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Transcript

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2 BIOTECNOLOGIE MICROBICHE (ex CHIMICA DELLE FERMENTAZIONI) 8 CFU PROF. Porro Orari: MARTEDÌ: 9-10:30 MERCOLEDÌ: 11-12:30 VENERDÌ: 9-10:30 Esame: orale (la glicolisi da sapere a memoria!) Libro testo: non c è Dall AA 2013/2014 (nuovo ordinamento) il corso si chiamerà Fermentazioni e Processi Microbici e sarà obbligatorio per tutti. Lezione 1 (02/10/12) Cosa vi aspettate da questo corso? Produzione di proteine eterologhe. Esempio: insulina. La vita dei diabetici è cambiata tantissimo con la produzione di insulina via DNA ricombinante dalla fine degli anni 70. Viene prodotta in Coli, ma prima si estraeva dai maiali e creava dei problemi La vita media aumenta di 3 mesi ogni anno. Vita media 100 anni fa era di anni! Quanta insulina serve al pianeta (all anno)? Se tu pesi 65kg non puoi prendere 1kg di insulina. Risposta: qualche chilo. Questo perché noi ne usiamo procapite molto poca (per sostituire quella che non riusciamo a produrre). E poi non tutti sono diabetici. Bioetanolo da utilizzarsi come biocarburante. Quanto etanolo prodotto nel mondo all anno? 100 milioni di tonnellate all anno. Quindi per produrre insulina mi serve un bioreattore piccolo, per l etanolo uno più grande. Cos è più facile: fare insulina o bioetanolo? Ovvero: è più facile fare una proteina via dna ricombinante o un metabolita? Risposta: molto molto più facile fare. una proteina! Di insulina ne servono circa 10kg all anno: quindi io stabilizzo il prezzo. Ha un valore aggiunto molto elevato per una proteina. Quindi posso usare materiali di partenza più raffinati possibile per ottenere una proteina più raffinata possiibile. Poi definisco io il prezzo. Se voglio fare 100 milioni di tonnellate devo partire da materiale di partenza che costi il meno possibile. E devo avere una resa di conversione substrato prodotto il più elevata possibile. Da una mole di glucosio, quante moli di etanolo ottengo? 1 Glucosio glicolisi 2 Etanolo Una mole di glucosio (C6H12O6) pesa 180g. Una mole di etanolo (C2H5OH) pesa 46g.E 46x2=92. Domanda: da 1g di glucosio quanti grammi di etanolo ottengo? Risposta: la metà! Cioè 0,5g di etanolo. Ma io ho 200 milioni di tonnellate di glucosio per fare 100 milioni di tonnellate di etanolo. E 200 milioni di tonnellate di glucosio costano! Quindi io devo avere la massima resta possibile. Un sistema per ottenere una resa di conversione dell etanolo del 60% è impossibile. Per fare 100 milioni di tonnellate di etanolo ci vogliono altrettanti o quasi litri a disposizione in un bioreattore enorme. Quindi risparmiare 1 /cent a litro, può sembrare una banalità ma può portare ad un risparmio di qualche milione di. Per fare un metabolita devo controllare tutto il processo metabolico: devo fare in modo di avere la massima resa di conversione. Poi voglio anche una produzione (cioè mg/l o g/l) il più elevata possibile! Perché? Perché mi facilita un aspetto del processo, quale? Il dowstream processing (la purificazione): più ne ho meno costosa sarà la purificazione. Esempio: se produco una proteina a 0,4mg/l devo recuperarla tutta! Ma se la stessa proteina la produco a 20 g/l, se ne perso 0,4 chissene frega. 1

