CAPITOLO 10. La biosintesi degli acidi nucleici: la replicazione Il flusso dell informazione genetica nella cellula

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1 La biosintesi degli acidi nucleici: la replicazione CAPITL Il flusso dell informazione genetica nella cellula La sequenza di basi nel DNA codifica l informazione genetica. La duplicazione del DNA, che genera una nuova molecola di DNA con la stessa sequenza di basi di quella originaria, è necessaria ogni qualvolta una cellula si divide per produrre cellule figlie. Questo processo di duplicazione è chiamato replicazione. L effettiva formazione di prodotti genici richiede l RNA; la produzione di RNA da uno stampo di DNA è chiamata trascrizione, che sarà studiata nel Capitolo 11. La sequenza di basi dell RNA riflette la sequenza di basi del DNA. Tre tipi di RNA sono coinvolti nella biosintesi delle proteine; dei tre, l RNA messaggero (mrna) è di particolare importanza. Una sequenza di tre basi nell mrna specifica l identità di un amminoacido in una maniera diretta dal codice genetico. Il processo attraverso cui la sequenza di basi dirige la sequenza di amminoacidi è chiamato traduzione, che sarà studiata nel Capitolo 12. In quasi tutti gli organismi, il flusso di informazioni genetiche è DNA RNA proteina. Le uniche eccezioni di rilievo sono quelle di alcuni virus (chiamati retrovirus) in cui l RNA, piuttosto che il DNA, è il materiale genetico. In questi virus, l RNA può dirigere la propria sintesi così come quella del DNA; l enzima trascrittasi inversa catalizza questo processo. (Non tutti i virus nei quali l RNA è il materiale genetico sono dei retrovirus, ma tutti i retrovirus hanno una trascrittasi inversa. Infatti, questa è l origine del termine retrovirus, in riferimento all inverso della normale situazione della trascrizione. Si veda l articolo di Varmus elencato nella bibliografia alla fine di questo capitolo.) In casi di infezione da retrovirus, come l IV, questo enzima è un bersaglio per la progettazione di farmaci. La Figura 10.1 mostra le modalità di trasferimento dell informazione genetica nella cellula. Questo schema è stato definito il dogma centrale della biologia. Replicazione del DNA Trascrizione Replicazione dell RNA Traduzione DNA RNA PRTEINA CNR/Photo Researches, Inc. Le cellule procariotiche si dividono separandosi in due. Sommario del capitolo 10.1 Il flusso dell informazione genetica nella cellula 10.2 La replicazione del DNA Replicazione semiconservativa Come gli scienziati hanno scoperto che la replicazione del DNA è semiconservativa? In quale direzione procede la replicazione? 10.3 La DNA polimerasi Come può procedere la sintesi lungo il DNA se i due filamenti sono sintetizzati in direzione opposta? 10.4 Le proteine richieste nella replicazione Come funziona la replicazione con un DNA superavvolto? Come il singolo filamento di DNA è protetto abbastanza a lungo per la replicazione? Da dove si origina l innesco? 10.5 Proofreading e riparazione Come l attività proofreading aumenta la fedeltà della replicazione? 10.6 La replicazione del DNA eucariotico Come la replicazione è regolata dal ciclo cellulare? Quali sono le analogie tra le polimerasi eucariotiche e quelle procariotiche? Trascrizione inversa FIGURA 10.1 Meccanismi di trasferimento delle informazioni nella cellula. Le frecce gialle rappresentano casi generali e le frecce blu rappresentano casi speciali (soprattutto di virus ad RNA).

