteinemia di tipo III c è un incremento di lipoproteine anomale, le beta-flottanti o beta larghe Iperlipoproteinemia p p di tipo IV aumento delle VLDL Iperlipoproteinemia di tipo V è di tipo misto infatti si ha aumento dei chilomicroni anche a digiuno e dopo giorni di dieta normale e di VLDL. Le iperlipidemie primitive, cioe' quelle che compaiono come patologia a se stante, possono presentarsi in forma familiare oppure in forma sporadica. Le iperlipidemie secondarie, cioe' associate ad altre patologie, possono instaurarsi si nel corso di malattie molto comuni come il diabete, l'ipotiroidismo e l'insufficienza renale.

27 Parametri di riferimento e classificazione delle iperlipidemie Recentemente e' stato dimostrato che anche le apolipoproteine B subiscono glicosilazione, in caso di iperglicemia prolungata. Le LDL glicosilate verrebbero smaltite più lentamente ed indurrebbero la sintesi di colesterolo esterificato. Le iperlipidemie hanno stretti rapporti con l'aterosclerosi e le sue complicanze; e' ormai appurato che esiste una stretta correlazione fra colesterolemie e rischio coronarico. Per avere un quadro della situazione del metabolismo lipidico (diagnosticare dislipidemie e individuare soggetti a rischio) e' sufficiente determinare colesterolo totale, colesterolo HDL e tili trigliceridiidi

28 Valori di riferimento Attualmente si preferisce parlare di valori ideali di colesterolemia che va contenuta entro i 200 mg/dl in modo da ridurre il rischio aterosclerotico. Gli studi di Framinghan dimostrano che il rischio e' tanto più elevato quanto più alto e' il rapporto colesterolo totale / colesterolo HDL: per valori a 7 si ha una condizione di rischio crescente; con valori di colesterolo HDL < a 35 mg/dl si e' a rischio di coronaropatia (8 volte superiore a quello che si ha con valori di 65 mg/dl). La frazione LDL non dovrebbe superare i 130 mg/dl. La situazione border-line è: colesterolo totale tra 200 e 239, colesterolo LDL tra 130 e 159; si e' in presenza di rischio elevato con colesterolo totale > 240 mg/dl e LDL a 160 mg/dl. I trigliceridi idi hanno dei valori di riferimento im che variano in funzione n dell'età e del sesso.

29 Esami di laboratorio per lo studio del metabolismo lipidico Si diffonde nella routine, per l'individuazione di soggetti a rischio, anche la determinazione delle apolipoproteine A e B (la A trasporta le HDL, la B le LDL); in pratica il rapporto tra le due apolipoproteine ha lo stesso significato ifi del rapporto colesterolo l totale t ed HDL. Comunque, si misurano principalmente con metodi immunoenzimatici. Lipidogramma elettroforetico: puo' essere utile solo per individuare il tipo di iperlipidemia nella classificazione di Fredrickson. Le lipoproteine, p in base alla velocita' di migrazione, vengono classificate, dalle piu' lente in: β-lipoproteine migrano con la banda β e comprendono le LDL pre β-lipoproteine migrano con le α 2 -globuline e comprendono le VLDL α-lipoproteine migrano con le α 1 -globuline e comprendono le HDL chilomicroni, quando sono presenti, non migrano e rimangono nel punto di deposizione Le β-vldl migrano con una larga banda β che sostituisce le due bande β e pre-β.

30 Esami di laboratorio per lo studio del metabolismo lipidico Lipidogramma elettroforetico β Pre-β β α - + Chylomicrons LDL IDL VLDL HDL Lp(a) - Il lipidogramma elettroforetico non viene utilizzato. - Per i chilomicroni si fa il test dell aspetto del plasma. - Colesterolo totale, trigliceridi, HDL, and LDL vengono misurati direttamente.

31 Esami di laboratorio per lo studio del metabolismo lipidico Classificazione i di Fredrickson: aspetto del siero fenotipo chilomic VLDL IDL LDL COLE triglic Aspetto del siero I Tappo cremoso, siero limpido IIa N Siero chiaro giallo IIb ++ N s.lievemente torbido III s.torbido opaco, strato cremoso IV ++ N/ s.torbido opalescente V Tappo cremoso, siero torbido

32 Variabilità analitica: obiettivi

33 Metodi enzimatici per la determinazione del colesterolo Esteri del colesterolo Colesterol estere idrossilasi Colesterolo Colesterolo ossidasi Colesten-3-one + H 2 O 2 Chinonimina (λ max 500 nm) Fenolo 4-aminoantipirina Perossidasi I metodi enzimatici sono quelli maggiormente adottati per gli analizzatori automatici.

34 Metodi per la determinazione del colesterolo HDL L ultracentrifugazione t i è il metodo più accurato Densità di HDL = g/ml Metodi di routine precipitano IDL, LDL, VLDL con polianioni (eparina, fosfotungstato) e cationi divalenti (calcio, magnesio, manganese). HDL, IDL, LDL, VLDL Destrano solfato Mg ++ HDL + (IDL, LDL, VLDL) Si centrifuga e nel sovranatante si determina la quantità di HDL con la stessa metodica usata per quantificare il colesterolo.

35 Metodi per la determinazione del colesterolo LDL La formula di Friedewald assume che tutto il colesterolo sia VLDL, LDL e HDL I chilomicroni sono di solito trascurabili in soggetti normali a digiuno e IDL and Lp(a) danno, in genere, un contributo insignificante al colesterolo totale. Poiché VLDL sono 55% trigliceridi e 12% Colesterolo: [LDL] = [Colesterolo Tot] [HDL] [Trigliceridi]/5 Tuttavia: - soggetti non a digiuno possono avere chilomicroni - TG > 400 mg/dl indica la presenza di chilomicroni (o remnants) - Iperlipidemia di tipo III è caratterizzata da alte β-vldl, con un rapporto 3:1 Trigliceridi:Colesterolo

36 Metodi per la determinazione dei trigliceridi Si usano metodi enzimatico-colorimetrici basati sulle seguenti reazioni: i Trigliceridi Lipasi Glicerochinasi ATP Glicerolo + FFA Glicerofosfato ossidasi Glicerolo-3- fosfato + ADP Diidrossiaceton-fosfato + H 2 O 2 Chi i i Perossidasi Chinonimina λ max 500 nm

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