3 Domanda: a che concentrazione viene prodotta una proteina eterologa? Risposta: dai milligrammi a qualche grammo, su litro. Domanda: il metabolita etanolo a quanto viene prodotto? Risposta: viene prodotto a 120g/l. Sono due processi completamente diversi. Ed è molto più difficile fare un metabolita. Quindi oltre a RESA e PRODUZIONE, il terzo aspetto importante per i biotecnologi è la PRODUTTIVITÀ, cioè i grammi su litro all ora. Esempio: faccio 15g/l di insulina all ora, ma se ci ho messo 7 anni Fare una proteina non è FACILE, però è più facile di un metabolita. La proteina va secreta, va modificata, ecc.. Quante sono le proteine eterologhe utilizzate come oggi come potenziali farmaci? Risposta: 201. Ma il numero cresce esponenzialmente. Dieci anni fa erano neanche una decina. E invece per quanto riguarda i metaboliti via DNA ricombinante in commercio? Pensiamo all etanolo. Mossi & Ghisolfi è una ditta tra le principali ditte produttrici di PET al mondo. 4-5 anni fa sono entrati nelle biotecnologie costruendo l impianto pilota più grande al mondo da litri per la produzione di etanolo di 2 generazione. Etanolo di 1 generazione fatto da amido fatto in S. Cerevisiae. Etanolo di 2 generazione fatto partendo da cellulosa con un microorganismo modificato geneticamente. Qualche altro metabolita prodotto via DNA ricombinante? Antibiotici ma sono ancora prodotti da micorganismi naturali. Gli acidi organici, l acido citrico nelle bevande. Anche questo prodotto per via naturale L acido lattico viene prodotto via DNA ricombinante. Serve per fare le plastiche. PLA polimero acido lattico Alcuni aminoacidi. Problema: per sintesi produci il racemo e noi ne possiamo usare una delle due: l altro o lo butti o lo riconverti. Per fermentazione invece produci solo la forma che vuoi tu. Idrocortisone I metaboliti in tutto saranno una decina, una ventina! Perché? Qualunque proteina o metabolita è prodotto a livello di laboratorio via DNA ricombinante. Ma poi per andare oltre il primo picogrammo, nel processo x garantire elevata resa, produzione e produttività in pochi ce la fanno (le 200 proteine e i 20metaboliti) e il processo si ferma. E per garantire R,P,P, c è sotto la RICERCA. Il processo va capito per migliorarlo. Il biotecnologo non va davanti al bioreattore a farlo funzionare, ci va il tecnico. Il biotecnologo sviluppa il processo in laboratorio. Quanti anni per fare un farmaco? 7-8 anni. Idem per un metabolita. L acido lattico oggi si produce via DNA ricombinante in lievito per produrre PLA, acido poli lattico. Lo stesso è stato fatto con 1,3propandiolo, prodotto in E. Coli. È una molecola bifunzionale, perché posso fare il polimero e sostituire le plastiche. È stato prodotto dalla Dupon costruito un building di ricerca con 40 ricercatori e ha finito in 4 anni. Appena posso, faccio il brevetto. Qui non parleremo mai di microorganismi ricombinanti, né per produzione di metaboliti o di proteine etrologhe perché non c è tempo. Un maiale transgenico può essere un bioreattore. Il lievito è trasformabile dal Quali sono gli organismi ospiti usati per fare proteine eterologhe? In teoria qualunque organismo può essere usato per produrre una proteina eterologa. Moltissimi batteri, moltissime muffe. Ma se vado in farmacia trovo solo: E. Coli S. Cerevisae Cellule di mammifero (in percentuale stanno aumentando perché stanno diventando economiche) 2

4 Perché Coli causa corpi di inclusione e si credeva fosse un disastro per la produzione. Ma in realtà è un vantaggio perché se la proteina precipita poi basta ri-naturarla. Molti farmaci sono proteina che noi stessi siamo in grado di fare. È relativamente facile ottenere il primo picogrammo, ma è difficile arrivare a 4 o più. Per produrre una proteina eterologa devo clonare il gene che codifica per quella proteina, per un metabolita devo clonare la via metabolica. Ma anche questo è facile. Diffidate quando qualcuno dice Ho ottenuto elevate concentrazioni di una proteina eterologa e il 40% del corredo proteico della mia cellula ospite è costituita dalla mia proteina eterologa. Non