CONCLUSIONI DEL SEQUENZIAMENTO GENOMICO DI D. melanogaster: esistono tre putativi geni adiacenti quello per la porina

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1 CONCLUSIONI DEL SEQUENZIAMENTO GENOMICO DI D. melanogaster: esistono tre putativi geni adiacenti quello per la porina l(2)k)08405 ATG TAA IA IB II III IV? CG17137 CG17139 CG17140

2 Le sequenze della porina (DmVDAC1) e quella codificata da CG17137 (DmVDAC2) presentano il 41% di identità e il 68% di similarità porin1 --MAPPSYSD LGKQARDIFS KGYNFGLWKL DLKTKTSSGI EFNTAGHSNQ 48 P+Y D LGK ARD+F +GY+ G+W++ D KT T+SGI EF T G ++Q porin2 MAAKTPTYPD LGKLARDLFK RGYHPGIWQI DCKTLTNSGI EFFTTGFASQ 50 porin1 ESGKVFGSLE TKYKVKDYGL TLTEKWNTDN TLFTEVAVQD QLLEGLKLSL KV GSL+ +KYK++D GL TLTE+WNT+N LF E+ +D +L +GL L++ porin2 DNSKVTGSLQ SKYKIEDQGL TLTERWNTEN WLFGEIMHRD KLAQGLMLAV 100 porin1 EGNFAPQSGN KNGKFKVAYG HENVKADSDV NIDLKGPLIN ASAVLGYQGW 148 E F P S +GNFK+ Y +N +D P++N S V+G++ + porin2 EAKFQPGSNE ADGKFKMGYA QDNFNFLADI GLNSE-PILN CSLVVGHKEF 149 porin1 LAGYQTAFDT QQSKLTTNNF ALGYTTKDFV LHTAVNDGQE FSGSIFQRTS 198 L G T FD ++L ALG+T + LH + +G + S+F + S porin2 LGGVGTEFDV GNTELKGWKV ALGWTNETAT LHGELKNGDT WLASLFYKAS 199 porin1 DKLDVGVQLS WASGTSNTKF A IGAKYQLDD DASVRAKVNN 239 +K+D+G++++ G +G Y L++ DA VRAKVNN porin2 EKIDAGIEVT KGAGGGEAAE GEQQGGDVVV NLGMIYHLEE DALVRAKVNN 249 porin1 ASQVGLGYQQ KLRTGVTLTL STLVDGKNFN AGGHKIGVGL ELEA GLGY+Q KLR G+T ++ S ++D NF G H+ GVG+ L+ porin2 LVELGLGYEQ KLRDGITASI SAVLDCNNFK DGNHRFGVGI ALQC 293

3 Il vettore di espressione eterologa pqe30 fonde all N-terminale di una sequenza codificante una coda di sei His

4 Amplificazione, mediante PCR, dei cdna da. utilizzare per il clonaggio nel vettore pb bp 1000 bp 1000 pb PRIMER ATG Bam HI forward TAA HIND III reverse SEQUENZA 5-3 TAGGGATCCATGGCCAAAA CACGACA TAGAAGCTTTTATATTGCCA TTATGAA GAA 800 bp pb Sequenza dei primers utilizzati nella reazione di amplificazione e recanti i siti di taglio per gli enzimi

5 L uso della resina Ni-NTA permette la purificazione con alte rese delle proteine che posseggono un tag di sei His

6 Purificazione della proteina DmVDAC2 da lisato di E.coli mediante cromatografia di affinità

7 DmVDAC1 DmVDAC2 5nS 1min Tracciato di conduttanza relativi alle porine ricombinanti di D.melanogaster ottenuti in 1M KCl: successo nella procedura di purificazione e refolding

8 Differenze di attività tra DmVDAC1 e DmVDAC2 Conduttanza 1M KCl PC/pA G/Go ±50mv G/Go ±80mv DmVDAC1 4nS 0,6 0,6 0,5 DmVDAC2 4nS 3,17 1,0 1,0

9 Differenze di struttura tra le due porine: composizione amminoacidica DmVDAC1 DmVDAC2 Glu Asp Lys Arg 4 7

10 Differenze di struttura tra le due porine: sequenza amminoacidica DmVDAC1 --MAPPSYSD LGKQARDIFS KGYNFGLWKL DLKTKTSSGI EFNTAGHSNQ DmVDAC2 MAAKTPTYPD LGKLARDLFK RGYHPGIWQI DCKTLTNSGI EFFTTGFASQ DmVDAC1 ESGKVFGSLE TKYKVKDYGL TLTEKWNTDN TLFTEVAVQD QLLEGLKLSL DmVDAC2 DNSKVTGSLQ SKYKIEDQGL TLTERWNTEN WLFGEIMHRD KLAQGLMLAV DmVDAC1 EGNFAPQSGN KNGKFKVAYG HENVKADSDV NIDLKGPLIN ASAVLGYQGW DmVDAC2 EAKFQPGSNE ADGKFKMGYA QDNFNFLADI GLNSE-PILN CSLVVGHKEF DmVDAC1 LAGYQTAFDT QQSKLTTNNF ALGYTTKDFV LHTAVNDGQE FSGSIFQRTS DmVDAC2 LGGVGTEFDV GNTELKGWKV ALGWTNETAT LHGELKNGDT WLASLFYKAS DmVDAC1 DKLDVGVQLS WASG TSNTKF AIGAKYQLDD DARVRAKVNN DmVDAC2 EKIDAGIEVT KGAGGGEAAE GEQQGGDVVV NLGMIYHLEE DALVRAKVNN DmVDAC1 ASQVGLGYQQ KLRDGVTLTL STLVDGKNFN AGGHKIGVGL ELEA DmVDAC2 LVELGLGYEQ KLRDGITASI SAVLDCNNFK DGNHRFGVGI Quattro Glu hanno sostituito quattro Lys nella DmVDAC2

11 Localizzazione predittiva di due acidi glutammici nella struttura 3D della porina E66 E

12 E66 E163

13 Strategia di mutagenesi con il kit Quik-change site directed mutagenesis (Stratagene): Permette la mutagenesi del DNA di interesse già clonato nel vettore

14 PRIMER E66K forward E66K reverse E163K forward E163K reverse SEQUENZA 5-3 AAGTACAAGATCAAGGACCAAGGCCTG CAGGCCTTGGTCCTTGATCTTGTACTT TGGCAACACCAAACTCAAGGG CCCTTGAGTTTGGTGTTGCCA

15 Mutagenesi sito-specifica di E66 ed E163: riportando due glutammati a lisina in DmVDAC2 si ripristinano le cartteristiche fisiologiche di DmVDAC1 Conduttanza 1M KCl PC/pA G/Go ±50mv G/Go ±80mv DmVDAC2 4nS 3,17 1,0 1,0 E66K 4nS 4,5 0,88 0,8 E163K 3nS 1,23 0,82 0,78 E66/163K 2.5nS 1,17 0,7 0,6

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