La next generation sequencing è entrata nella pratica pediatrica?

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1 Aprile-Giugno 2015 Vol. 45 N. 178 Pp Prospettive in Pediatria Frontiere La next generation sequencing è entrata nella pratica pediatrica? Vincenzo Nigro Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Patologia Generale, Laboratorio di Genetica medica, Seconda Università degli Studi di Napoli, NGS Facility, Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Pozzuoli (NA) La next generation sequencing (NGS) è molto più che una nuova tecnica per leggere le sequenze di DNA. Produce sequenze con una processività parallela immensa che continua a crescere in modo esponenziale e oggi è nell ordine di centinaia di miliardi di basi di DNA per analisi. Questo fa sì che l NGS estenda le proprie opportunità di investimento in ogni settore delle scienze della vita che, con le nuove conoscenze prodotte, ne risulterà trasformato. Anche per la genetica umana è diventata una tecnologia insostituibile. L NGS sta rivoluzionando i test genetici diagnostici, sostituendo l approccio gene per gene con una strategia a pannelli di geni. Questi pannelli possono essere focalizzati ad un singolo o molteplici geni. Questo nuovo approccio è particolarmente promettente per la diagnosi di malattie pediatriche neuromuscolari, endocrinologiche, metaboliche, ecc., che sono caratterizzate da una forte eterogeneità clinica e genetica. Con la NGS è possibile effettuare un indagine genetica senza dover necessariamente ipotizzare un gene responsabile a priori, ma sequenziare un pannello molto ampio di geni o, per finalità di ricerca, tutto il genoma. Riassunto The next generation sequencing or NGS is much more than a new technique for reading the DNA sequence. It produces sequences with at a huge throughput that continues to grow exponentially and is now in the order of hundreds of billions of DNA bases for analysis. This causes the NGS to extend its investment opportunities in every field of life sciences which, with the new knowledge generated, will be transformed. Even for human genetics it has become a matchless technology. The NGS is revolutionizing genetic testing diagnostics, replacing the gene by gene strategy with a panel of genes. These panels can be focused on a single gene or widespread. This new approach is particularly promising for the diagnosis of pediatric neuromuscular diseases, endocrine, metabolic disorders, etc. that are characterized by a strong clinical and genetic heterogeneity. Using NGS it is possible to perform a genetic diagnosis without aiming at a single candidate gene, but to sequence a very large panel of genes or, for research purposes, the whole genome. Summary Metodologia della ricerca bibliografica effettuata La ricerca degli articoli rilevanti è stata effettuata tramite la banca bibliografica PubMed ( nlm.nih.gov/pubmed), utilizzando come parole chiave: next generation sequencing, whole exome sequencing, targeted sequencing Sono stati inclusi solo gli articoli in lingua inglese. La quasi totalità degli articoli sull argomento è stata pubblicata negli ultimi 4 anni; ad esempio la ricerca in Pubmed con la parola chiave whole exome sequencing ha prodotto 4789 articoli, di cui solo 70 (1,4%) prima del Introduzione: cosa significa NGS Il termine Next Generation Sequencing (d ora in avanti NGS) definisce differenti tecnologie di sequenziamento parallelo del DNA che consentono di analizzare DNA misti. Questa proprietà è una svolta epocale rispetto al sequenziamento tradizionale Sanger. Quest ultimo ha tre fasi: la prima che serve a preparare miliardi di copie identiche di ciascun fram- 137

2 V. Nigro mento di DNA per volta; la seconda fase che ricopia la sequenza delle basi di DNA con blocchi specifici causati da deossinucleotidi terminatori; la terza fase è l elettroforesi di frammenti di lunghezze discrete che fa identificare ciascuna base terminatrice. Nonostante ci sia stata negli anni un evoluzione del metodo Sanger, questa ha riguardato solo la velocizzazione della terza fase di separazione elettroforetica ad opera dei sequenziatori capillari. Poco è stato fatto per velocizzare le prime due fasi, molto più limitanti, di preparazione e di ricopiatura di frammenti individuali di DNA. La tecnologia NGS supera questo collo di bottiglia, consentendo di evitare i passaggi di amplificazione individuale, purificazione