COS E LA PROTEOMICA? The total PROTEIN complement of a GENOME Proteoma proteine codificate modificazioni post-traduzionali

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1 COS E LA PROTEOMICA? The total PROTEIN complement of a GENOME (M. Wilkins et al. Electrophoresis 1995, ) La Proteomica è lo studio del PROTEOMA Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 1 Proteoma L insieme completo di proteine codificate dal genoma ed espresse in una cellula L insieme di tutte le isoforme, delle modificazioni post-traduzionali e delle interazioni delle proteine Perché studiamo il proteoma? Studio delle alterazioni delle proteine in particolari condizioni: malattia, trattamento, tempo, ecc. Mentre il genoma è costante per una data cellula ed identico per tutte le cellule di un organismo, e non cambia molto all interno della specie, il proteoma è molto dinamico nel tempo ed in risposta a fattori esterni, e differisce in maniera sostanziale tra i diversi tipi cellulari. Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 2 PUPA FARFALLA Stesso GENOMA diverso PROTEOMA Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 3 1

2 Invecchiamento Stesso GENOMA diverso PROTEOMA Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 4 Perché la Proteomica? La Proteomica ha come obiettivo lo studio dell'espressione delle proteine in diversi tessuti, liquidi biologici ed anche organi vitali Fegato, reni, cuore, ecc. Plasma, liquor, ecc. Latte, carne, ecc. Lo studio dell espressione e funzione delle Proteine aiuta a: Comprendere quali sono i meccanismi alla base dell insorgenza di malattie Identificare le alterazioni proteiche tra cui: le modifiche post-traduzionali. Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 5 Modificazioni post-traduzionali Acetilazione, metilazione (-CH 3 C=O, -CH 3 ) Fosforilazione (-HPO 3- ) Glicosilazione (enzimatica) Glicazione (non enzimatica) Nitrazione/denitrazione Cleavage Protein splicing Tagging Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 6 2

3 Come si studiano le proteine? PURIFICAZIONE Cromatografia Esclusione Molecolare Scambio Ionico Affinità Altro Elettroforesi Monodimensionale Bidimensionale Identificazione e caratterizzazione SPETTROMETRIA DI MASSA WESTERN BLOTTING Spettrometria di Massa (MS) Spettrometria di Massa/Massa (MS/MS) Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n APPROCCIO CLASSICO PREPARAZIONE DEL CAMPIONE ELETTROFORESI MONODIMENSIONALE E BIDIMENSIONALE VISUALIZZAZIONE DEI RISULTATI SPETTROMETRIA DI MASSA BIOINFORMATICA Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 8 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Solubilizzazione riproducibile di tutte le classi proteiche, incluse quelle idrofobiche Prevenzione dell aggregazione proteica e mantenimento della solubilità Prevenzione di modificazioni chimiche ed enzimatiche dovute al processo di estrazione La rimozione di macromolecole che possono interferire Una resa proteica adeguata per la valutazione che potrebbe implicare la rimozione di specie proteiche molto abbondanti Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 9 3

4 N.B. Per Elettroforesi le proteine devono essere denaturate e solubili Questo processo si ottiene tramite trattamenti specifici con: Urea (agente denaturante,caotropico, più utilizzato, capace di rompere i ponti idrogeno intra e inter molecolari) Tiourea (denaturante usato in associazione con urea per aumentare la solubilità del campione) Agenti riducenti (capaci di rompere i ponti disolfuro) Detergenti (non ionici, utilizzati perché capaci di rompere legami idrofobici ed aumentare la solubilità proteica al relativo punto isoelettrico) Inibitori di proteasi (per quegli enzimi che riescono a rimanere attivi) Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 10 ELETTROFORESI Il termine elettroforesi descrive la migrazione di particelle cariche sotto l influenza di un campo elettrico. Molte molecole di interesse biologico, come gli amminoacidi, i peptidi, le proteine, i nucleotidi e gli acidi nucleici, possiedono gruppi ionozzabili e, quindi, ad ogni valore di ph sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche, sia come cationi (+) che come anioni (-). Sotto l influenza di un campo elettrico, queste molecole cariche migrano verso il catodo o l anodo, a seconda che possiedano una carica negativa o positiva. L elettroforesi permette di valutare alcune proprietà delle proteine come il punto isoelettrico (pi) e la massa molecolare relativa (M r ). Mobilità elettroforetica Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 11 ELETTROFORESI MONODIMENSIONALE PAGE BIDIMENSIONALE IEF + PAGE (2D-PAGE) Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 12 4