mi interessa!! Perché sarà molto difficile che quel microorganismo mi garantirà elevata resa, produzione e produttività! Se la cellula vive male non crescerà. Fino a qualche anno fa si lavorava sulla modulazione della via metabolica per ottenere un metabolita o x ottenere secrezione di una proteina. Oggi la stragrande maggioranza delle ricerche sono fatte per alleviare lo stresso che questa proteina o metabolita comporta alla cellula ospite. Se allevio lo stress, produce di più. Spesso diranno: per produrre proteine eterologhe uso promotori molto forti. o NO! Avrò troppa proteina ma poi non cresce. oppure diranno uso promotori inducibili : un promotore che è spento a 30 C ma funziona a 35 C. o NO, per alzare la temperatura di 5 C il costo è altissimo! Uso promotori repressi dalla presenza di un catione o de-represso dall assenza del catione! Va bene perché funziona, ma o NO! Perché in un bioreattore da 3000 litri non è fattibile! Uso promotori inducibili da galattosio o NO! il galattosio costa 10 volte il glucosio! IL PROCESSO DEVE ESSERE SEMPLICE! Nella stragrande maggioranza dei casi il promotore è costitutivo, medio non forte. Sui substrati, oggi si parla di processi di 2 generazione. Domanda: la fonte di carbonio e di energia principale per noi? Risposta: carboidrati, glucosio. Il glucosio che noi mangiamo deriva da amido. Domanda: quante sono le riserve di amido sul pianeta (per mangiare)? Se immaginiamo che da domani il sole si spegne, quanto tempo andiamo avanti? 3 mesi. Per tutte le fermentazioni oggi vengono usati derivati dall amido, ma il processo si ritiene essere NON più sostenibile, perché? Risposta: il processo non è biosostenibile. Perché si inquina, produci CO2. Ma se parto da cellulosa la CO2 che produco viene riutilizzata, quindi è meglio. Ma sono in pochi i microgranismi in grado di utilizzare la cellulosa. Quindi noi dobbiamo mettere la cellulosa nei microorganismi che non la usano e fargliela usare per produrre ciò che ci interessa. I microrganismi oggi in grado di utilizzare la cellulosa per produrre prodotti con un valore aggiunto sono quasi zero. Ma ci sono! Quindi vanno studiati bene e tirar fuori le vie metaboliche e portarle in altri organismi. Questo è stato fatto in S. Cerevisiae, che non è in grado di crescere su cellulosa, ma neanche su amido. Oggi per produrre etanolo si usa amido, si prende S. Cerevisiae e si aggiungono gli enzimi (amilasi e glucoamilasi) nel bioreattore per idrolizzare l amido a glucosio che viene convertito dal lievito in etanolo. Problema: gli enzimi costano! (milioni di dollari) Ipotesi: ho un bioreattore da 1 milione di litri (grosso ma non enorme) per produrre acido citrico che ha una resa di conversione massima possibile del 90% (da 1g ne ottengo 0,9g). Domanda: Ma quanto può essere il costo del glucosio (o dell amido + l enzima) dentro questo reattore? Risposta: mila. Se la fermentazione poi va male per tre volte di fila, hai sprecato mezzo milione di euro (e vieni licenziato). Più il microrganismo è elegante (complesso), più è probabile che il processo non arrivi alla fine. Per produrre etanolo di 2 generazione è necessario pre-trattare la biomassa cellulosica, perché gli enzimi non sono in grado di digerire la cellulosa. I costi del downstream per un potenziale farmaco possono arrivare al 95-98%. 3

