SITI DI IDROTERMALISMO DELLE ISOLE EOLIE: AMBIENTI IDEALI PER LO STUDIO DELLA DIVERSITÀ MICROBICA MARINA

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1 Biol. Mar. Mediterr. (2012), 19 (1): 6-11 T.L. Maugeri, C. Gugliandolo, V. Lentini Dipartimento di Biologia Animale ed Ecologia Marina, Università di Messina, V.le F. Stagno d Alcontres, Messina, Italia. tmaugeri@ unime.it SITI DI IDROTERMALISMO DELLE ISOLE EOLIE: AMBIENTI IDEALI PER LO STUDIO DELLA DIVERSITÀ MICROBICA MARINA HYDROTHERMAL VENTS OF THE EOLIAN ISLANDS: SUITABLE SITES TO STUDY MARINE MICROBIAL DIVERSITY Abstract - Microorganisms are at the basis of the hydrothermal system food web and they are involved in the transformation of inorganic compounds released from vent emissions. Geochemical conditions exert a strong selective pressure on the microbial structure and composition of the resident microbial community. Due to the intrinsically low cultivability of extremophilic prokaryotes, the diversity of microbial community in these systems has been investigated by using conventional molecular and next generation sequencing techniques. Prokaryotic community composition at a shallow hydrothermal system off Panarea Island, resolved by Illumina sequencing, revealed significant differences in comparison to previous phylogenetic studies performed by conventional molecular techniques. Key-words: biodiversity, microorganisms, Mediterranean Sea, shallow hydrothermal systems. I siti termali sottomarini sono stati definiti oasi di vita e tale definizione è stata formulata da Jannasch quando, alla fine degli anni 70 a bordo del sottomarino Alvin, ha vissuto l incredibile esperienza di ritrovare nell apparente deserto, nero e buio, degli abissi marini organismi, quali anellidi, molluschi e vermi, di notevoli dimensioni ed in gran numero. Tali organismi dipendevano da procarioti chemioautotrofi capaci di utilizzare come fonte di energia i composti inorganici emessi dalle bocche idrotermali. I sistemi idrotermali sono distinti in profondi (con profondità >200 m) e superficiali (con profondità <200 m). Nel Mar Mediterraneo i siti termali più studiati sono superficiali e si trovano nel Mar Egeo (Isola di Milos) e nel Mar Tirreno (Isole Eolie). I sistemi termali sottomarini sono considerati ambienti estremi perché sono caratterizzati da condizioni fisico-chimiche e nutrizionali proibitive per la maggior parte degli organismi e rappresentano campi di indagine ideali per lo studio delle interazioni tra la geosfera e la biosfera. I fluidi emessi hanno caratteristiche di elevata salinità e contengono elevate concentrazioni di CO 2, SO 2, H 2 S, CH 4 e H 2. Le comunità biologiche che vivono nelle immediate vicinanze delle sorgenti (vents) sono influenzate dai fluidi idrotermali. L effetto diretto delle emissioni sul biota è quello di escludere la maggior parte degli eucarioti che sono meno tolleranti dei procarioti ai forti gradienti chimici e fisici. Nell arcipelago delle Eolie l isola di Vulcano è stata definita la casa degli ipertermofili perché numerose specie ipertermofile di Batteri e di Archea sono state isolate dai suoi vents (Maugeri et al., 2010a). Tecniche di isolamento colturale hanno permesso di descrivere nuove specie di Bacillus e di Geobacillus e nuovi ceppi di specie già descritte (Maugeri et al., 2001). Meno conosciuta dell isola di Vulcano, l isola di Panarea è il sistema idrotermale superficiale più attivo dell arcipelago delle Eolie. A largo della costa orientale di Panarea, in un area di circa 4 Km 2, gas ed acque calde, con temperature che raggiungono al punto di emissione i 130 C, fuoriescono a profondità fino a 150 m. Tali acque calde sono caratterizzate da alte concentrazioni di sali in conseguenza dell interazione ad alta temperatura tra acqua e roccia (Maugeri et al., 2010a). Le specie di Batteri e Archea sinora isolate dai siti caldi di Panarea sono meno