5 PAGE (Elettroforesi su Gel di PoliAcrilammide) La matrice di supporto della migrazione è costituita, nella maggior parte dei casi da un gel che può essere di poliacrilamide o in altri casi di agarosio. Per quanto riguarda l analisi di proteine, il supporto più diffuso è il gel di poliacrilamide che è chimicamente inerte e viene preparato facendo copolimerizzare monomeri di acrilamide in presenza di piccole quantità di N,N - metilenbisacrilamide (o bis-acrilammide) che viene utilizzata come agente in grado di formare legami trasversali. Il processo di polimerizzazione dei monomeri di acrilammide e bis-acrilammide è un tipico esempio di catalisi radicalica e inizia con l aggiunta di un catalizzatore come il persolfato di ammonio e un iniziatore come la N,N,N,N - tetrametilendiammina (TEMED). Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (R ): S 2 O e- SO SO 4 - Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 13 Possiamo schematizzare la polimerizzazione nel modo seguente: R + M RM RM + M RMM RMM + M RMMM... dove M è il monomero di acrilammide. Formazione di un gel di poliacrilammide a partire da acrilammide e bis-acrilammide Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 14 Nell elettroforesi la forza che muove le macromolecole è il potenziale elettrico E. La mobilità elettroforetica della molecola (m), che è il rapporto tra la velocità V della particella ed il potenziale elettrico E, è anche uguale al rapporto tra la carica netta della molecola Z ed il coefficiente frizionale f V m = = E Z f I gel di acrilamide vengono definiti in base alla percentuale totale di acrilamide presente e le dimensioni dei pori del gel sono determinati dalle concentrazioni di acrilamide e bisacrilamide impiegate, agendo, quindi, da setacci molecolari rallentando la migrazione delle proteine proporzionalmente alla loro massa molecolare. Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 15 5

6 Elettroforesi monodimensionale Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 16 Elettroforesi su gel di poliacrilammide con Sodio Dodecilsolfato (SDS-PAGE) Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 17 Visualizzazione dei risultati Dopo la corsa elettroforetica, le proteine possono essere evidenziate mediante impiego di particolari coloranti come il Blue di Coomassie il Nitrato d argento o coloranti fluorescenti, capaci di legarsi alle proteine, ma non al gel, con una differente sensibilità. Ogni banda sul gel rappresenta una diversa proteina. Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 18 6

7 La massa molecolare relativa (Mr) di una proteina può essere determinata confrontando la sua mobilità con quella di una serie di proteine standard delle quali si conosce la massa molecolare relativa, separate sullo stesso gel. Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 19 Elettroforesi Bidimensionale 1 dimensione IEF 2 Dimensione PAGE Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 20 Isoelettrofocalizzazione (IEF) Questa tecnica permette di separare molecole in funzione del loro diverso punto isoelettrico. Ideale per la separazione di molecole anfotere come le proteine. Il sistema IEF più utilizzato è costituito da gel orizzontali montati su piastre di vetro o foglietti di materiale plastico. All interno del gel viene formato un gradiente di ph introducendo delle molecole chiamate anfoliti, le quali sono costituite da miscele complesse di acidi poliammino-policarbossilici sintetici. In commercio sono disponibili anfoliti che coprono diversi intervalli di ph, sia ampi (ad esempio ph 3-10), che più ristretti (ad esempio ph 7-8). Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 21 7

8 Formula generica di anfoliti usati nell isoelettrofocalizzazione Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 22 Una proteina in soluzione può possedere numerose cariche che le derivano dalla ionizzazione di gruppi delle catene laterali di determinati amminoacidi. Il fatto che i gruppi ionizzabili siano in forma ionica dipende dal ph del mezzo in rapporto al pk dei gruppi stessi: ad un ph superiore al pk si ha dissociazione di protoni, ad un ph inferiore al pk si ha associazione di protoni. La carica netta di una proteina ad un dato ph è la somma algebrica delle sue cariche positive e negative. Il punto isoelettrico di una proteina è il valore di ph cui la sua carica netta è 0. A questo valore di ph anche la mobilità elettroforetica è zero. Se si utilizza un gel con un gradiente stabile di ph, ciascuna proteina si muoverà fino alla posizione in cui il ph corrisponde al suo pi: in tal modo è possibile separare proteine che hanno una differenza anche di solo 0,01 nel loro pi. Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 23 Il campo elettrico applicato fa sì che le proteine si muovano fino a raggiungere i propri punti isoelettrici, nel quale, le molecole sono sotto forma di zwitterione, dunque non avendo carica non si muovono più. pi = pi = ph3 ph10 ph = 7.4 ph = Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 24 8