2 262 Capitolo 10 La biosintesi degli acidi nucleici: la replicazione Sezione 10.1 Sommario Prima che le cellule si dividano, esse devono sintetizzare una nuova copia di DNA. Questo processo è detto di duplicazione. Quando il DNA viene usato come stampo per sintetizzare l RNA, il processo viene detto trascrizione, che sarà trattata nel prossimo capitolo. La sequenza di RNA dell RNA messaggero viene usata per dirigere la sintesi delle proteine in un processo definito traduzione La replicazione del DNA Il DNA in natura si ritrova sotto molte forme. Sono noti DNA a singolo e doppio filamento ed entrambi possono esistere in forme lineari e circolari. Di conseguenza, è difficile generalizzare su tutte le possibili modalità di replicazione del DNA. Siccome molti DNA sono a doppio filamento, possiamo presentare caratteristiche generali della replicazione del DNA a doppio filamento, che si adattano sia al DNA lineare che a quello circolare. La maggior parte dei dettagli del processo che qui discuteremo sono stati prima evidenziati nei procarioti, in particolare in Escherichia coli. Utilizzeremo le informazioni ottenute da esperimenti su questo organismo per la maggior parte della nostra discussione sul tema. La Sezione 10.6 analizzerà le differenze tra la replicazione nei procarioti e negli eucarioti. Il processo attraverso cui una molecola di DNA a doppia elica viene duplicata per produrre due molecole a doppia elica è complesso. La grande complessità consente un elevata capacità di regolazione del processo, che a sua volta assicura notevole fedeltà nel corso della replicazione. La cellula affronta tre importanti sfide nell eseguire i passi necessari. La prima sfida consiste nel separare i due filamenti di DNA. I due filamenti di DNA sono avvolti l uno intorno all altro in modo tale che essi devono essere prima svolti per essere separati. ltre a realizzare lo svolgimento continuo della doppia elica, le cellule devono anche proteggere le porzioni svolte del DNA dall azione delle nucleasi che attaccano preferenzialmente il DNA a singolo filamento. Il secondo compito comporta la sintesi del DNA dall estremità 5 all estremità 3. Due filamenti antiparalleli devono essere sintetizzati nella stessa direzione su stampi antiparalleli. In altre parole, lo stampo ha un filamento 5 3 ed uno 3 5, così come il DNA neosintetizzato. Il terzo compito è la protezione da errori introdotti durante la replicazione, assicurando che la corretta base sia aggiunta alla catena polinucleotidica in crescita. Questi concetti saranno discussi in questa sezione e nelle tre sezioni successive. Replicazione semiconservativa La replicazione del DNA coinvolge la separazione dei due filamenti originari e la produzione di due nuovi filamenti utilizzando come stampo i filamenti originari. gni nuova molecola di DNA contiene un filamento del vecchio DNA ed un filamento neosintetizzato. Questa situazione è descritta come replicazione semiconservativa (Figura 10.2). I dettagli del processo differiscono tra procarioti ed eucarioti, ma la natura semiconservativa della replicazione si osserva in tutti gli organismi. Come gli scienziati hanno scoperto che la replicazione del DNA è semiconservativa? La replicazione semiconservativa del DNA fu stabilita inequivocabilmente nei lontani anni 50 da esperimenti compiuti da Matthew Meselson e Franklin Stahl. Batteri del genere E. coli furono cresciuti utilizzando 15 N 4 Cl come unica fonte di azoto, dove 15 N è un isotopo pesante dell azoto. (L isotopo comune dell azoto è 14 N). In tale mezzo, tutti i composti azotati neosintetizzati,