5 2 esempi: Sigma vuole fare il vaccino per l epatite B. Paga dei volontari per donare il sangue e purificare la proteina. I volontari erano portatori di epatite B (per lo più omosessuali/tossicodipendenti). Ma arrivati in fondo al downstream processing e chiude tutto. Perché? Perché insieme alla proteina isolano il virus HIV. Molti si mangiano i lieviti alla mattina perché ricchi di proteine. Chiama uno che ha una contaminazione nel bioreattore che li produce, perché non controllava il ph che durante la coltura scende parecchio (nei lieviti anche fino a 2,5) perché c è NH4+ che rilascia un protone. I batteri non hanno le vie metaboliche per estruderli e se il ph scende si bloccano. Poi richiama per dire che adesso funziona ma la contaminazione è rimasta. L aspirina oggi non passerebbe i test, troppo tossica. Ma non viene tolta dal mercato per il rapporto costo/beneficio: in 100 anni di vita saranno morti 1 o 2 ma tanto Lezione 2 (03/10/12) Se trovate l elisir di lunga vita (anche se non esiste) se non siete in grado di produrlo tenendo conto di resaproduzione-produttività (d ora in avanti RPP) il processo è chiuso, non andrà mai fino in fondo. Se volete ottenere una proteina eterologa dovete clonare un gene eterologo, ma non è finita qui perché poi la proteina va secreta. E per essere secreta servono diverse vie metaboliche. Se volete ottenere un metabolita clonate la via metabolica partendo da glucosio. Va bene, ottenere il primo picogrammo è relativamente semplice, andare oltre è difficilissimo. Devo chiudere le vie metaboliche che competono per gli stessi substrati della mia via metabolica. Ma rischio o che la cellula non cresca più oppure che non succeda nulla. Devo comunque capire cosa succede. Disegnare la via metabolica è semplice. Prendere in considerazione tutto quello che ci sta intorno è troppo complicato. Ci vogliono modelli matematici per simulare l effetto di interventi (es la chiusura di una via metabolica). Domanda: Cellula con 10g di glucosio e inoculo: prima o poi smette di crescere, supponiamo perché mancano i nutrienti. La crescita è limitata dalla fonte di carbonio o di energia? O tutte e due finiscono contemporaneamente? Ovvero, diventa prima limitante la fonte di carbonio, di energia o entrambe? L ossigeno che usano i microrganismi è quello disciolto in acqua, e ce ne vuole tanto. Come i pesci. Risposta: dalla fonte di energia. Perché da C6H12O6, riesco ad ottenere meno energia di quanta necessaria per usare tutta quella fonte di carbonio. Domanda: Tiro fuori più energia da una molecola di glucosio (6 atomi di carbonio) o da 3 molecole di etanolo (C2H5OH, sempre 6 atomi di carbonio)? Risposta: l etanolo perché è più ridotto! Ha più idrogeni (quindi elettroni) per atomo di carbonio che nel glucosio. E quindi avrò un passaggio maggiore sulla catena di trasporto degli e - e quindi produce più energia. Se faccio crescere cellule su tot g di glucosio e tot g di etanolo: produrrò più biomassa in etanolo! Questo dimostra che la crescita è limitata dall energia ma non dal carbonio! Dal secondo principio della termodinamica so che se il composto che voglio ottenere è più ossidato del composto di partenza, posso produrlo ma non accumularlo! La stragrande maggioranza dei progetti si fermano durante lo sviluppo. Il processo deve essere semplice. Tutto quello che funziona nella beutina da 1ml non è detto che funzionerà in quella da 100 e non funzionerà in un bioreattore piccolo o enorme. E non vanno usati i promotori inducibili: non conosco un esempio a livello industriale di uso di promotori inducibili. Biotechnicum è in U4, un laboratorio costruito in GMP-like dove fanno fermentazioni e hanno i bioreattori. Se sto producendo un farmaco devo autoclavare il terreno di crescita, ma i bioreattori si autoclavano in situ. Vogliamo fare un prodotto e abbiamo l idea: prima di partire dobbiamo essere sicuri che sia scientificamente possibile farlo. Ma il mio grado di successo non sarà elevato. Deve essere poi tecnicamente possibile. 4