Biotecnologie animali per l'ambiente Bruno Stefanon, Fabio Pilla, Misa Sandri, Sandy Sgorlon Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Udine

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1 Biotecnologie animali per l'ambiente Bruno Stefanon, Fabio Pilla, Misa Sandri, Sandy Sgorlon Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Udine Convegno Produzioni Animali e Sostenibilità 27 Gennaio 2011 Ore 14:30-16:30

2 Setting the Scene Bovina da latte, 45 kg latte/d 2 Ingestione di Sostanza Secca Carboidrati Carboidrati degradati Acidi grassi volatili Biomassa microbica Gas Metano Anidride carbonica 23,0 kg 14,9 kg 9,4 kg 4,5 kg 4,2 kg 450 l 580 l

3 Le Fermentazioni Ruminali Martin et al. 2006

4 Le Fermentazioni Ruminali - 2 Reazioni di produzione di Idrogeno - 1 Glucosio 2 Piruvato + 4H - 1 Piruvato + H 2 O Acetato + CO 2 + 2H Reazioni di utilizzo dell idrogeno - Piruvato + 4H Propionato + H Acetato + 4H Butirrato + 2 H 2 O - CO 2 + 8H CH 4 + 2H 2 O 4

5 5 La produzione di Gas serra (GHG)

6 Host-Microbial Interplay - HMI La microflora del rumine e quella intestinale svolgono un ruolo di fondamentale importanza per le funzioni vitali dell ospite Fermentando le fonti fibrose e amilacee producono proteina microbica e VFA, nutrienti indispensabili alla nutrizione dell animale Interagiscono con l ospite nella modulazione del sistema immunitario Competono con i microrganismi patogeni Influenzano l utilizzo dei nutrienti e quindi l efficienza digestiva e produttiva dell animale La CO 2 e il CH 4 prodotti contribuiscono all inquinamento ambientale e rappresentano una perdita di energia!!! 6

7 La popolazione microbica nel rumine - 1 Eucarioti Animale Protozoi Funghi Entodinia Holotrichia Procarioti Batteri Butyvibrio Ruminococcus Clostridium Selenomonas Propionobacteria VFA + CH4 7 Archaea Methanobrevibacter

8 Strategie alimentari - 1 La flora microbica del rumine si seleziona in funzione della disponibilità di substrato/alimento Produzione di VFA nel rumine di pecore in risposta a diverse diete Dieta % Foraggio/ Acidi tot M/l Acetico % Propionico % Butirrico % concentrato 100 : : : : : (Mc Donald et al., 1988) Metano CH4 Metano CH4

9 Strategie alimentari - 2 Obiettivo Migliorare l efficienza digestiva manipolando il microbioma ruminale per ridurre le perdite di carbonio sottoforma di metano Fattori che influenzano le emissioni di gas: Livello di ingestione Rapporto foraggi : concentrati Tipo di foraggi (fieni, fieni insilati ) Tipo e qualità delle fonti di carboidrati Bilanciamento della razione (evitare eccesso di nutrienti, che sarebbero sprecati) Utilizzo di lieviti o additivi specifici (tannini, saponine, ionofori, lipidi e acidi grassi insaturi) in grado di modulare la microflora ruminale 9

10 10 Strategie alimentari - 3

11 Genetica e selezione - 1 Table 1.Effect of level of individual cow performance on methane emissions* Parameter Low output system High output system Live weight (kg) Milk yield (kg per year) Methane output (litre per year) 168, ,014 Methane output (litre per day) Methane/milk yield (litre per kg) *Total carbon footprint (carbon dioxide, methane and nitrous oxide) from different production systems needs to take account of emissions of these three greenhouse gases from other sources, e.g., replacement rate, manure and associated emission factors from feed production, fertiliser application, soil, fuel burning, electricity use, etc. 11

12 Genetica e selezione - 2 Obbiettivo: mantenere costante la produzione diminuendo il numero di animali della mandria Diminuire le emissioni di metano per unità di prodotto (latte, carne ): Kirchgessner et al. 12 aumento di produzione da a litri/anno di latte porta ad una riduzione di emissioni di CH 4 del 5% Leng et al. Bovine Frisone alimentate con razioni di elevato valore nutritivo producono solo il 15% del CH 4 per litro di latte rispetto a bovine di razze non specializzate alimentate con razioni a basso volore nutritivo

