Introduzione di mutazioni

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1 Introduzione di mutazioni al fine di ottenere proteine con incrementate attività farmacologiche rispetto a quelle native (muteine) (solubilità, stabilità, clearance, potenza, ridotta immunogenicità) Sulla base di Analisi biochimiche MUTAGENESI Analisi di sequenza OLIGONUCLEOTIDE-DIRETTA Analisi computazionale delle strutture RATIONAL DESIGN MUTAZIONI MIRATE

2 A MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Oligonucleotide-diretta

3 Ridondante (degenerato) Codoni sinonomi Non ambiguo Universale (quasi!) Letto in direzione 5 3 Produce polipeptide in direzione NH2 - COOH Senza punteggiatura Un mrna ha un solo frame di lettura (determinato da AUG)

4 MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Oligonucleotide-diretta DUPLICAZIONE SEMI-CONSERVATIVA --GTC TGT CTG -- --CAG ACA GAC Cys --GTC TCT CTG -- --CAG AGA GAC-- Ser

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7 MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Utilità nella ricerca di base Utilità a fini applicativi

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12 Mutagenesi oligonucleotide-diretta INSULINA INSULINA Lys-Pro: inversione in posizioni 28 e 29 oppure mutazione Pro/Asp maggiore solubilità e minore formazione di polimeri. Altre mutazioni per causare precipitazione a ph neutro dopo iniezione per un rilascio graduale Insulina per via orale

13 Mutagenesi oligonucleotide-diretta Cys-less IL-2 e INF-beta mutazioni Cys/Ser per diminuire le modificazioni ossidative e aumentarne la stabilità (in vivo e on-shelf stability) His- enriched G-CSF Introduzione di residui di His (neutri a ph >7.2 e protonati a ph inferiori) Diversa affinità per il recettore alla membrana o nell endosoma (riciclaggio alla membrana più veloce). Trattamento di neutropenie

14 DOMINANTI NEGATIVI

15 TNF - Tumor Necrosis Factor Induttore della via estrinseca della apoptosi (recettori di morte) Regolatore del sistema immunitario Citochina prodotta dai macrofagi, con un ruolo chiave nella regolazione della risposta infiammatoria Elevati livelli ematici presenti in condizioni patologiche (artrite reumatoide, spondilite anchilosante, inflammatory bowel disease / Crohn s disease) Farmaci che ne bloccano l azione sono utili nel controllo di tali patologie

16 Per garantire la privacy, è stato impedito il download automatico di questa immagine esterna. Per scaricare e visualizzare l'immagine, fare clic su Opzioni sulla barra dei messaggi, quindi fare clic su Attiva contenuto esterno. Infiammazione Differenziamento. Apoptosi T N F

17 DOMINANTI NEGATIVI

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19 Induction of apoptosis Luciferase reporter gene

20 Infliximab (Remicade) is a drug used to treat autoimmune diseases. It is a chimeric MAb and it has been approved by the U.S. Food and Drug Administration for the treatment of psoriasis, Crohn's disease, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, rheumatoid arthritis, sarcoidosis and ulcerative colitis. Adalimumab (brand name HUMIRA) is a humanized MAb

21 MUTAZIONI RANDOM IN VITRO MOLECULAR EVOLUTION Allo scopo di Migliorare affinità proteina ligando Cambiare la specificità di un enzima Modificare le CDR L analisi dei mutanti è la tappa più difficile (20 n possibilità; per 7 residui = 1.2x10 9 possibili mutanti!). E possibile l analisi di repertori ristretti Tecnica di selezione più usata: phage display.