e ricopiatura di singoli segmenti di DNA omogenei. I vantaggi dell NGS sono ovviamente più evidenti quanto più numerosi sono i segmenti di DNA da analizzare e, nel campo delle malattie genetiche, quanto più numerosi e grandi sono i geni da studiare per una diagnosi molecolare. Ad esempio, con il Progetto Genoma Umano (basato su metodo Sanger) dal 1990 al 2003 sono stati coinvolti molti laboratori nel mondo per sequenziare un solo genoma, mentre con l NGS la stessa analisi è da considerarsi fattibile in circa 30 ore con uno sequenziatore di medie dimensioni. Evoluzione della NGS e delle tecniche di arricchimento L NGS negli ultimi 10 anni ha avuto un evoluzione dinamica con altrettanto rapida obsolescenza: il primo sistema (454 Sequencer) produceva 25 milioni di basi sequenziate per volta (Margulies et al., 2005), mentre il sistema più recente introduzione (Illumina HiSeq X Ten, legge miliardi di basi di DNA, cioè circa 1 milione di volte in più in soli 9 anni. L X Ten usa la tecnologia detta di patterned flow cell con cui è possibile amplificare e ripartire ogni singolo clone di molecole su un supporto fisico a micropozzetti: questo equivale a ripartire ciascun frammento di DNA in una tra miliardi di microprovette distinte. Parallelamente i costi di sequenza/bp si sono ridotti di oltre volte rispetto al 454 Sequencer e 5 milioni di volte rispetto al metodo Sanger. È però indispensabile precisare alcuni requisiti dei sistemi NGS: 1) meno costa sequenziare una base del DNA, più costano le apparecchiature; 2) è possibile sequenziare molti miliardi di basi di DNA ad un costo ridotto, ma, se non si sequenzia l intero genoma umano, si deve considerare il costo e l efficienza della cattura mirata delle sequenze da analizzare mediante le tecniche di arricchimento. Queste procedure servono a focalizzare il sequenziamento solo verso sequenze predeterminate. Anche in questo campo c è stata un importante evoluzione: la capacità di sintetizzare contemporaneamente decine di migliaia di differenti oligonucleotidi. Questo è utile sia per i protocolli più tradizionali di multiplex PCR ad alta processività (Fluidigm, Raindance, AmpliSeq), sia per altri due approcci senza PCR: il primo consiste nella cattura per ibridazione (Agilent SureSelect e NimbleGen/Roche SeqCap EZ), mentre il secondo nell ibridazione seguita da una fase di estensione (Haloplex da Agilent e TruSeq da Illumina). L uso di metodi di arricchimento sempre più precisi ed affidabili sta portando la NGS dal laboratorio di ricerca alla diagnostica di routine. La validazione su larga scala ne sta permettendo un impiego affidabile e a costi contenuti. Applicazioni e limiti dell NGS in genetica Grazie alle tecniche di arricchimento oltre al sequenziamento genomico (whole genome sequencing o WGS), sono stati sviluppati tre approcci più mirati quali il sequenziamento dell esoma (whole exome sequencing o WES) o il sequenziamento di pannelli di geni, noto anche come targeted sequencing (TS) che può essere focalizzato o esteso a molti geni (Tab. I). Il TS è principalmente utilizzato per indirizzare le regioni codificanti di un gruppo di geni, ma anche per il sequenziamento di ampie regioni genomiche non codificanti, con l arricchimento preliminare delle regioni da sequenziare. In entrambi i casi la conseguenza più immediata delle applicazioni NGS su larga scala è che i test genetici ci portano ad un livello superiore di complessità. Mentre la situazione ideale sarebbe quella di trovare una sola mutazione causativa, le difficoltà nascono dalla gestione di molteplici variazioni del DNA per paziente con significato apparentemente patogenetico in base alla letteratura scientifica. È importante chiarire che indipendentemente dall arricchimento, l NGS è semplicemente una tecnica molto potente di sequenziamento del DNA: produce sequenze più numerose e brevi e, per certi aspetti, meno accurate della metodica Sanger e non identifica categorie supplementari di varianti geniche (Tab. II). Pertanto quello che non è accertabile mediante sequenziamento Sanger è ancora più invisibile all NGS. In particolare, l NGS può risultare a bassa copertura se ci sono basi che hanno una profondità di copertura <20X, cioè la stessa sequenza letta meno di 20 volte. Questo implica che la profondità media dovrebbe essere molto superiore a 20X. Alcune regioni del DNA sono particolarmente inclini ad avere una bassa copertura a causa di regioni ricche in basi G/C ed in tali regioni le varianti, specie in eterozigosi, non sono identificabili. Inoltre, ampie delezioni e duplicazioni, come quelle alla base della distrofia muscolare di Duchenne, specie in eterozigosi, sono difficilmente identificabili. Ogni tentativo di analisi comparativa mediante software ha mostrato alte percentuali di insuccesso. La limitazione è dovuta ai passaggi di PCR previsti nei metodi di ar- 138