3 10.2 La replicazione del DNA 263 G 0 G 0 DNA iniziale parentale marcato con 15 N G 0 G 1 G 1 G 0 Prima replicazione in mezzo con 14 N Replicazione semiconservativa G 0 G 2 G 2 G 1 G 1 G 2 G 2 G 0 Seconda replicazione in mezzo con 14 N FIGURA 10.2 Schema di marcatura di filamenti di DNA con 15 N nella replicazione semiconservativa. (G 0 indica i filamenti originari; G 1 i nuovi filamenti dopo la prima generazione; G 2 i nuovi filamenti dopo la seconda generazione). comprese le nucleobasi puriniche e pirimidiniche, sono marcati con 15 N. Il DNA marcato con 15 N ha una densità più alta del DNA non marcato, che contiene l isotopo normale 14 N. In questo esperimento, le cellule marcate con 15 N furono quindi trasferite in un mezzo contenente solo 14 N. Le cellule continuarono a crescere nel nuovo mezzo. Ad ogni nuova generazione, veniva estratto un campione di DNA ed analizzato con la tecnica della centrifugazione in gradiente di densità (Figura 10.3). Questa tecnica si basa sul fatto che il DNA pesante 15 N (DNA che contiene esclusivamente 15 N) formerà una banda sul fondo della provetta; il DNA leggero 14 N (con solo 14 N) si troverà nella parte superiore della provetta. Il DNA che contiene una miscela di 14 N ed 15 N si troverà in una posizione intermedia tra le due bande. Nell esperimento descritto, il DNA ibrido è stato osservato dopo una generazione, un risultato in accordo con la replicazione semiconservativa. Dopo due generazioni nel mezzo leggero, metà del DNA cellulare dovrebbe essere un ibrido e metà dovrebbe essere DNA leggero 14 N. Questa predizione sul tipo e quantità di DNA osservato è stata confermata dall esperimento. In quale direzione procede la replicazione? Durante la replicazione, il DNA a doppia elica si svolge in un punto specifico, chiamato origine di replicazione (ric in E. coli). Nuove catene polinucleotidiche vengono sintetizzate utilizzando ognuno dei due singoli filamenti come stampo. La crescita dei due filamenti può realizzarsi secondo due possibilità; la sintesi può aver luogo in entrambe le direzioni dall origine di replicazione, o solo in una direzione. È stato appurato che la sintesi del DNA è bidirezionale nella maggior parte degli organismi, ad eccezione di alcuni virus e plasmidi. (I plasmidi sono DNA circolari ritrovati nei batteri, che si replicano indipendentemente dal genoma principale batterico. Se ne discuterà nella Sezione 13.3). Per ogni origine di replicazione, ci sono due punti (forcelle di replicazione) in corrispondenza dei quali si formano due nuove catene polinu-

4 264 Capitolo 10 La biosintesi degli acidi nucleici: la replicazione Cellule di E. coli Crescita prolungata in mezzo con 15 N 4 Cl Cellule di E. coli con DNA 15 N 4 Cl Crescita in mezzo con 14 N 4 Cl Crescita in mezzo con 14 N 4 Cl Cellule di E. coli con DNA 14 N, 15 N Crescita in mezzo con 15 N 4 Cl Estrazione del DNA e quindi ultracentrifugazione in gradiente di densità 14 N-DNA 14 N-DNA FIGURA 10.3 Evidenza sperimentale della replicazione semiconservativa. Il DNA pesante marcato con 15 N forma una banda sul fondo della provetta e il DNA leggero contenente 14 N forma una banda nella parte superiore. Il DNA della banda in posizione intermedia ha un filamento pesante ed uno leggero. Sistema di riferimento 14 N Prima generazione 14 N, 15 N- DNA (50-50) Seconda generazione 15 N-DNA Sistema di riferimento 15 N cleotidiche. Una bolla (definita anche occhio ) di DNA neosintetizzato tra regioni di DNA originario è un evidenza dell avanzamento di due forcelle di replicazione in direzioni opposte. Questa caratteristica struttura è anche chiamata struttura θ, a causa della sua somiglianza con la lettera greca teta. C è una sola bolla (ed una sola origine di replicazione) nel DNA circolare dei procarioti (Figura 10.4a). Negli eucarioti, ci sono molte origini di replicazione e quindi molte bolle (Figura 10.4b). Durante la replicazione le bolle si ingrossano e alla fine si fondono, dando luogo a due molecole figlie di DNA complete. La crescita bidirezionale di entrambe le nuove catene polinucleotidiche rappresenta una crescita netta delle catene. Entrambe le nuove catene polinucleotidiche sono sintetizzate in direzione 5 3. Sezione 10.2 Sommario Quando una molecola di DNA viene replicata, ognuno dei due filamenti viene usato come stampo per creare un filamento complementare. Quando la cellula si divide in due, ognuna delle due avrà uno dei filamenti originari e uno dei nuovi filamenti. Questo processo viene detto duplicazione semiconservativa. Quando le molecole di DNA vengono duplicate, i filamenti vengono separati all inizio della duplicazione. La sintesi avviene in entrambe le direzioni, dall origine lungo la forcella di duplicazione.