2 Siti di idrotermalismo delle Isole Eolie: ambienti ideali per lo studio della diversità microbica marina 7 numerose di quelle di Vulcano, anche se negli ultimi anni a loro è stata rivolta una particolare attenzione per le possibili applicazioni biotecnologiche (Lentini et al., 2007; Gugliandolo et al., 2012). La varietà delle forme di vita microscopiche che popolano i mari è molto più grande di quanto finora noto ed è stata definita impressionante. Grazie a metodi indipendenti dalla coltivazione o molecolari si sono notevolmente accresciute le nostre conoscenze sulle comunità microbiche che vivono nell ambiente marino ed in siti caratterizzati da condizioni estreme. Proprio ai siti idrotermali sia superficiali che profondi si è riconosciuta la caratteristica di hot spots di biodiversità. La diversità dei microbi quando non è limitata alle differenze morfologiche si traduce in diversità funzionale che consente di ipotizzare il ruolo svolto dai microrganismi nell ambiente in cui vivono. Mediante la clonazione e il sequenziamento del 16S rdna, amplificato via PCR, sono state raggiunte migliaia di sequenze diverse da campioni prelevati dagli oceani (Hagström et al., 2002; Hong et al., 2006). Ovviamente queste sequenze non rappresentano specie di per sé, ma unità operazionali tassonomiche (OTU) raggruppate con similarità genetica predefinita. Tali numeri sono ben lontani da quelli stimati con approcci teorici (Dykhuizen 1998; Curtis et al., 2002), che arrivano a centinaia di milioni, per i quali la clonazione sarebbe ovviamente inadeguata per analizzare la reale diversità microbica. Tecnologie di sequenziamento più potenti sono state recentemente messe a punto e sono state utilizzate per studiare la ricchezza microbica in campioni marini. Un tale approccio consiste nell ottenere il metagenoma presente in un campione e nel romperlo in piccoli frammenti che vengono poi clonati e sequenziati (Venter et al., 2004). Sebbene il numero totale di sequenze così ottenute sia enorme, solo una piccola percentuale corrisponde ai geni 16S rdna. Sogin et al. (2006) introdussero un differente approccio basato sull amplificazione preliminare, via PCR, del gene 16S rdna a cui far seguire il sequenziamento solo di questi frammenti. Questa tecnica pyrosequencing (Ronaghi et al., 1998), che consente di aumentare il numero di OTU di un ordine di grandezza, ha dato inizio ad una nuova era nello studio della diversità microbica offrendo per la prima volta l opportunità di svelare contemporaneamente un gran numero di individui e la loro identità. I siti di idrotermalismo superficiale delle Isole Eolie sono stati studiati con tecniche molecolari quali la Fluorescent In Situ Hybridization, la Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism e la Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) pervenendo alla conclusione che, come i vents di Vulcano (Maugeri et al., 2010a), anche quelli di Panarea ospitano popolazioni di Batteri e di Archea non ancora conosciute. I risultati ottenuti mediante la tecnica DGGE hanno mostrato che le comunità microbiche dei siti superficiali presenti nell area esalativa di Panarea sono costituite da poche popolazioni dominanti di Batteri e Archea, altamente specializzate (Maugeri et al., 2009, 2010b). La ricchezza e la diversità delle popolazioni batteriche erano maggiori di quelle degli Archea, persino nel sito più profondo e più caldo denominato Black Point (Maugeri et al., 2010b). Recenti indagini su campioni di sedimento prelevati dal sito denominato Black Point mediante il metodo di next-generation sequencing (NGS) Illumina Solexa hanno consentito di analizzare la struttura e la diversità delle comunità dei procarioti (Batteri e Archea) più approfonditamente che in un recente passato. Il sistema esaminato nel corso di tali indagini è localizzato fra gli isolotti di Lisca Nera e Bottaro, ad Est dell isola di Panarea (Fig. 1). I campioni di sedimento sono stati prelevati nelle immediate vicinanze del punto di emissione da operatori subacquei e conservati a 20 C fino all estrazione del DNA.