3 NGS in pediatria Tabella I. Dimensioni dei progetti di NGS in funzione del target (valori indicativi). Target Basi del DNA presenti nel target Copertura mediana richiesta Basi del DNA da sequenziare Varianti attese Costo minimo della sola NGS ** WGS (genoma) x > 120 Gb * WES (esoma) x 10 Gb Pannello esteso x 1 Gb Pannello focalizzato x 0.05 Gb * Gb = 1 miliardo di nucleotidi sequenziati ** I costi sono il minimo sul mercato e si riferiscono ai materiali per il solo sequenziamento senza considerare i costi accessori delle validazioni con metodica Sanger, l analisi bioinformatica dei dati e lo studio di altri parenti Tabella II. Identificazione delle varianti genomiche in base alla tecnica utilizzata. Varianti Sequenziamento Sanger* MLPA * NGS Array CGH Sostituzione di uno o pochi nucleotidi +++ +/ (SNP) Delezioni/duplicazioni di pochi nucleotidi Espansioni di triplette Delezioni /duplicazioni grandi come un intero esone Delezioni o duplicazioni di ampie regioni / cromosomiche(cnv) * Indagini mirate alla regione genomica mutata ricchimento che producono sbilanciamenti quantitativi tra ampliconi. Pertanto è consigliabile far precedere od associare tecniche quali MLPA o array CGH. Inoltre lunghe sequenze ripetute, come quelle osservabili nella sindrome dell X fragile sono ugualmente non valutabili. Infine, delezioni in sequenze ripetute come quelle alla base dell atrofia muscolare spinale (SMA) sono in sostanza non studiabili con NGS per problemi di ambiguità nell assegnazione delle corte sequenze prodotte. Inoltre c è un altra categoria di varianti del DNA che, seppure lette, non sono interpretabili e restano occultate tra migliaia di altre varianti di significato sconosciuto. Diagnosi molecolare mediante pannelli focalizzati di geni Questo tipo di applicazioni dell NGS è tra le più diffuse e di maggiore riscontro pratico immediato. L uso di pannelli di pochi geni non ha alcuna differenza con la diagnostica tradizionale sia per l interpretazione dei risultati sia per quanto riguarda i dilemmi etici. In genere l analisi si effettua solo sul propositus e poi si verifica la presenza nei genitori delle varianti riscontrate. Si sequenziano 1-20 geni specifici utilizzando piccoli strumenti NGS da banco, come Ion Torrent PGM o Illumina MiSeq. Moltissime pubblicazioni mostrano la buona affidabilità delle procedure con l identificazione delle mutazioni più rapida e più completa rispetto alle tecniche tradizionali. Ad esempio la tecnica NGS è stata già utilizzata con successo per la diagnosi di iperfenilalaninemia tramite l analisi dei geni PAH, PTS, QDPR, GCH1 e PCBD1 (Cao et al., 2014), per la diagnosi di neurofibromatosi di tipo I tramite l analisi del gene NF1 (Maruoka et al., 2014), per la diagnosi di sindrome di Stickler mediante l analisi dei geni COL11A1 ed COL11A2 (Acke et al., 2014), o in condizioni geneticamente più eterogenee come nella ciliopatia associata a nefronoftisi (Halbritter et al., 2012) o nell anemia di Fanconi (De Rocco et al., 2014). La tecnica va associata a metodologie per rilevare delezioni o duplicazioni che, se in eterozigosi, sono non correttamente rilevate dall analisi bioinformatica dei dati NGS. Un altra applicazione è nello screening neonatale, ad esempio di fibrosi cistica (Baker et al., 2015). Diagnosi molecolare con pannelli estesi I pannelli estesi non sostituiscono solo le tecniche diagnostiche tradizionali, ma offrono una visione d insieme di molte varianti geniche. Si ottengono selezio- 139