5 10.3 La DNA polimerasi 265 rigini rigine Stadio precoce della replicazione Forcelle di replicazione Stadio avanzato della replicazione DNA a doppia elica figli A Replicazione del cromosoma di E. coli, un tipico procariote. Si osservano un origine di replicazione e due forcelle di replicazione. B Replicazione di un cromosoma eucariotico. Ci sono molte origini di replicazione e due forcelle di replicazione per ogni origine. Le bolle che derivano da ogni origine si fondono al termine della replicazione. FIGURA 10.4 Replicazione bidirezionale. La replicazione bidirezionale del DNA è mostrata per i procarioti (una sola origine di replicazione) e per gli eucarioti (molte origini). La replicazione bidirezionale si riferisce alla sintesi complessiva (paragonata alla Figura 10.6) La DNA polimerasi La replicazione del DNA è semidiscontinua Tutte le catene nucleotidiche sono sintetizzate in direzione 5 3, dalla prospettiva della catena crescente. Questo è dovuto alla natura stessa della reazione di sintesi del DNA. L ultimo nucleotide aggiunto alla catena crescente ha uno zucchero con un idrossile in 3 libero. Il nucleotide entrante ha un zucchero con un gruppo 5-trifosfato. Il gruppo ossidrilico 3 all estremità della catena crescente è un nucleofilo. Esso attacca il fosforo adiacente allo zucchero nel nucleotide da aggiungere alla catena in crescita, portando all eliminazione del pirofosfato e alla formazione di un nuovo legame fosfodiestere (Figura 10.5). Abbiamo a lungo discusso dell attacco nucleofilo di un gruppo ossidrilico nel caso delle proteasi seriniche (Sezione 7.5); qui vediamo un altro esempio di questo genere di meccanismo. È sempre utile ricordare questo meccanismo. Più in dettaglio studiamo il DNA, più la direzionalità 5 3 può portare a confusione su quale filamento di DNA stiamo considerando. Se tenete a mente che la sintesi di tutti i polinucleotidi avviene sempre in direzione 5 3 dalla prospettiva della catena crescente, sarà molto più semplice capire i processi che seguono. La natura universale della sintesi presenta un problema per la cellula, in quanto dato che la sintesi procede lungo una forcella di replicazione, i due filamenti sintetizzati vanno in direzione opposta.

6 266 Capitolo 10 La biosintesi degli acidi nucleici: la replicazione 5 Innesco 5 C 2 4 Base Base P P P Filamento stampo 5 5 C 2 Base Base 4 3 FIGURA 10.5 Aggiunta di un nucleotide ad una catena di DNA in corso di sintesi. Il gruppo ossidrilico 3 all estremità di una catena di DNA crescente è un nucleofilo. Esso attacca il fosforo adiacente allo zucchero nel nucleotide, il quale sarà aggiunto alla catena crescente. Il pirofosfato è eliminato e si forma un nuovo legame fosfodiesterico. A Con lo svolgimento dell elica, l altro filamento parentale (il filamento 5 j 3) è copiato in maniera discontinua attraverso la sintesi di una serie di frammenti lunghi da 1000 a 2000 nucleotidi, chiamati frammenti di kazaki; il filamento costruito dai frammenti di kazaki è chiamato filamento lento Filamento guida Filamento lento 5 3 Filamenti parentali 3 5 Frammenti di kazaki Movimento della forcella di replicazione B Siccome entrambi i filamenti sono sintetizzati simultaneamente da una DNA polimerasi dimerica situata in corrispondenza della forcella di replicazione, il filamento parentale 5 j 3 deve avvolgersi a mo di trombone così che l unità dimerica della DNA polimerasi che lo replica possa muoversi lungo il filamento in direzione 3 j 5. Questo filamento parentale è copiato in maniera discontinua perché la DNA polimerasi deve ad intervalli regolari dissociarsi da esso e successivamente riassociarsi. I frammenti di kazaki sono quindi congiunti covalentemente dalla DNA ligasi per formare un frammento ininterrotto di DNA Filamento guida Filamento lento Frammenti di kazaki 3 DNA polimerasi dimerica Filamenti parentali 3 5 Movimento della forcella di replicazione FIGURA 10.6 Modello semidiscontinuo della replicazione del DNA. I filamenti neosintetizzati sono mostrati in rosso. Poiché le DNA polimerasi polimerizzano nucleotidi solamente nella direzione 5 3, entrambi i filamenti devono essere sintetizzati in questa direzione. Così, la copia del filamento parentale 3 5 è sintetizzata in maniera continua; questo filamento neosintetizzato è designato come filamento guida.