9 ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE (2D-PAGE) Questa tecnica combina le caratteristiche della IEF, nella quale le proteine sono separate in base alla loro carica (pi), con le caratteristiche della SDS-PAGE, nella quale la separazione avviene in base al loro peso molecolare. E uno dei metodi analitici più sofisticati per la separazione di una miscela complessa di proteine, con alto grado di risoluzione Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 25 PRIMA DIMENSIONE (IEF) Gradiente di ph SECONDA DIMENSIONE DIMENSIONE (SDS-PAGE) PM Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 26 Esempio A pi 3 PM 10 C B B C A D D 4 20 Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 27 9

10 + - ph=3 ph=4 ph=5 ph=6 ph=7 ph=8 ph=9 ph=10 B A D C B D 40 KDa 30 KDa 20 KDa Peso molecolare A C 10 KDa Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 28 NL 3 pi 10 Std KDa Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 29 ph 3-11 B ph 7-11 Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n

11 Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 31 WESTERN BLOTTING (PROTEIN BLOTTING) Consiste nel trasferire inizialmente le proteine separate nel gel di poliacrilammide su una membrana di nitrocellulosa. I metodi per trasferire le proteine dal gel alla nitrocellulosa sono diversi: per capillarità (capillary blotting), per diffusione, blotting sotto vuoto ed elettroblotting. Tra questi il metodo più utilizzato per la sua velocità ed efficienza è l elettroblotting, in cui il processo di trasferimento delle proteine avviene per elettroforesi. Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 32 Schema di allestimento del Sandwich per il trasferimento delle proteine. Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n

12 La presenza di bande colorate indica, quindi, la posizione della proteina o delle proteine di interesse. Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 34 Una volta avvenuto il trasferimento si procede alla colorazione del blot; utilizzando anticorpi specifici in grado di riconoscere una particolare proteina (anticorpi monoclonali). Il blot viene preventivamente incubato in una soluzione proteica, ad esempio albumina di siero bovina o latte in polvere, in modo da saturare tutti i siti idrofobici rimasti liberi sulla membrana; in questo modo si riducono notevolmente le interazioni aspecifiche con gli anticorpi. Il blot viene quindi incubato con una soluzione diluita di antisiero diretta contro la proteina di interesse (anticorpo primario). Le IgG contenute nell antisiero si legano al proprio antigene, rimanendo legate al blot. Per poter visualizzare questa interazione la membrana viene incubata ulteriormente con una soluzione contenente anticorpi secondari, in grado di riconoscere la porzione costante della molecola di IgG usata come anticorpo primario. Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 35 Gli anticorpi secondari sono marcati in modo da poter essere individuati una volta legati all anticorpo primario. Uno dei metodi più comuni di rivelazione utilizza anticorpi secondari coniugati ad un enzima. In questo caso, dopo essere stato trattato con anticorpo secondario, il blot viene incubato in una soluzione contenente il substrato dell enzima, che viene convertito in un prodotto colorato insolubile che precipita sulla nitrocellulosa. Come enzima coniugato agli anticorpi secondari viene spesso usata la perossidasi di rafano, che viene rilevata con il metodo della chemiluminescenza intensificata. In presenza di acqua ossigenata, la perossidasi ossida il luminolo, un substrato chemiluminescente, con la concomitante produzione di luce, la cui intensità aumenta fino a mille volte in presenza di un intensificatore chimico. La luce emessa può essere rilevata esponendo il blot ad una lastra fotografica. Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n

13 Membrana contenente gli antigeni 6 Proteina aspecifica che occupa i siti vuoti Incubazione con la Igg specifica per l antigene di interesse 5 4 Incubazione con il complesso Iggsecondario-Enzima che lega Igg primario 3 Substrato Iformazione di un prodotto colorato indicante la presenza di Antigene Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 37 Reazione di ossidazione del luminolo Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 38 La presenza di bande colorate indica, quindi, la posizione della proteina o delle proteine di interesse. Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n

14 Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n

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