4 V. Nigro nando un numero di geni molto più ampio ( ), includendo geni anche molto grandi e geni candidati per gruppi selezionati di malattie genetiche. Ad esempio, un interessante applicazione riguarda tutte le malattie associate a disordini mitocondriali (Dames et al., 2013). Questi pannelli rappresentano un alternativa più efficiente e hanno necessità che la procedura di sequenziamento sia affidata a strumentazioni in grado di fornire, ad un costo/campione accettabile, almeno 0,5-3Gb di basi sequenziate per campione. Esistono due categorie di pannelli estesi: quelli a fini diagnostici, in cui i geni sono tutti attualmente noti come associati a malattie genetiche e quelli a scopo di ricerca in cui sono inclusi geni candidati scelti perché appartengono a pathways simili. Un esempio è dato dal pannello Haloplex per la sindrome di Usher (Aparisi et al., 2014) o del pannello di 891 geni che include i geni delle malattie da accumulo lisosomiale, dell autofagia e del pathway endocitico (Di Fruscio et al., 2015). Un altro esempio di pannello esteso è quello costituito da tutti i geni associati a malattie neuromuscolari (Savarese et al., 2014). Il vantaggio dei pannelli estesi è rappresentato dalla possibilità di un analisi più ampia di quella resa possibile dai pannelli focalizzati con un maggior numero di informazioni. Comporta però un maggior numero di varianti da interpretare. Rispetto al pannello focalizzato, l indagine prevede la necessità di analizzare contestualmente il DNA di entrambi i genitori. Questo per tre motivi, tutti vincolanti: l) la necessità di individuare le varianti de novo in una famiglia con genitori sani e figli affetti; 2) in alternativa, in caso di supposta trasmissione autosomica recessiva, la necessità di distinguere se due varianti sono presenti entrambe su uno stesso allele (in cis) o ciascuna deriva da un genitore (in trans); 3) l impossibilità tecnica di validare con tecnica Sanger centinaia o migliaia di varianti uniche. Un approccio ancora più estensivo è dato dal Clear- Seq Inherited Disease Panel (Agilent). Con questo pannello il sequenziamento è mirato a ben geni sinora coinvolti direttamente in malattie genetiche mendeliane. In sostanza questo tipo di pannello potrebbe diventare la soluzione di base per studiare casi sporadici, evitando il rischio dii ndividuare varianti in geni ignoti. Diagnosi con WES Gli esoni rappresentano circa 1,5% del genoma e si ritiene che contengano l 85% delle mutazioni che causano malattie genetiche. In alcuni laboratori si offre la possibilità di diagnosi genetica mediante WES. In media, la possibilità di identificare mutazioni causative con WES clinico è intorno al 26% (Lee et al., 2014). Un test negativo non implica necessariamente che nessuna variante causativa è presente nel DNA del paziente, ma può essere spiegato da problemi tecnici, difficoltà nell individuare specifiche mutazioni, o limitazioni interpretative. Quando il numero dei geni aumenta, in parallelo aumenta il numero di varianti nuove e di significato incerto. Questo fa sì che l analisi computazionale di WES richieda il confronto con un numero significativo di individui affetti. Un uso alternativo del WES è la ricerca di mutazioni de novo del DNA nel caso di trios, composti da un singolo bambino affetto ed entrambi i genitori non affetti o di quartet con un altro figlio (affetto o non affetto) (Lee et al., 2014). In realtà, l applicazione ideale del WES è scientifica e consiste nell identificazione di nuovi geni malattia, ma il WES ovviamente può essere usato ugualmente bene nello scoprire mutazioni note e prevedibili che sarebbero state comunque identificate con un metodo tradizionale mirato o con un pannello focalizzato, molto meno impegnativo e costoso, mentre per il targeted sequencing l applicazione ideale è nella diagnosi delle malattie genetiche eterogenee, riducendone l impegno ed i tempi di attesa rispetto ad un approccio tradizionale gene per gene. Diagnosi con WGS Già oggi esiste la possibilità di sequenziare i miliardi di basi di DNA di un WGS con costi di circa L idea di base è che sequenziare tutto il genoma significa avere un informazione completa che potrà essere utilizzata per molteplici scopi anche negli anni futuri, quando sarà più facile un analisi comparativa tra milioni di WGS. Tuttavia, anche se queste possibilità scientifiche sono affascinanti e ricevono sempre più l attenzione dell industria e importanti investimenti governativi e privati, sono ben oltre la portata di un esigenza diagnostica immediata e dall altro lato contengono alcuni rischi e difficoltà. La prima sorpresa è che il WGS ha circa il 25% di probabilità di identificare la cusa di una malattia genetica, valore molto deludente che indica quante varianti restano non sequenziate o non interpretate (Dewey et al., 2014). Tre decisioni prima di adottare l NGS L adozione dell NGS nella routine diagnostica pone tre principali questioni che devono essere affrontate e risolte prima di effettuare ogni procedura. 