5. Applicazioni delle biotecnologie innovative nello sviluppo di nuovi farmaci e prodotti farmaceutici biotecnologici commerciali
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- Silvia Corsi
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1 5. Applicazioni delle biotecnologie innovative nello sviluppo di nuovi farmaci e prodotti farmaceutici biotecnologici commerciali 5.3. Proteine del sangue Fattori della coagulazione: VII, VIII e IX Fattori della fibrinolisi: tpa
2 COAGULAZIONE: processo di formazione del coagulo di fibrina, che congloba gli elementi cellulari del sangue, in seguito a danno tissutale o della parete endoteliale FIBRINOLISI: processo di dissoluzione enzimatica del coagulo di fibrina EMOSTASI: meccanismi biochimici e cellulari finalizzati al mantenimento dell integrità dei vasi (=evitare perdite di sangue) e della fluidità del sangue. Emorragie ed episodi trombotici denotano alterazione dell emostatsi
3 La coagulazione del sangue Globuli rossi intrappolati nell intreccio insolubile del coagulo di fibrina Fotografia al microscopio elettronico di un tratto di un filamento di fibrina Formazione del coagulo fibroso a partire dai monomeri di fibrina
4 Il sistema a cascata della coagulazione del sangue VIA INTRINSECA: inizia quando il sangue viene a contatto con superfici di tessuto lesionate VIA ESTRINSECA: inizia quando si verificano traumi a carico dei vasi sanguigni *= serina proteasi
5 Fattori della coagulazione del sangue NATURA ETEROGENEA: glicoproteine, lipoproteine, ioni Calcio ZIMOGENI: pro-enzimi che in seguito ad attivazione (spesso a cascata) agiscono da serina-proteasi FORMA ATTIVA: molecole a doppia catena, con sito attivo nella catena B VITAMINA K: cofattore essenziale per la sintesi dei fattori enzimatici della coagulazione (formazione di γ- carbossiglutamato) permette ai fattori di legarsi ai fosfolipidi di membrana, chelando ioni Ca2+ COFATTORI NON ENZIMATICI: fattore V, fattore VIII
6 Ruolo della vitamina K nella sintesi dei fattori della coagulazione
7 Step della coagulazione del sangue DANNO ENDOTELIALE (3) Rilascio fattore tissutale (2) Rilascio fattore von Willebrand (vwf) (1) Rilascio endoteline Attivazione del fibrinogeno in FIBRINA Aggregazione piastrine (formazione tappo piastrinico) VASOCOSTRIZIONE EMOSTASI SECONDARIA EMOSTASI PRIMARIA
8 VIA ESTRINSECA VIA INTRINSECA è più rapida: minor numero di fattori coinvolti è più lenta: comprende, oltre i tre fattori dell'altra via, anche i fattori XII, XI, IX e VIII, tutti fattori plasmatici attivata quando una lesione di un vaso sanguigno produce la liberazione, dalle cellule danneggiate, di fosfolipidi e di un complesso proteico detto fattore tissutale o tromboplastina tissutale (DANNO ENDOTELIALE) I fattori attivati, oltre il fattore tissutale, sono i fattori plasmatici VII, X e V. è innescata dall'attivazione del fattore XII, o fattore di Hageman, la quale si verifica quando il sangue entra a contatto con la matrice extracellulare, in particolare con le macromolecole di collagene Esposizione molecole trombogeniche con cariche negative del sottoendotelio (DANNO TISSUTALE) LE DUE VIE COMUNQUE SI INTERSECANO E SI INFLUENZANO: Ovviamente una lesione tissutale attiva entrambe le vie della coagulazione; infatti, la lesione non solo determina la liberazione della tromboplastina tissutale, ma anche, danneggiando i vasi sanguigni, consente al sangue di venire a contatto con superfici diverse da quelle endoteliali. Fattore tissutale= glicoproteina ubiquitaria di membrana espressa dai fibroblasti delle matrici sottoendoteliali e presente nella membrana di vescicole intracellulari delle cellule endoteliali
9 Tutti i componenti del processo presenti nel sangue Via intrinseca Fattore XIIa Fattore XII Fattore XIa Fattore XI Fattore IX Fattore IXa Il componente che innesca il processo è di derivazione tissutale Fattore VIII Fattore VIIIa Ca2+ fosfolipidi Via estrinseca Fattore VII + fattore tissutale Fattore VIIa + fattore tissutale Fattore X Fattore Xa Va, Ca2+ fosfolipidi Fibrinogeno Protrombina Trombina Fibrina
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11 Attivazione del fattore X punto di convergenza della via INTRINSECA ed ESTRINSECA
12 Via comune della coagulazione