22 Error prone PCR ([Mn 2+ ] sbilanciamento dntp Analoghi di basi Oligonuclotidi mutati DNA shuffling

23 Fig.1 Mutazyme DNA Polymerase

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27 Ripetuti cicli di panning

28 RIBOSOME DISPLAY (Solo la prima volta!) (Vari cicli)

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30 Proteina da selezionare

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32 MUTAZIONI RANDOM IN VITRO MOLECULAR EVOLUTION Mutazioni delle CDRs per migliorare affinità e selettività Mutante di hgh antagonista del recettore Per il trattamento di disordini da iperproduzione di ormone (acromegalia, gigantismo, diabete) Mutazione G120K lo rende antagonista Altre 8 mutazioni aumentano la sua affinità per hghr e annullano quella per il hprlr

33 (WO/2008/040758) PEPTIDES WITH HIGH AFFINITY FOR THE PROLACTIN RECEPTOR PEPTIDES WITH HIGH AFFINITY FOR THE PROLACTIN RECEPTOR FIELD OF THE INVENTION The present invention is related to variants of prolactin, which variants binds to the prolactin receptor with higher affinity as well as method for producing such variants. Such prolactin variant mutations may for instance be useful for producing prolactin antagonists for the treatment of breast cancer.

34 Prolactin antagonists in breast cancer therapy Prolactin (PRL) is a potent growth factor for mammary epithelium and PRL has been associated with the development and growth of breast tumours. Breast cancer cells often over-express the PRL receptor (PRL-R). For treatment of breast cancer it is useful a PRL antagonist in order to prevent binding of PRL to the PRL-R on the tumour. PRL binds two molecules of PRL-R through two regions of one molecule of PRL referred to as binding site 1 (BS1, high affinity ) and binding site 2 (BS2, low affinity). Variants of PRL solely able to bind via BS1 will have antagonistic properties. PRL antagonists may be created by mutating one or more small hydrophobic residues in BS2 to large polar residues (for instance G129R) or otherwise sterically interfering with binding of PRL-R to BS2. Such a variant PRL can subsequently only bind PRL-R via BS1 and will thus have attained antagonistic properties.

35 IN VITRO MOLECULAR EVOLUTION OF TRIM5alpha A Bouchard, L Berthoux Trois-Rivieres, QC, 2008 TRIM5α is a primate protein expressed in the cytoplasm, able to inhibit ("restrict") the replication of selected retroviruses. The specific recognition of viral targets is determined by the PRY/B30.2 region at the C-terminus of TRIM5α. On the virus side, capsid (CA) proteins seem to be the only determinant of sensitivity to TRIM5α and a physical interaction takes place between TRIM5α and capsid (pull-down assays). Following this initial interaction, replication of the retrovirus can be impaired in several ways. First, TRIM5αrh and TRIM5αhu seem to promote premature decapsidation of HIV-1. Second, replication is inhibited by a mechanism involving the proteasome. Thirdly, TRIM5α interferes with the nuclear transport of retroviral preintegration complexes

36 IN VITRO MOLECULAR EVOLUTION OF TRIM5alpha A Bouchard, L Berthoux Trois-Rivieres, QC, 2008 Objectives: TRIM5alpha restricts incoming retroviruses. The human orthologue of TRIM5alpha does not restrict HIV-1, but is active against some other retroviruses. The SPRY/B30.2 domain at the C-terminus of TRIM5alpha is responsible for target specificity, and a single nucleotide change in the SPRY domain of human TRIM5alpha (at position 332) confers partial restriction activity against HIV-1. Our aim is to identify additional determinants of HIV-1 restriction through a random mutagenesis screen of TRIM5alpha. Methods: We used error-prone PCR to introduce substitutions in the SPRY/B30.2 region of human TRIM5alpha.

37 IN VITRO MOLECULAR EVOLUTION OF TRIM5alpha A Bouchard, L Berthoux Trois-Rivieres, QC, 2008 Results: A library of 24,600 mutated TRIM5alpha was transduced into human HeLa cells. Sequencing analysis of individual clones shows that most had 0 to 4 mutations in the SPRY domain. To select for transduced cells with increased resistance to HIV-1, they are infected with a very high dose of an HIV-1 vector expressing GFP and GFP-negative cells (less than 1%) are then isolated. In order to enrich for TRIM5alpha variants with enhanced HIV-1 restriction activity, mutated TRIM5alpha are recovered from the first round and re-transduced in HeLa cells. Individual cell clones showing increased resistance to HIV-1 are then characterized. Conclusions: This random mutagenesis-based approach could allow us to map other determinants of HIV-1 sensitivity to TRIM5alpha restriction, and might generate antiviral genes to be used in novel therapeutic strategies based on gene transfer.

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