13 paradossalmente Minori emissioni di CH 4 si ottengono utilizzando un minor numero di animali MA di elevato merito genetico INTENSIVIZZAZIONE = EMISSIONI 13 Stessa produzione con meno animali = diminuzione di CH 4 /unità di prodotto

14 Selezione attuale e Scelte selettive sulla base delle caratteristiche della razza e dell obiettivo prescelto. Nei bovini per esempio. 1. Indice PFT (produttività, funzionalità, tipo) razza Frisona grasso e proteina (kg e %), longevità, arti e piedi, indice complessivo mammella, cellule somatiche, tipo 2. ITE (indice totale economico) razza Bruna proteina (kg e %), longevità, mungibilità, cellule + k caseine 3. IDA (indice duplice attitudine) razza Pezzata Rossa grasso e proteina (kg e %), indice carne PT, muscolosità vacche, mammella, arti e piedi, mungibilità, cellule somatiche 14

15 prospettive di selezione Incrementare la produttività per ridurre le emissioni per unità prodotta Migliorare l efficienza digestiva e di trasformazione per contenere le risorse necessarie alle medesime produzioni e ridurre le emissioni e il carbonfooprint del processo Selezionare per l efficienza di utilizzazione dell azoto (N-Capture), per ridurne gli input conservando i livelli produttivi Selezionare per caratteri specifici o secondari associati alla produzione di metano (associazione fenotipo-genotipo) 15

16 Considerazioni AnimalQTLdb (http://www.animalgenome.org/qtldb/) Non esistono ancora per nessuna specie studi per la ricerca di QTL correlati a N-Capture, alle emissioni di CH 4, al metagenoma; Il futuro della selezione e della ricerca va in questa direzione! 16

17 Dieta Genoma individuo Fenotipo Microbiota 17

18 Boundaries del sistema: Associazione fenotipo - genotipo Non è chiaro ancora quale sia il contributo della dieta e quale quello dell animale nel determinare la composizione del microbiota ruminale ma è ragionevole pensare che differenti fenotipi ruminali determinino differenti fenotipi animali in termini di emissioni di gas e efficienza digestiva 18 Misurazione del fenotipo!!!

19 La popolazione microbica nel rumine - 2 METAGENOMICA Analisi di tutti i micro-organismi presenti un in particolare ambiente grazie alle tecnologie omiche, per la ricerca di nuove specie o per creare un profilo di specie conosciute. Mentre il genoma di un individuo umano è statico, il metagenoma microbico è dinamico e fluttuante. Per ottenere un analisi accurata del microbioma di un individuo servono sequenziamenti multipli. Indaga una sorta di dimensione trascendente, super-organica, che emerge 19 dalla stretta interazione dell'organismo animale con i propri micro-ospiti.

20 Il genoma dei procarioti 1. Non è provvisto di una membrana nucleare che lo separa dal citoplasma 2. Ha un unico genoma circolare costituito da una doppia elica di DNA 3. E. Coli = 4x106 bp di cui il 99% è costituito da sequenze codificanti o regolatrici e solo l 1% da sequenze ripetute non codificanti. 4. I geni sono organizzati in operoni ovvero unità funzionali in cui i geni correlati per attività (es. enzimi di una via metabolica) sono posti l uno accanto all altro sul cromosoma, trascritti in un unico mrna e regolati in blocco. 20

21 Il microbiota Esiste un elevata variabilità individuale nella composizione del microbioma ruminale, indipendente dalla dieta Analisi microbiologiche del liquido ruminale di 3 manze allevate e alimentate allo stesso modo Sconosciuti Batteri adesi alla frazione solida Bacteriodetes Batteri della frazione liquida POOL Proteobacter Firmicutes 21 (Brulc et al., 2009)

22 Gli Archaea, i microrganismi responsabili della produzione di metano, sono localizzati maggiormente nella frazione liquida del contenuto ruminale Microbo (% EGT totali) Frazioni solide Archaea 2,2 2,3 0,68 4,2 Batteri 94,3 94,6 95,2 91,3 Eucarioti 1,5 1,7 0,61 1,5 Virus 0,12 0,14 0,13 0,14 Frazione liquida Archaea adesi alla frazione solida Archaea della frazione liquida POOL Methanobacteria 22 Methanomicrobia Methanococci (Brulc et al., 2009)