13 Deficit nei fattori della coagulazione causano emorragie EMOFILIA emofilia B Via intrinseca emofilia A Fattore IX Fattore IXa Fattore VIII Fattore VIIIa Ca2+ fosfolipidi Fattore VII + fattore tissutale Fattore VIIa + fattore tissutale Fattore X Fattore Xa Va, Ca2+ fosfolipidi Fibrinogeno Protrombina Trombina Via estrinseca Fibrina
14 Fattore VIII (antiemofilico) ATTIVITA : aumenta l attivazione del fattore X da parte del fattore IXa, in presenza di Ca++ e fosfolipidi (agisce da cofattore) Proteina plasmatica sintetizzata dal fegato; forma matura catena leggera da 80 kd associata a diverse catene pesanti di 210 kd 25 potenziali siti di glicosilazione (N-linked) importante per l emivita in circolo 6 siti di solfatazione (su residui di Tyr) critica per l attività biologica 22 Cys 1 solo gene (26 esoni), localizzato sul cromosoma X Difetti a carico del gene del fattore VIII causano emofilia A (malattia X-linked; incidenza 1/5000 maschi)
15 maturazione attivazione
16 Prodotti farmaceutici (octocog alfa) ottenuti in cellule animali octocog alfa RECOMBINATE (dal 1992) octocog alfa KOGENATE (dal 1993) Prodotti di prima generazione Purificazione con cromatografia di immunoaffinità FORMULAZIONI: Liofilizzata SOMMINISTRAZIONE: Endovenosa, o iniezione, o infusione a goccia EMIVITA: ore INDICAZIONI TERAPEUTICHE (Fattore VIII= antiemofilico A): Prevenzione e controllo degli episodi emorragici Trattamento pre-, intra-, post-operatorio Impiegato in adulti e bambini ( 6 anni), a breve e a lungo termine EFFETTI COLLATERALI: Reazioni allergiche di ipersensibilità octocog alfa HELIXATE NEXGEN (2000) moroctocog alfa REFACTO HELIXATE NEXGEN: miglior profilo di sicurezza virale: inattivazione virale con solventi/detergenti REFACTO: Delezione del dominio B (1438 aa; 170 kd) maggiore stabilità Sviluppo di anticorpi neutralizzanti l attività (inibitori) nel 20% dei pazienti mai trattati
17 Fattore VIII ricombinante BHK = Baby Hamster Kidney (linea cellulare di rene di criceto) CHO = Chinese Hamster Ovary (linea cellulare ovarica di criceto cinese)
18 Fattore IX (antiemofilico) ATTIVITA : controlla l attivazione del fattore X nella sua forma attivata (Xa) Proteina plasmatica sintetizzata dal fegato; circola nel plasma come zimogeno Attivato dal complesso fattore VIIa/fattore tissutale (VIA ESTRINSECA), quindi dal fattore XIa (VIA INTRINSECA) Glicoproteina a singola catena di 415 aa ( 55 kd) 1 solo gene, (34 kbp, 8 esoni), localizzato sul cromosoma X Il deficit del fattore IX è noto come emofilia B (malattia X-linked) Domini simili al fattore di crescita epidermico Legame ai fosfolipidi anionici di membrana
19 Produzione di fattore IX ricombinante (nonacog)
20 Prodotto farmaceutico (nonacog alfa) ottenuto in CHO nonacog alfa BENEFIX Prodotto di prima generazione sequenza aminoacidica = all endogena Purificazione dal terreno di coltura delle cellule (secreta) FORMULAZIONI: Liofilizzata SOMMINISTRAZIONE: In vena, a bassa velocità di infusione (dose variabile in base all impiego) EMIVITA: ore (media 19.3 ore) INDICAZIONI TERAPEUTICHE : Trattamento e profilassi delle emorragie in pazienti affetti da emofilia B Profilassi a lungo termine contro episodi emorragici in pazienti con emofilia B grave Dati insufficienti per l impiego nei bambini ( 6 anni) EFFETTI COLLATERALI: Reazioni di ipersensibilità di tipo allergico Sviluppo di anticorpi neutralizzanti l attività (inibitori) = evento raro
21 Fattore VII ATTIVITA : attivazione diretta dei fattori X e IX Proteina plasmatica glicosilata sintetizzata principalmente dal fegato a singola catena (406 aa ; 55 kd) Circola in forma di zimogeno inattivo (99%) o sotto forma attivata (1%) Complesso [fattore tissutale/fattore VIIa/Ca++] attivato da: fattore VIIa circolante, altre proteasi (Xa, IXa, IIa), autoattivazione si genera una molecola costituita da 2 catene con attività serinoproteasica (VIIa) Strutturalmente costituita da moduli molecolari distinti (Fig. 10.9) Domini ad alta omologia con il fattore di crescita epidermico (EGF) 9 residui di γ-glu