3 Map of the islets at East of Panarea Island and Black Point site sampling ( ) location. 8 T.L. Maugeri, C. Gugliandolo, V. Lentini Lisca Bianca Panarea BLACK POINT Bottaro Lisca Nera Fig. 1 - Mappa degli isolotti ad Est dell isola di Panarea e sito di campionamento ( ) Black Point. Map of the islets at East of Panarea Island and Black Point site sampling ( ) location. Con il sistema Illumina Solexa (Genome Analyzer IIx) sono stati sequenziati i frammenti già amplificati della regione V3 del gene 16S rdna di Batteri ed Archea considerata quella con il migliore potere di risoluzione tassonomico (Huse et al., 2008) e la cui lunghezza ( nucleotidi) è compatibile con la capacità di sequenziamento del metodo utilizzato. Le sequenze ottenute sono state sottoposte a metodi di purificazione, consistenti nella eliminazione di artefatti e di chimere (Cole et al., 2009) e successivamente sono state raggruppate in unità operazionali tassonomiche alla distanza genetica dello 0,03%. Su tali unità operazionali sono stati calcolati gli indici sintetici di diversità (Shannon, H ) e di ricchezza (ACE e Chao1). Tutte le sequenze purificate sono state analizzate con l algoritmo naïve Bayesian classifier (Wang et al., 2007) ed assegnate ai diversi gruppi tassonomici. I valori degli indici sintetici (H, Chao1 ed ACE) ottenuti per i cinque diversi campioni di sedimento indicano un elevata diversità procariotica, maggiore di quella registrata nella stessa area in studi precedenti (Tab. 1). Al dominio dei Batteri è stato assegnato il 98,60% di sequenze purificate e l 1,04% a quello degli Archea, confermando che gli Archea rappresentano una componente minore della comunità microbica di questi siti. Soltanto lo 0,36% delle sequenze non era riconducibile ai domini suddetti (Tab. 1). La maggior parte delle sequenze dei Batteri corrispondeva al phylum dei Proteobatteri seguito da Firmicutes, da Actinobacteria, da Bacteroidetes e da Cyanobacteria. Le classi più abbondanti dei Batteri erano quelle dei Gamma-, Alfa- ed Epsilon-proteobatteri, seguite dai Delta- e Beta-proteobatteri. I generi batterici più abbondanti erano riconducibili ad organismi coinvolti nel ciclo dello zolfo, elemento caratterizzante gli ambienti di idrotermalismo profondo e superficiale (Hirayama et al., 2007). La comunità degli Archea era dominata dagli Euryarchaeota, seguiti dai Crenarchaeota e dai Korarchaeota. Il genere più abbondante degli Euryarchaeota era Palaeococcus, un archaeon ipertermofilo anaerobio facoltativo ed eterotrofo, isolato in Giappone da una sorgente idrotermale profonda e più di recente isolato a Vulcano (Amend et al., 2003) e dimostrato a Panarea (Maugeri et al., 2009, 2010b). La tecnica di sequenziamento Illumina si è rivelata più efficace rispetto alle tecniche molecolari convenzionali poiché ha consentito di analizzare milioni

4 Siti di idrotermalismo delle Isole Eolie: ambienti ideali per lo studio della diversità microbica marina 9 di sequenze di elevata qualità. Tali studi hanno permesso di quantificare gruppi tassonomici molto abbondanti (high abundant phylotypes), confrontabili con quelli ottenuti mediante l uso della tecnica DGGE fingerprinting (Maugeri et al., 2009, 2010b), e gruppi tassonomici microbici poco abbondanti (low abundant phylotypes) ed altri ancora, definiti rari. I filotipi poco abbondanti e quelli rari, che insieme rappresentano la rare biosphere delle profondità oceaniche (Sogin et al., 2006), possono essere considerati come una riserva potenzialmente