23 Rilevazione del metatipo OMICA e STUDI DI ASSOCIAZIONE PCR-DGGE (Polimerase Chain Reaction Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Le differenti specie microbiche vengono differenziate in base al comportamento sul gel di agarosio in seguito alla denaturazione delle doppia elica di DNA DNA microbici di domini o generi diversi Agente denaturante del filamento di DNA Gel di Agarosio Filamento parzialmente denaturato 23 Filamento non denaturato

24 NGS: Next Generation Sequencing 454 Roche Genome Sequencer FLX System (pyrosequencing) Le specie microbiche vengono caratterizzate grazie al sequenziamento di parte del DNA ribosomiale 16S. La tecnica sfrutta la produzione di pirofosfato durante la sintesi si DNA per attivare l agente fluoroforo. Copie di DNA del microrganismo attaccate alla bead Lettura e registrazione delle fluorescenze Aggiunta in successione di nucleotidi al mix di reazione, 24 che quando vengono incorporati attivano la luciferina

25 Genetica e omica dell interazione animale - microbiota L efficienza digestiva è influenzata del metabolismo ruminale, e quindi dalla composizione del microbioma e dalle sue interazioni con l ospite Differenti fenotipi ruminali possono influenzare l utilizzazione dei nutrienti e la produzione di gas La variabilità genetica (indirizzo produttivo, razze) determina differenti efficienze digestive le differenze genetiche determinano quindi interazioni diverse con il microbioma ruminale 25

26 Genetica e omica dell interazione animale - microbiota Comprendere come l alimentazione influenza la composizione del microbioma ruminale (metagenomica) e la relazione tra la sua composizione e le emissioni di gas e l efficienza di N-capture Individuare i genotipi o i caratteri associati alle diverse composizioni del microbioma ruminale (studi di associazione genetica) e le modalità con cui si esprimono (trascrittomica) 26

27 MISURAZIONE DELLE EMISSIONI DI METANO - 1 Diretta SF6 Traces technique (Johnson et al., 2007) Il gas inerte zolfo esafluoride, contenuto in un tubo permeabile a rilascio noto inserito nel rumine, è utilizzato come tracciante delle emissioni di metano da naso e bocca. L analisi viene svolta sul campione raccolto per depressione nel tubo metallico posto attorno al collo dell animale. -Il periodo di raccolta del campione è regolabile - La prova è realizzabile in circostanze variabili - L animale 27 può muoversi e mangiare liberamente

28 MISURAZIONE DELLE EMISSIONI DI METANO - 2 Indiretta Misura della profilo acidico della frazione grassa del latte (Martin et, 2008) Gli acidi grassi polinsaturi (PUFA) possiedono: Effetto tossico sui microganismi responsabili della digestione della fibra e della cellolosa (protozoi e batteri) effetto indiretto sulla produzione di VFA ruminali Effetto tossico sui microrganismi metanogeni (archaea utilizzatori di H+) effetto diretto sulla sintesi di metano nel rumine Esiste una correlazione positiva tra le emissioni di metano e l aumento nel latte di acidi grassi saturi, in particolare quelli a catena media C8:0 C16:0 Esiste una correlazione negativa tra le emissioni di metano e l aumento nel latte di 28 acidi grassi insaturi, in particolare C18:1, C18:2 e isoforme

29 29 Relazione fra emissioni di CH4 e profilo in FA del latte in bovine alimentate con fonti lipidiche a diverso contenuto in UFA (Chilliard et al., 2009)

30 30 Relazione fra emissioni di CH4 e profilo in FA del latte in bovine alimentate con fonti lipidiche a diverso contenuto in UFA (Chilliard et al., 2009)

31 Efficienza della sintesi microbica e N capture con Derivati Purinici (EMNS, Stefanon et al, 2001) 31 (Chen and Orskov 1998)

32 Feeding & Breeding Migliorare l utilizzazione dei nutrienti e l efficienza digestiva nei ruminanti significa: Migliorare le performance (accrescimenti, produzione di latte) Ridurre le deiezioni Ridurre le perdite di energia e carbonio nel processo digestivo Migliorare la redditività dell azienda Ridurre le emissioni di gas serra (CH4, CO2, NO2) L efficienza digestiva, e quindi le emissioni di metano dipendono da: 1. Alimentazione, composizione e bilanciamento della razione 2. Genetica quantitativa e genomic selection 3. Metagenoma 4. Management

33 33

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