7 10.3 La DNA polimerasi 267 Come può procedere la sintesi lungo il DNA se i due filamenti sono sintetizzati in direzione opposta? Il problema è risolto mediante due diverse modalità di polimerizzazione per i due filamenti in crescita. Uno dei filamenti neoformati (il filamento guida) si forma in modalità continua dall estremità 5 all estremità 3 sul filamento stampo esposto in direzione 3 5 nella forcella di replicazione. L altro filamento (il filamento lento) è generato con una modalità semidiscontinua sotto forma di piccoli frammenti (lunghi tipicamente da 1000 a 2000 nucleotidi), denominati frammenti di kazaki, dallo scienziato che per primo li studiò (Figura 10.6). L estremità 5 di ognuno di questi frammenti è più vicina alla forcella di replicazione di quanto non lo sia l estremità 3. I frammenti del filamento lento sono successivamente uniti da un enzima chiamato DNA ligasi. DNA polimerasi di E. coli La prima DNA polimerasi ad essere scoperta fu isolata da E. coli. La DNA polimerasi catalizza l aggiunta sequenziale di ogni nuovo nucleotide alla catena crescente. Applicate le vostre conoscenze Un derivato nucleosidico che è stato per molto tempo al centro delle cronache è la 3-azido-3-deossitimidina (AZT). Questo composto è stato ampiamente utilizzato per il trattamento dell AIDS (sindrome dell immunodeficienza acquisita), così come lo è stato la 2-3-dideossiinosina (DDI). Proponete un motivo che giustifichi l efficacia di questi due composti. Suggerimento: Questi composti come potrebbero adattarsi in una catena di DNA? N C 3 N N N N N 5' C 2 5' C 2 4' 3' N 3 2' 1' 4' 3' 1' 2' AZT DDI Soluzione In entrambi i casi manca un gruppo ossidrilico nella posizione 3 dello zucchero. Essi non possono formare i legami fosfodiesterici degli acidi nucleici, quindi interferiscono con la replicazione del virus dell AIDS prevenendo la sintesi di acidi nucleici. In E. coli ci sono almeno cinque tipi di DNA polimerasi. Tre di esse sono state studiate maggiormente ed alcune loro proprietà sono riportate nella Tabella La DNA Polimerasi I (Pol I) è stata scoperta per prima, seguita dal-

8 268 Capitolo 10 La biosintesi degli acidi nucleici: la replicazione FIGURA 10.7 Il dimero di subunità della DNA polimerasi III legato al DNA. Uno dei monomeri è mostrato in giallo; l altro in rosso. Notate che il dimero forma un cappio chiuso intorno al DNA (in blu). Non è visualizzato il resto dell oloenzima della polimerasi. La rimanente parte dell oloenzima è costituita dal nucleo dell enzima, responsabile della polimerizzazione e dell attività esonucleasica 3 (subunità, e ) e dal complesso (subunità,,, e ), che permette alle subunità di formare un morsetto che circonda il DNA e scivola lungo di esso man mano che la polimerizzazione procede. [Adattato da Kong, X. P., et al. Three- Dimensional Structure of the Subunit of E. Coli DNA Polymerase oloenzyme: A Sliding DNA Clamp. Cell 69, (1992)]. CPer gent. conc. di John Kuriyan/University of California, le polimerasi II (Pol II) e polimerasi III (Pol III). La polimerasi I è costituita da una singola catena polipeptidica, mentre le polimerasi II e III sono proteine oligomeriche che condividono alcune subunità. La polimerasi II non è richiesta per la replicazione; è un enzima che interviene nella riparazione del DNA. Recentemente sono state scoperte altre due polimerasi, Pol IV e Pol V. Anche questi sono enzimi della riparazione coinvolti in un meccanismo chiamato risposta SS (si veda il riquadro Connessioni biochimiche a pag. 279). Due importanti considerazioni riguardo l attività delle polimerasi sono la velocità della reazione di sintesi (numero di turnover) e la processività, che indica il numero di nucleotidi aggiunti prima che l enzima si dissoci dallo stampo (Tabella 10.1). La polimerasi III è costituita dal nucleo dell enzima, responsabile della polimerizzazione e dell attività esonucleasica 3 (subunità α, ε e θ) e da altre subunità, che comprendono un dimero di subunità α, responsabile del legame al DNA, e il