inesauribile di diversità genomica in grado di rispondere ad elementi generatori di stress poiché possono incrementare l abbondanza relativa di popolazioni più idonee alle mutate condizioni ab. 1 - Sintesi delle informazioni relative alle sequenze ottenute (dati medi) ed indici di diversità (H ) e di ricchezza (Chao1 ed ACE) dei campioni ambientali. di sedimento prelevati dai vents Black Point. Sequencing Tab. information 1 - Sintesi and delle diversity informazioni estimates (H, relative Chao1 alle and sequenze ACE) for ottenute sediment (dati samples medi) (expressed ed indici as di average) diversità from Black point vents. (H ) e di ricchezza (Chao1 ed ACE) dei campioni di sedimento prelevati dai vents Black Point. Sequencing information and diversity estimates (H, Chao1 and ACE) for sediment samples (expressed as average) from Black point vents. Media Deviazione standard (±) Numero totale di sequenze Numero di sequenze purificate Totale di Unità Operazionali Tassonomiche (distanza genetica 0,03% ) H'* 5,95 1,46 Chao1* ACE* N di sequenze purificate assegnate al dominio dei Batteri N di sequenze purificate assegnate al dominio degli Archea Il confronto delle sequenze ottenute da campioni provenienti dall area idrotermale di Black Point con quelle presenti nelle banche dati ha mostrato che la comunità microbica è composta sia da popolazioni di Batteri e di Archea talvolta simili a quelli ritrovati nei siti termali profondi, con metabolismo chemiosintetico, che da batteri fotosintetici, quali i Chloroflexi, i Cianobatteri ed i Chlorobi, che sfruttano l energia solare. Le complesse interazioni ambientali con i microrganismi estremamente versatili che vivono nei siti superficiali idrotermali possono essere l origine dell elevata ricchezza e biodiversità microbica che si riscontra in questi siti, piuttosto che in altri ambienti acquatici. Infatti in essi si assiste alla giustapposizione di differenti habitat che si traduce in un ulteriore incremento della diversità in specie. Entro la zona fotica si realizzano situazioni di habitat costiero, simili a quelle delle zone antropizzate, soggette all attività umana (residenziale, industriale ecc.) ed altre più simili agli habitat profondi per le caratteristiche fisico-chimiche, in particolare per l effetto della temperatura dei fluidi emessi (Tarasov, 2006). La molteplicità di habitat ed i valori termici più bassi rispetto a quelli registrati nei siti di idrotermalismo profondo danno credito all ipotesi che la vita possa avere avuto origine nei siti

5 10 T.L. Maugeri, C. Gugliandolo, V. Lentini termali superficiali piuttosto che in quelli profondi con specie molto tolleranti alle condizioni estreme (temperatura, elevate concentrazioni di metalli pesanti, di radioattività, ecc.) (Guzman e Martin, 2009). Ciò rappresenta un ulteriore stimolo all approfondimento delle nostre conoscenze su questi siti, quali hot spots di biodiversità. Bibliografia AMEND J.P., MEYER-DOMBARD D.R., SHETH S.N., ZOLOTOVA N., AMEND A.C. (2003) - Palaeococcus helgesonii sp. nov., a facultatively anaerobic, hyperthermophilic archaeon from a geothermal well on Vulcano Island, Italy. Arch. Microbiol., 179: COLE J.R., WANG Q., CARDENAS E., FISH J., CHAI B., FARRIS R.J., KULAM-SYED- MOHIDEEN A.S., MCGARRELL D.M., MARSH T., GARRITY G.M., TIEDJE J.M. (2009) - The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rrna analysis. Nucleic Acids Res., 37: D141-D145. CURTIS T.P., SLOAN W.T., SCANNELL J.W. (2002) - Estimating prokaryotic