1) Il primo quesito è dato dalla scelta del pannello di geni. Questo potrà essere focalizzato ai singoli geni malattia o esteso, fino ad arrivare al WES o al WGS. Da questa decisione che incide sui tempi e sui costi del test dipende ogni altra considerazione successiva. Infatti, un test molto mirato è equivalente da un punto di vista etico alle tecniche tradizionali e spesso si conclude in un tempo accettabile con un referto di più semplice interpretazione. Tuttavia è evidente che più è ristretto il test minore è la possibilità di scoprire cause meno frequenti o nuove di malattia. 140

5 NGS in pediatria 2) La seconda decisione riguarda l analisi dei dati. Con differenti algoritmi si possono modulare le liste di varianti geniche riportate. Quest aspetto è di solito sottovalutato e lasciato al settore bioinformatico, ma dovrebbe essere valutato e concordato a priori. Infatti, c è la possibilità di richiedere valori di maggiore sensibilità a scapito della specificità o l inverso. Se la specificità è ridotta, le varianti potrebbero non essere confermate con sequenziamento tradizionale; se invece la sensibilità è ridotta alcune varianti causative potrebbero essere scartate all analisi. Anche questa scelta non è di facile soluzione. 3) La terza decisione riguarda soprattutto i pannelli che contengono molti geni, soprattutto il WES e il WGS: tra i dati potrebbero essere prodotte informazioni genetiche sensibili, non previste e non richieste. Queste riguardano varianti predittive di malattie che ancora non si sono manifestate clinicamente o varianti di suscettibilità allo sviluppo di neoplasie. Esiste una lista di geni prodotta dall American College dei genetisti medici (ACMG) in cui sono elencate tutte le possibili condizioni genetiche (Green et al., 2013) che è possibile diagnosticare incidentalmente tramite l utilizzo di WES. Considerato il tema della specificità, il dilemma è se cercare di fare una validazione per certificarne l esistenza o riportarle come tali o non indagarle. Cosa fare dopo l NGS Un punto cruciale per valutare l impatto di una variante genica è il confronto con banche dati di pazienti e controlli. Esistono databases on line che classificano varianti già riscontrate in patogeniche, di significato incerto o polimorfismi. Con tutte le riserve sulla qualità delle annotazioni di varianti patogeniche, è senz altro utile il confronto con l Human Gene Mutation Database (HGMD). Per stabilire le frequenze alleliche di ciascuna variante identificata è indispensabile la consultazione del sito web dell Exome Aggregation Consortium (EXAC, che riporta i dati relativi a individui. Altre iniziative internazionali, come Phenome Central ( phenomecentral.org/), mirano a fornire una piattaforma per la condivisione sicura dei dati. Il grande numero di geni e di trascritti alternativi dello stesso gene impone che nei referti diagnostici sia annotata la posizione univoca genomica della base mutata del DNA. Il riferimento universale è la sequenza denominata hg.19 e l annotazione dovrà indicare cromosoma: base. Ad esempio, la più nota variante patogenica alla base della fibrosi cistica (delta F508) sarà indicata come 7: ATCT/A. Pur tenendo conto della complessità interpretativa, l enorme potenziale dell NGS spiega perché queste stia diventando la metodica di prima scelta nei laboratori che si occupano di diagnostica molecolare (Vrijenhoek et al., 2015; Weiss et al., 2013). In futuro, inoltre, con molta probabilità,se saranno disponibili algoritmi di più facile interpretazione, la tecnologia NGS potrà essere applicata ai test di screening molecolari. Glossario genetico nell era dell NGS Il BAM è un file binario che corrisponde alla versione compressa di un file SAM. Il file BAM contiene le sequenze del DNA dopo l allineamento alla sequenza genomica di riferimento. Il file BAM contiene un intestazione (nome e lunghezza della sequenza) ed un allineamento che ne fornisce le specifiche di sequenza e qualità. I file BAM sono adatti per l analisi con un visualizzatore esterno come IGV o con il browser UCSC. Il Formato FASTQ è basato su caratteri di testo per l archiviazione di una sequenza associata a punteggi di qualità. Sia la sequenza sia il punteggio di qualità sono codificati con un singolo carattere ASCII. Recentemente è diventato lo standard dei dati NGS prodotti dai sequenziatori Illumina. Il formato Variant Call Format (VCF) serve a riportare i dati di sequenza in modo compatto, indicando solo le differenze rispetto alla sequenza di DNA di riferimento. Aplotipo: La combinazione di marcatori allelici consecutivi (può essere composta di polimorfismi o varianti rare) in una piccola regione cromosomica che difficilmente è separata da eventi di crossing-over. Copertura / profondità di copertura: il numero di sequenze indipendenti che leggono la stessa posizione nel genoma sequenziato. Target: sequenza di DNA selezionata dal genoma con tecniche di arricchimento. 141