complesso γ (subunità γ, δ, δ, χ e ψ), che permette alle subunità β di formare un morsetto che circonda il DNA e scivola lungo di esso man mano che la polimerizzazione procede (Figura 10.7). La Tabella 10.2 indica la composizione in subunità del complesso della DNA polimerasi III. Tutte le DNA polimerasi aggiungono nucleotidi ad una catena polinucleotidica in via di sintesi, ma hanno ruoli diversi nel processo complessivo della replicazione. Come si può vedere nella Tabella 10.1, la DNA polimerasi III ha il numero di turnover più elevato ed una processività enorme rispetto alle polimerasi I e II. Tabella 10.1 Proprietà delle DNA polimerasi di E. coli Proprietà Pol I Pol II Pol III Massa (kda) Numero di turnover (min 1 ) Processività Numero di subunità Gene strutturale pola polb* polc* Polimerizzazione Sì Sì Sì Esonucleasi Sì No No Esonucleasi Sì Sì Sì * Riferito alla subunità con attività di polimerizzazione. Questi enzimi hanno molteplici subunità ed alcune di esse sono condivise da entrambi gli enzimi. Tabella 10.2 Subunità dell oloenzima della DNA polimerasi III di E. coli Subunità Massa (kda) Gene strutturale Funzione 130,5 polc (dnae) Polimerasi 27,5 dnaq 3-Esonucleasi 8,6 hole, Assemblaggio? 71 dnax Assemblaggio dell oloenzima sul DNA 41 dnan Morsetto scorrevole, processività 47,5 dnax(z) Parte del complesso * 39 hola Parte del complesso * 37 holb Parte del complesso * 17 holc Parte del complesso * 15 hold Parte del complesso * * Le subunità,,,, e formano il cosiddetto complesso, responsabile del posizionamento delle subunità sul DNA (il morsetto scorrevole ). Il complesso è definito caricatore del morsetto. Le subunità e sono codificate dallo stesso gene.

9 10.3 La DNA polimerasi 269 Se le DNA polimerasi sono aggiunte ad uno stampo di DNA a singolo filamento con tutti i deossinucleosidi trifosfati necessari a sintetizzare un tratto di DNA, non si avrà alcuna reazione. È stato scoperto che le DNA polimerasi non possono catalizzare le sintesi de novo. Tutti e tre gli enzimi richiedono la presenza di un innesco (primer), un corto filamento oligonucleotidico che si appaia con il filamento di DNA stampo e dal quale si estende la catena polinucleotidica in crescita nelle fasi iniziali della replicazione. In sostanza, le DNA polimerasi devono trovare un nucleotide con un ossidrile libero 3 già in posizione, al quale possono aggiungere il nucleotide successivo della catena in corso di sintesi. Nel normale processo della replicazione, questo innesco è di RNA. La reazione della DNA polimerasi richiede i quattro deossiribonucleosidi trifosfati dttp, datp, dgtp e dctp. Sono anche necessari Mg 2+ ed uno stampo di DNA. A causa della richiesta di un innesco di RNA, si rendono necessari anche i quattro ribonucleosidi trifosfati ATP, UTP, GTP e CTP; questi sono incorporati nell innesco. L innesco (RNA) è appaiato mediante legami idrogeno allo stampo (DNA); l innesco offre una struttura stabile sulla quale la catena nascente può cominciare ad estendersi. Il filamento di DNA neosintetizzato comincia ad estendersi formando un legame covalente in corrispondenza del gruppo ossidrilico 3 libero dell innesco. Attualmente è noto che la DNA polimerasi I ha una funzione specializzata nella replicazione, riparando e riempendo i vuoti nella molecola di DNA, e che la DNA polimerasi III è il principale enzima responsabile della polimerizzazione del filamento di DNA neosintetizzato. La funzione principale delle DNA polimerasi II, IV e V è quella di enzimi di riparazione. Le attività esonucleasiche elencate nella Tabella 10.1 sono parte delle funzioni di proofreading e di riparazione delle DNA polimerasi, un processo attraverso cui i nucleotidi erroneamente appaiati sono rimossi dal polinucleotide neosintetizzato, in modo che vengano incorporati solo i nucleotidi giusti. L attività esonucleasica 3 5 posseduta dalle tre polimerasi è parte della funzione di proofreading, o lettura delle bozze; i nucleotidi erroneamente appaiati sono rimossi nel corso della replicazione e sono sostituiti da quelli giusti. Il proofreading è attuato nucleotide per nucleotide. L attività esonucleasica 5 3 rimuove brevi tratti di nucleotidi durante la riparazione, coinvolgendo di solito parecchi nucleotidi per volta. In questo modo, vengono anche rimossi gli inneschi di RNA. Le funzioni di proofreading e di riparazione sono meno efficienti in alcune DNA polimerasi. Sezione 10.3 Sommario Per permettere la sintesi di DNA 5 3 sui due filamenti che sono antiparalleli, la DNA polimerasi sintetizza un filamento in modo continuo e l altro in modo discontinuo. Il filamento sintetizzato in modo continuo viene detto filamento guida e quello sintetizzato in modo discontinuo viene detto filamento lento. I segmenti di DNA che si formano in modo discontinuo sono chiamati frammenti di kazaki; essi vengono legati successivamente dalla DNA ligasi. La reazione di sintesi di DNA comporta l unione nucleotidica dell estremità 3-ossidrilica di un nucleotide sul γ-fosfato del nuovo nucleotide trifosfato. Esistono almeno cinque DNA polimerasi in E. coli, denominate da Pol I a Pol V. Pol III è il principale enzima responsabile della sintesi del nuovo DNA ed è una subunità di un enzima. Le DNA polimerasi I e II sono coinvolte in processi di correzione e riparazione. Tutte le sintesi del DNA richiedono un primer di RNA.

10 270 Capitolo 10 La biosintesi degli acidi nucleici: la replicazione 10.4 Le proteine richieste nella replicazione Due domande sorgono a proposito della separazione dei due filamenti del DNA parentale affinché esso sia replicato. La prima è come si realizza lo svolgimento continuo della doppia elica. Questa domanda è complicata dal fatto che il DNA procariotico si trova in una forma superavvolta, circolare e chiusa (si veda Struttura terziaria del DNA: superavvolgimenti nella Sezione 9.3). La seconda domanda, correlata alla prima, è come si proteggono dalle nucleasi intracellulari i tratti di DNA a singolo filamento che sono stati esposti in seguito allo svolgimento. Superavvolgimento e replicazione Un enzima chiamato DNA girasi (una topoisomerasi di classe II) catalizza la conversione del DNA rilassato, circolare, con un interruzione in un filamento, nella forma superavvolta con l interruzione sigillata (Figura 10.8). Un lieve srotolamento dell elica prima che l interruzione sia sigillata introduce il superavvolgimento. L energia richiesta dal processo è fornita dall idrolisi dell ATP. Ci sono evidenze secondo cui la DNA girasi provoca una rottura del doppio filamento di DNA durante la conversione della forma circolare rilassata nella forma superavvolta. Come funziona la replicazione con un DNA superavvolto? Durante la replicazione, il ruolo della girasi è piuttosto diverso. Il DNA procariotico è superavvolto negativamente nel suo stato naturale; l apertura dell elica durante la replicazione introdurrebbe superavvolgimenti positivi avanti alla forcella di replicazione. Per visualizzare questo fenomeno, provate a raddrizzare una porzione di un filo telefonico ed osservate cosa accade agli avvolgimenti a valle. Se la forcella di replicazione continuasse a muoversi, la tensione torsionale dei superavvolgimenti positivi renderebbe impossibile il procedere della replicazione. La DNA girasi contrasta questi superavvolgimenti positivi introducendo superavvolgimenti negativi avanti alla forcella di replicazione (Figura 10.9). Una proteina che destabilizza l elica, chiamata elicasi, promuove lo svolgimento legandosi alla forcella di replicazione. Sono note varie elicasi, tra cui la proteina DnaB e la proteina Rep. Come il singolo filamento di DNA è protetto abbastanza a lungo per la replicazione? Le regioni di DNA a singolo filamento sono molto suscettibili alla degradazione da parte delle nucleasi. Se queste regioni non fossero controllate, sarebbe Cerchio rilassato DNA girasi Cerchio superavvolto FIGURA 10.8 La DNA girasi introduce superavvolgimenti nel DNA circolare. ATP AMP + P P i

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