diversity and its limits. PNAS, 99: DYKHUIZEN D.E. (1998) - Santa Rosalia revisited: Why are there so many species of bacteria? Antonie Van Leeuwenhoek, 73: GUGLIANDOLO C., LENTINI V., SPANÒ A., MAUGERI T.L. (2012) - New bacilli from shallow hydrothermal vents of Panarea Island (Italy) and their biotechnological potentialities. J. Appl. Microbiol., 112: GUZMAN M.I., MARTIN S.T. (2009) - Prebiotic metabolism: production by mineral photoelectrochemistry of α-ketocarboxylic acids in the reductive tricarboxylic acid cycle. Astrobiology, 9: HAGSTRÖM A., POMMIER T., ROHWER F., SIMU K., STOLTE W., SVENSSON D., ZWEIFEL U.L. (2002) - Use of 16S ribosomal DNA for delineation of marine bacterioplankton species. Appl. Environ. Microbiol., 68: HIRAYAMA H., SUNAMURA M., TAKAI K., NUNOURA T., NOGUCHI T., OIDA H., FURUSHIMA Y., YAMAMOTO H., OOMORI T., HORIKOSHI K. (2007) - Culturedependent and -independent characterization of microbial communities associated with a shallow submarine hydrothermal system occurring within a coral reef off Taketomi Island, Japan. Appl. Environ. Microbiol., 73: HONG S.H., BUNGE J., JEON S.O., EPSTEIN S.S. (2006) - Predicting microbial species richness. PNAS, 103: HUSE S.M., DETHLEFSEN L., HUBER J.A, WELCH D.M., RELMAN D.A., SOGIN M.L. (2008) - Exploring microbial diversity and taxonomy using SSU rrna hypervariable tag sequencing. PLoS Genet 4: e doi: /journal.pgen LENTINI V., GUGLIANDOLO C., MAUGERI T.L. (2007) - Identification of enzyme-producing thermophilic bacilli isolated from marine vents of Eolian Islands (Italy). Ann. Microbiol., 57: MAUGERI T.L., BIANCONI G., CANGANELLA F., DANOVARO R., GUGLIANDOLO C., ITALIANO F., LENTINI V., MANINI E., NICOLAUS B. (2010a) - Shallow hydrothermal vents in the southern Tyrrhenian Sea. Chem. Ecol., 26: MAUGERI T.L., GUGLIANDOLO C., CACCAMO D., STACKEBRANDT E. (2001) - A polyphasic taxonomic study of thermophilic bacilli from shallow, marine vents. Syst. Appl. Microbiol., 24: MAUGERI T.L., LENTINI V., GUGLIANDOLO C., COUSIN S., STACKEBRANDT E. (2010b) - Microbial diversity at a hot shallow thermal vent in the Southern Tyrrhenian Sea (Italy). Geomicrobiol. J., 27: MAUGERI T.L., LENTINI V., GUGLIANDOLO C., ITALIANO F., COUSIN S., STACKEBRANDT E. (2009) - Bacterial and archaeal populations at two shallow hydrothermal vents off Panarea Island (Eolian Islands, Italy). Extremophiles, 13: RONAGHI M., UHLÉN M., NYRÉN P. (1998) - A sequencing method based on Real-Time pyrophosphate. Science, 281: SOGIN M.L., MORRISON H.G., HUBER J.A., WELCH D.M., HUSE S.M., NEAL P.R., ARRIETA J.M., HERNDL G.J. (2006) - Microbial diversity in the deep sea and the underexplored rare biosphere. PNAS, 103:

6 Siti di idrotermalismo delle Isole Eolie: ambienti ideali per lo studio della diversità microbica marina 11 TARASOV V.G. (2006) - Effects of shallow-water hydrothermal venting on biological communities of coastal marine ecosystems of the Western Pacific. Adv. Mar. Biol., 50: VENTER J.C., REMINGTON K., HEIDELBERG J.F., HALPERN A.L., RUSCH D., EISEN J.A., WU D., PAULSEN I., NELSON K.E., NELSON W., FOUTS D.E., LEVY S., KNAP A.H., LOMAS M.W., NEALSON K., WHITE O., PETERSON J., HOFFMAN J., PARSONS R., BADEN-TILLSON H., PFANNKOCH C., ROGERS Y.H., SMITH H.O. (2004) - Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science, 304: WANG Q.G., GARRITY M., TIEDJE J.M., COLE J.R. (2007) - Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rrna sequences into the new bacterial taxonomy. Appl. Environ. Microbiol., 73: