Legno nero: interazioni vite fitoplasma e fenomeno del recovery

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1 Legno nero: interazioni vite fitoplasma e fenomeno del recovery Rita Musetti Department of Agricultural and Environmental Sciences, University of Udine via delle Scienze, 208 I Udine, Italy

2 Legno nero (Bois noir) Ø Giallumi della vite : Sono economicamente incidenti, epidemiche e non curabili Ø L agente eziologico di BN è Candidatus Phytoplasma solani, appartenente al gruppo dello Stolbur 16SrXII Ø Diagnosi difficile, ad oggi possibile solo su foglie e al momento della comparsa dei sintomi. Ø Interazioni pianta/patogeno: ad oggi ancora poco note Ø Fenomeno del recovery : le piante sintomatiche/infette possono manifestare remissione spontanea dei sintomi e tornare produttive

3 Obiettivi Bois Noir- Candidatus Phytoplasma solani q Sviluppare nuovi metodi diagnostici adatti all'analisi in organi della vite diversi dalla foglia come le radici. q Implementare le conoscenze sulle interazioni vite/ patogeno q Far luce sui meccanismi grazie ai quali le viti infette riescono ad innescare i processi che portano al recovery.

4 Strategie di intervento adottate Approccio integrato che prevede l utilizzo di metodiche di biologia molecolare, biochimica, proteomica, fisiologia, microscopia ottica ed elettronica nonché genomica funzionale, attraverso il sequenziamento e la caratterizzazione del trascrittoma (RNA-seq) di tessuto floematico isolato mediante Laser Microdissection, e bioinformatica

5 Localizzazione fitoplasma in Vitis vinifera (cv Chardonnay) Diagnosi in foglie A rapid protocol for detecting the BN phytoplasma was optimized using one-step real-time RT-PCR (Santi et al., 2013) One-step real-time RT-PCR was carried out to detect transcripts of the 16S rrna gene and DNAK gene of Ca. P. solani N Filare N Pianta Stato fitosanitario 2012 Diagnosi molecolare Asintoma;ca Asintoma;ca D D D H H H H H R R R R R - 5

6 Diagnosi di Bois Noir in radici di vite Il metodo è risultato utile per la diagnosi del fitoplasma in due individui malati ( e 10-59) e tre recovered (11-71, e ). Per gli individui sani non è stata rilevata la presenza del patogeno, a conferma del loro stato fitosanitario. Il basso numero di positivi ottenuti tra gli individui sintomatici può essere dovuto alle difficoltà di estrazione dell RNA da tessuto radicale e dalla bassa concentrazione e sporadica distribuzione del patogeno nella pianta.

7 Recovery Phytoplasmas are associated to economically important plant diseases No curative methods are available Recovery: spontaneous remission of disease symptoms Is possible to use recovery as a strategy for phytoplasma-disease control? In which cases and diseases?

8 Phytoplasma-infected plants can exhibit recovery = remission of disease symptoms (Caudwell, 1961; Schmid, 1965; Osler et al., 2000; 2003; Carraro et al., 2004) Recovery in apple and grapevine: no symptoms and no phytoplasmas in the crown; but the roots are still full infected Recovery in apricot: no symptoms, but still infected Recovery occurs also in individuals showing severe symptoms since several years 02/04/15 8

9 Recovery: what we know When recovered plants are exposed to a high pressure of disease in the field, the probability of developing symptoms is four times lower if compared with never infected trees (Osler et al., 2000) In recovered plants, processes of acquired resistance have been demonstrated (Musetti et al., 2004; 2005; 2007) 02/04/15 9

10 Some epidemiological data on recovery Common in AP diseased apples (20% of incidence as mean value) Common in FD/BN diseased grapes (20% of incidence as mean value) Less common in ESFY diseased apricots (rare) Variable in PD diseased pears (mainly depending on rootstocks and cultivars) Recovery can be permanent under certain circumstances (it depends by host genotype, rootstock, environment )

11 Recovered plants are not sources of inoculum for disease spread No phytoplasma detec;on using sierological (IF, apple) and molecular methods (nested- PCR, RT- PCR, apple and grapevine) No trasmission by grauing (Carraro et al., 2004; 2009) No transmission by insect vectors (GaleYo et al., 2009)

12 Recovery: cases of study on grapevines FD/Prosecco in Valdobbiadene (Treviso, Veneto, Italy) BN/Chardonnay in Lucinico (Gorizia, Friuli Venezia Giulia, Italy)

13 The example of FD in Valdobbiadene-Prosecco During the period about grapes recovered = almost 100% of the infected plants (Director of Consortium ProseccoValdobbiadene). The recovery seems to be stable in fact: from 1999 till 2003 (6 years) the general situation is stably based on 0-0,5% of symptomatic plants. In practice the FD-problem was solved by: ü Insecticide treatment against Scaphoideus titanus ü No grape extirpation ü Waiting for recovery (stable at Valdobbiadene)

14 Behaviour of FD during 9 years ( ) of observations on 1145 grapes. Area: Valdobbiadene-Prosecco, TV. No rogueing Yes insecticide treatment Yes recovery Symptomatic grapes % , ('94) 2 ('95) 3 ('96) 4 ('97) 5 ('98) 6 ('99) 7 ('00) 8 ('01) 9 ('02) Years Mean annual rate of recovery = 45%

15 GY: rate of spontaneous recovery (symptom remission) in grapevines in North-Eastern Italy Disease Cultivar Place Years of observation n Plant examined n Annual rate of recovery % BN (Mutton et al.,) Chardonnay Friuli - UD BN (Osler et al.,) Chardonnay Friuli - PN FD Prosecco Veneto - TV Valdobbiadene

