Corso integrato di Genetica e Biologia Molecolare GENETICA

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1 Corso integrato di Genetica e Biologia Molecolare GENETICA a.a Pier Franco Pignatti Lezioni N Malattie da mutazioni dinamiche (Neri-Genuardi cap. 17) Espansione di triplette, premutazioni, anticipazione

2 Le sequenze di DNA ripetuto sono spesso coinvolte in malattie Crossing-over diseguale Scambio diseguale fra cromatidi fratelli Conversione genica Duplicazione Delezione Inserzione Inversione Espansione di ripetizioni instabili

3 Espansione di ripetizioni instabili Es: FRAXA NEJM 332:1499, 1995

4 Instabilità delle ripetizioni In blu: interruzioni che rendono gli alleli stabili Mancano interruzioni e gli alleli si espandono: alleli instabili Es: SCA Nota una eccezione alla regola: una grossa espansione di un allele paterno interrotto in una grave forma di SCA-2 con esordio infantile ( Kobayshi H et al, 2011) Strachan e Read, Genetica Molecolare Umana UTET 2000

5 Meccanismo di espansione CAG:Gln

6 Espansione massiva

7 Espansioni non codificanti c9-ftd/als (GGGGCC) SCA36 (GGCCTG)

8 Espansioni codificanti glutamina

9 Malattie da mutazioni dinamiche DM2 XL AR AD AD >40 m. neurologiche, neurodegenerative, neuromuscolari Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999; JRGatchel & H Zoghbi 2005

10 Sindrome dell X fragile (FXS) S. di Martin-Bell (1943). La forma più comune di disabilità intellettiva ereditaria. Una delle più frequenti cause note di disabilità intellettiva e autismo. Affetti 1:4.000 maschi, 1:6.000 femmine. Sito fragile Xq27.3 (FRAXA) in terreno privo di folato (Lubs 1969). Alterazione della replicazione del DNA

11 Disabilità intellettiva (XLID) sindromica 102 geni associati con XLID Lubs HA et al. 2012

12 Espansione di FMR1 1991: identificazione del gene FMR1 e della prima mutazione dinamica (cioè che si modifica nel passaggio da una generazione all altra) Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999

13 Il paradosso di Sherman Si notino un trasmettitore sano e diverse femmine affette per inattivazione sbilanciata della X. Espansione preferenziale nella linea femminile. Paradosso di Sherman: aumento del numero di casi (aumento della penetranza) col passare delle generazioni. Fu YH et al «Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox»

14 Funzione del gene FMR1 FMRP è una proteina che lega l RNA e regola la traduzione di un gruppo di mrna dei dendriti neuronali inibendo l attività di altri geni Topi con gene Fmr1 inattivato hanno perdita della proteina FMRP e alterata maturazione della trasmissione glutamatergica durante il periodo critico perinatale FMRP è necessaria per il normale procedere della maturazione sinaptica durante lo sviluppo. La sua assenza causa una eccessiva sintesi proteica nei dendriti postsinaptici e una alterazione della funzionalità sinaptica

15 Espansione di triplette gene FMR1 Santoro MR et al, Ann Rev Pathol Mech Dis 2012

16 Premutazioni FMR1 La premutazione ( CGG) causa aumento di trascritti e diminuzione di FMRP probabilmente a causa di un sequestro da parte dell espansione CGG di proteine che legano l mrna. Può dare : Sindrome con Tremore e Atassia associata a X fragile (FXTAS) Malattia neurodegenerativa a inizio tardivo. La penetranza nei maschi di più di 70 anni è >50%, mentre nelle donne è minore Insufficenza ovarica primaria associata a X fragile (FXPOI) circa il 20% delle donne portatrici della premutazione. Menopausa precoce in

17 Eziopatogenesi di malattie legate a premutazioni del gene FMR1 Premutazioni del gene FMR1 possono causare un gruppo di fenotipi del neurosviluppo (malattia da deficit di attenzione e iperattività, disordine dello spettro autistico, malattia convulsiva) e neurodegenerative (sindrome con tremore e atassia associata all X-fragile, FXTAS) con un meccanismo completamente diverso da quello implicato in FXS e caratterizzato da un aumento della produzione e della tossicità dell mrna di FMR1 Hagerman R e P Hagerman 2013

18 Atassia di Friedreich (FRDA) La sindrome atassica ereditaria più frequente nelle popolazioni caucasoidi (3-4: , AR). Insorgenza pubertà, perdita progressiva coordinazione muovimenti ed equilibrio Deficit di energia: anche cardiomiopatia ipertrofica che può condurre a morte precoce Gene frataxina (FXN) mappato cr. 9q13 Triplette GAA nel primo introne: da normale a espansioni causano silenziamento genico con grave deficit di frataxina Espansioni meno grandi sono correlate con un esordio più tardivo

19 Frataxina Proteina mitocondriale che mantiene omeostasi Fe mitocondriale ed ha ruolo protettivo dal danno nucleare FRDA: il deficit di frataxina altera la funzione mitocondriale determinando sovraccarico di Fe, diminuita produzione di ATP, difetto di funzionamento di neuroni e cardiomiociti; instabilità cromosomica, aumento della sensibilità a mutageni chimici e specie reattive dell ossigeno (ROS) Tentativi terapeutici: rimozione Fe mitocondri mediante sostanze chelanti come il deferiprone, contrasto allo stress ossidativo con antiossidanti, aumento dell espressione genica con eritropoietina e inibitori della deacetilasi istonica

20 Sperimentazione per aumentare l espressione di FXN con inibitori della deacetilasi istonica Una possibile via di silenziamento nella atassia di Fridreich. Sono stati compleatati studi preclinici di sicurezza e tossicità di un composto ed è stato iniziato uno studio di fase I in pazienti FRDA Gottesfeld JM, JR Rushe, M Pandolfo 2013

21 Demenza frontotemporale associata a sclerosi laterale amiotrofica (FTD/ALS) La causa più comune delle forme familiari e sporadiche delle malattie neurodegenerative sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e demenza frontotemporale (FTD) è la espansione anomala di una sequenza ripetuta di 6 nucleotidi. La sequenza GGGGCC è localizzata in una regione non codificante del gene C9orf72. La formazione di G- quadruplette. Le molecole di DNA ed RNA che comprendono le ripetizioni GGGGCC adottano una particolare struttura secondaria che causa una trascrizione abortiva con l accumulo di trascritti accorciati. Taylor JP 2014

22 Poliglutaminopatie (polyq) Un gruppo di patologie comprendente 9 malattie neurodegenerative da espansione Il tratto poliglutaminico conferisce alle proteine un guadagno di funzione tossico che porta a inizio tardivo della malattia e perdita progressiva di neuroni in regioni specifiche del SNC Possibile contributo di modificazioni posttraduzionali della proteina

23 Alcune Poliglutaminopatie NEJM 340:1974, 1999

24 Test genetici brevettati per SCA Berthels N et al, EJHG 2011

25 Malattia di Huntington (HD) George Huntington (1872) descrive la malattia AD caratterizzata da disabilità motoria progressiva e deterioramento mentale. Prevalenza 3-7: Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

26 La malattia di Huntington George Huntington, 1872

27 La localizzazione del gene di HD La figura mostra parte di una grande famiglia venezuelana che ha permesso di localizzare il gene sul cromosoma 4 nel Analisi di linkage con RFLP e il marcatore G8, situato a 3cM dal gene Gusella et al Science 225:1320,1984

28 La identificazione del gene IT15 N: triplette HD: triplette Gene IT15 (Important Transcript 15, in seguito chiamato Huntingtina, HTT) identificato nel Nel 1994 Uno studio mondiale della mutazione HD. La sensibilità e la specificità di misurare le ripetizioni CAG conclude che la lunghezza delle ripetizioni è un marcatore sensibile e specifico della ereditarietà della mutazione Kremer B et al, NEJM 1994

29 Amplificazione somatica del gene HTT 50 copie 20 copie S: DNA da sperma. L: DNA da linfociti. Si nota una particolare instabilità delle triplette ripetute nella meiosi maschile. Infatti si può avere insorgenza precoce della malattia trasmessa dal padre. L età di esordio è inversamente correlata alla lunghezza della espansione, anche nel tessuto cerebrale Nature Genet 387,1993

30 Possibile meccanismo patogenetico poliq Formazione di inclusioni nucleari neuronali di aggregati proteici non specifici tossici per i neuroni. Specificità: in HD una proteina striato-specifica lega poliq-htt; in SCA fattori trascrizionali Purkinje-specifici. La proteina espansa è tossica per i neuroni. La morte cellulare progressiva porta alla malattia a insorgenza tardiva.

31 Distrofia miotonica (DM) La figura mostra amimia e aspetto scavato del volto, ptosi, iposviluppo muscolo mandibola e sternomastoideo. DM o Malattia di Steinert (1909): ipotonia muscolare con miotonia (debolezza della contrazione muscolare e difficoltà rilassamento dopo contrazione), deperimento, anomalie della conduzione cardiaca ecc. La più frequente fra le distrofie muscolari a ereditarietà autosomica (1:8.000). Gene DMPK, distrofia miotonica protein chinasi. Espansione (CTG)n al 3 UTR

32 Una famiglia con DM In nero allele N (5-37 triplette); in rosso allele espanso ( triplette). Anticipazione: l età di esordio diminuisce con il passare delle generazioni mentre aumenta la gravità delle manifestazioni cliniche Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999

33 Numero di triplette DMPK ed età di esordio Triplette nella porzione 3 non tradotta del gene. Forme cliniche: C: congenita; G: giovanile; A: adulta; SC: subclinica (nessun segno clinico tranne elettromiogramma anomalo o altro). Genitore che trasmette: madre; padre; ignoto. La forma congenita è trasmessa solo per via materna. Vi è correlaziione fra numero di triplette e gravità della malattia Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999

34 Anticipazione in DM Read A e D Donnai, New Clinical Genetics 2 ed., Scion 2011

35 Gudagno di funzione dell RNA in DM Espansione di sequenze non tradotte: CTG (DM1) o CCTG (DM2) AJHG 74:793, 2004

36 Tentativi di correzione della DM1 con oligonucleotidi antisenso I trascritti endonucleari espansi (CUG exp ) sono insolitamente sensibili al silenziamento antisenso In un modello transgenico murino di DM1 la somministrazione per via sistemica di ASO causa una rapida degradazione dell mrna CUG exp nel muscolo scheletrico La correzione delle caratteristiche fisiologiche, istopatologiche e trascrittomiche della malattia perdura fino a 1 anno dopo la fine del trattamento Wheeler TM et al, Nature 2012

37 Patogenesi di malattie da espansione A: Inibizione trascrizionale (FXS), B: RNA tossico (MD1), C: Proteina tossica (Poli-Gln) Strachan e Read, Genetica Molecolare Umana, Zanichelli 2012

38 Effetti della espansione Perdita di funzione Guadagno di funzione