6 V. Nigro Box di orientamento Cosa sapevamo prima Prima dell NGS si riteneva che alla base delle malattie genetiche vi fosse una mutazione in un solo gene e tutto il resto fosse più o meno stabile. Cosa sappiamo adesso Ogni individuo, sano o affetto, ha molte varianti patogeniche nel proprio genoma. Quali sviluppi si possono prevedere per il futuro La comprensione migliore della variabilità delle malattie genetiche e della suscettibilità genetica a malattie comuni. Bibliografia Acke FR, Malfait F, Vanakker OM, et al. Novel pathogenic COL11A1/COL11A2 variants in Stickler syndrome detected by targeted NGS and exome sequencing. Mol Genet Metab 2014;113: Aparisi MJ, Aller E, Fuster-García C, et al. Targeted next generation sequencing for molecular diagnosis of Usher syndrome. Orphanet J Rare Dis 2014;9:168. Baker MW, Atkins AE, Cordovado SK, et al. Improving newborn screening for cystic fibrosis using next-generation sequencing technology: a technical feasibility study. Genet Med. 2015;doi: / gim Cao YY, Qu YJ, Song F, et al. Fast clinical molecular diagnosis of hyperphenylalaninemia using next-generation sequencingbased on a custom AmpliSeq panel and Ion Torrent PGM sequencing. Mol Genet Metab 2014;113: Dames S, Chou LS, Xiao Y, et al. The development of next-generation sequencing assays for the mitochondrial genome and 108 nuclear genes associated with mitochondrial disorders. J Mol Diagn 2013;15: De Rocco D, Bottega R, Cappelli E, et al. Molecular analysis of Fanconi anemia: the experience of the Bone Marrow Failure Study Group of the Italian Association of Pediatric Onco-Hematology. Haematologica 2014;99: Dewey FE, Grove ME, Pan C, et al. Clinical interpretation and implications of whole-genome sequencing. JAMA 2014;311: Di Fruscio G, Schulz A, De Cegli R, et al. LYSOPLEX: an efficient toolkit to detect DNA sequence variations in the autophagy-lysosomal pathway. Autophagy 2015; in press. Green RC, Berg JS, Grody WW, et al. ACMG recommendations for reporting of incidental findings in clinical exome and genome sequencing. Genet Med 2013;15: Halbritter J, Diaz K, Chaki M, et al. High-throughput mutation analysis in patients with a nephronophthisis-associated ciliopathy applying multiplexed barcoded array-based PCR amplification and next-generation sequencing. J Med Genet 2012;49: Lee H, Deignan JL, Dorrani N, et al. Clinical exome sequencing for genetic identification of rare Mendelian disorders. JAMA 2014;312: Margulies M, Egholm M, Altman WE, et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 2005;437: Maruoka R, Takenouchi T, Torii C, et al. The use of next-generation sequencing in molecular diagnosis of neurofibromatosis type 1: a validation study. Genet Test Mol Biomarkers 2014;18: Savarese M, Di Fruscio G, Mutarelli M, et al. MotorPlex provides accurate variant detection across large muscle genes both in single myopathic patients and in pools of DNA samples. Acta Neuropathol Commun 2014;2:100. Vrijenhoek T, Kraaijeveld K, Elferink M, de Ligt J, et al. Next-generation sequencing-based genome diagnostics across clinical genetics centers: implementation choices and their effects. Eur J Hum Genet 2015;doi: / ejhg Weiss MM, Van der Zwaag B, Jongbloed JD, et al. Best practice guidelines for the use of next-generation sequencing applications in genome diagnostics: a national collaborative study of Dutch genome diagnostic laboratories. Hum Mutat 2013;34: Corrispondenza Vincenzo Nigro Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Patologia Generale, Laboratorio di Genetica medica, Seconda Università degli Studi di Napoli, via Luigi De Crecchio 7, Napoli - NGS Facility, Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), via Campi Flegrei 34, Pozzuoli (NA) - vinnigro@gmail.com 142