16 The expected probability for BN-infected Chardonnay grapes to recover depends also on the severity level of symptoms Level of disease - severity % of recovery during the following year 1 (mild) 37,1 2 (intermediate) 25,8 3 (severe) 19,8 Mutton, Pavan, Frausin et al. 2002

17 Recovery from BN in grapevine: Vineyard characteristics: Located near Gorizia (N.E. Italy) in 2001, Chardonnay clone ENTAV-INRA 548 on 3 rootstocks; density: 5555 vines/ha Rootstocks Paulsen (Vitis berlandieri x V. rupestris) - SO4 (V. berlandieri x V. riparia) - 420A (V. berlandieri x V. riparia) First symptomatic plants in 2003: starting from 2006 surveys every year for symptomatic plants and randomly sampling for real-time PCR (only Stolbur phytoplasma detected in this area)

18 Symptomatic plants on the surveyed plants Year rootstock 420A 103/551 90/539 52/538 22/535 28/533 29/531 21/531 SO4 82/566 94/565 70/564 37/564 20/563 19/561 22/ Paulsen 16/519 28/517 24/515 12/512 12/511 6/509 9/508 total 201/ / / / / / /1598 Prevalence of the disease (number of symptomatic grapevines)

19 Annual rate of recovery (% of recovered vines among the previously symptomatic) year rootstock ,5 42,9 62,5 46,2 62,3 62,5 S04 24,4 38,7 60,0 48,6 42,4 58,8 420A 24,3 51,0 65,4 36,4 53,1 63,3

20 Is Recovery a resistance? Physiological and molecular bases of Recovery: studies on apple and grapevine

21 TEM micrographs from grapevine leaf tissues reveal ultrastructural modifications in the phloem. Pp A) Healthy B) Infected C) Recovered Santi et al., Frontiers in Plant Science 4: A B C In recovered plants : n n Changes in the oxida;ve status of the phloem Downregula;on of H 2 O 2 scavengers n Accumula;on of H 2 O 2 (Muse_ et al., 2007) defence mechanism ac;va;on (resistance) Musetti et al., 2007

22 Stolbur disease in grapevine: callose accumulation in the sieve plates

23 Recovery from stolbur disease in grapevine involves changes in sugar transport and metabolism SUC transporters: high expression in R grapevine Sucrose: involved in defense signaling Priming molecule for rapid activation of defense mechanisms SUS: high expression in D grapevine Santi et al., 2013

24 La diminuzione del trasporto del saccarosio osservato a livello trascrizionale, così come l aumento della sintesi del saccarosio mediato da invertasi acida di parete e saccarosio-sintasi confermano che il fitoplasma dello stolbur induce nelle foglie di vite il cambiamento da organi source in organi sink, e che le piante recovered ripristinano completamente la funzione di sintesi e trasporto dei carboidrati mostrando, allo stesso tempo, di aver acquisito una maggiore capacità di attivare i segnali di difesa contro il patogeno. 24

25 Elettroforesi 2D per l analisi delle proteine differenzialmente espresse Identificate 33 proteine differenzialmente espresse in risposta a infezione da BN di cui 9 solo nelle piante R Degola, Sanità di Toppi, unpublished

26 Molecole segnale Contenuto SA Il contenuto di SA (sia libero che totale) nelle foglie è significativamente più elevato nelle piante infette in presenza di sintomi Ederli, Zadra, Badiani & Pasqualini, unpublished

27 Molecole segnale Contenuto JA Ederli, Zadra, Badiani & Pasqualini, unpublished Il contenuto di JA e MeJA nelle foglie è significativamente più elevato nelle piante infette già prima della comparsa dei sintomi, ed è elevato anche nelle piante recovered.

28 Geni codificanti metaboliti di JA Il livello di trascrizione dei geni codificanti per AOC, OPR1 e JMT, coinvolti nelle ultime fasi della sintesi di JA e nella sua trasformazione nella forma metilata, risultava in generale significativamente più elevato nelle piante malate (D) e recovered (R) rispetto alle piante sane (H) in tutti e tre prelievi effettuati Ciaffi, unpublished

29 High-throughput mrna sequencing (RNA-seq) of LM-isolated phloem Identification of new genes and new splice variants of known ones; Identification of rare and cell-specific transcripts; Comparison of gene and transcript expression level under healthy, infected and recovered conditions

30 Isolamento di tessuto floematico da foglia Santi et al., 2013

31 High-throughput mrna sequencing (RNA-seq) of LM-isolated phloem 200 geni espressi in modo differenziale nelle piante R rispetto a quelle H e D 50 sono peculiari delle piante R 31

32 Conclusioni ü E stato messo a punto un metodo innovativo per la diagnosi di Bois Noir in radici di vite ü Il fenomeno del recovery in vite è associato a modificazioni ultrastrutturali, biochimiche e molecolari del floema ü L infezione da stolbur causa una significativa alterazione del trasporto e del metabolismo del saccarosio ü Il dosaggio di molecole segnale rivela l attivazione di meccanismi di difesa diversi in piante sintomatiche o recovered ü E stato messo a punto un metodo per isolare il tessuto floematico da foglie di vite ed analizzarne il trascrittoma

33 Ringraziamenti ProgeYo n : Giallumi della vite: tecnologie innova;ve per la diagnosi e per lo studio delle interazioni pianta/patogeno