22 Prodotti farmaceutici (eptacog alfa) ottenuti in BHK eptacog alfa NOVOSEVEN Prodotto di prima generazione Purificazione con cromatografia a scambio ionico+immunoaffinità Conversione in forma attivata a doppia catena durante la purificazione Inattivazione virale mediante trattamento con solvente/detergente FORMULAZIONI: Liofilizzata SOMMINISTRAZIONE: Endovenosa (2-5 min per singola iniezione) EMIVITA: 2-3 ore, con differenze tra pazienti sani e pazienti emofilici INDICAZIONI TERAPEUTICHE: Effetto farmacodinamico atteso per fattore VIIa: incremento della formazione di fattore Xa, IXa e trombina induce emostasi locale (+) Trattamento di pazienti emofilici che abbiano sviluppato anticorpi (inibitori) contro il fattore VIII o IX controllo temporaneo dell emorragia con eptacog alfa Prevenzione sanguinamenti nel corso di interventi chirurgici Trattamento di pazienti affetti da deficit del fattore VII congenito Trattamento emorragia cerebrale (arginare ematoma intracranico).studio in corso EFFETTI COLLATERALI: Coaguli di sangue in vene o arterie (rari, 1: 1000)
23 Eparina= anticoagulante Meccanismo di azione molecola con attività anticoagulante naturale prodotta nell'apparato di Golgi dei basofilociti e dei mastociti. Si lega naturalmente a un fattore del sangue, l'antitrombina III (enzima inibitore), attivandola. AT-III attivata a sua volta inattiva la trombina (Fattore IIa), il Fattore X, e altre proteasi coinvolte nella coagulazione del sangue. AT-III si lega specificatamente a una sequenza pentasaccaridica solfata contenuta nella sequenza polimerica dell'eparina. GlcNAc/NS(6S)-GlcA-GlcNS(3S,6S)-IdoA(2S)-GlcNS(6S) cambiamento conformazionale di AT-III disattivazione del fattore Xa. La disattivazione del fattore Xa necessita di un legame tra il pentasaccaride dell'eparina e il fattore Xa stesso. interazioni possibili grazie all'alta densità di carica elettronegativa dell'eparina. La formazione di un complesso ternario tra AT-III, trombina e eparina risulta quindi nella disattivazione della trombina stessa.
24 Il sistema a cascata della coagulazione del sangue: regolazione Anticoagulanti: Eparina Chelanti del Ca++ Inibisce anche IXa, XIa e XIIa
25 COAGULAZIONE
26 FIBRINOLISI= dissoluzione del coagulo di fibrina t-pa PAI-1 E PAI-2 PLASMINOGENO (proenzima) PLASMINA (enzima fibrinolitico sintetizzato dal rene) a2-antiplasmina FIBRINA PRODOTTI DEGRADATI
27 SISTEMA FIBRINOLITICO sistema multienzimatico, costituito da serino-proteasi I fattori fibrinolitici circolano in forma di zimogeni Zimogeni attivati da un taglio proteolitico che libera la forma attiva Forma attiva costituita da 2 catene: A= contiene i domini responsabili delle diverse funzioni enzimatiche (moduli altamente conservati, responsabili della specificità) B= contiene il sito catalitico F= finger EGF= dominio fattore di crescita K= dominio kringle (ad ansa tripla)
28 REGOLAZIONE DELLA FIBRINOLISI serpins Streptochinasi
29 FIBRINOLISI
30 t-pa (attivatore tissutale del plasminogeno) ATTIVITA : taglio proteolitico del plasminogeno nella proteina attiva plasmina Glicoproteina sintetizzata dalle cellule endoteliali dei vasi (527 aa, 64 kd,) 4 siti di glicosilazione in N (zuccheri = 6-8% della massa) 35 Cys, 17 ponti disolfuro Diversi domini: Finger, EGF, Kringle, dominio catalitico COOH-terminale (260 aa) Attivato dal taglio (ad opera della plasmina) fra Arg275-Ile 276 catene A e B, tenute insieme da un ponte disolfuro Due forme di tpa (con/senza glicosilazione Asn 184): tipo I e tipo II maggiore attività Durante la FIBRINOLISI la fibrina del coagulo lega il tpa e lo attiva FINGER TAGLIO Viene scisso legame Arg275-Ile276 KRINGLE SERIN-PROTEASE catena pesante N-terminale responsabile del legame alla fibrina DOMINIO FINGER DOMINIO EGF-LIKE DUE KRINGLE catena leggera C-terminale responsabile dell attività catalitica (DOMINIO SERIN PROTEASI His-Asp-Ser) che taglia il plasminogeno
31 Il t-pa attiva il plasminogeno con taglio enzimatico all Arg560 t-pa Plasminogeno legato alla fibrina Plasmina legata alla fibrina DEGRADAZIONE FIBRINA Cellule endoteliali trombo
32 Prodotti farmaceutici a base di t-pa Prodotto in CHO Deleti 3 domini Fibrino-selettiva Prodotto in E. coli Modifiche in 3 punti > Fibrino-specificità > Resistenza vs PAI-1 Proteine di seconda generazione
33 Prodotti farmaceutici a base di t-pa
34 Prodotto a una o due catene in CHO EMIVITA <5 min Identico al t-pa endogeno umano ALTEPLASE SOMMINISTRAZIONE: endovenosa (IV) Dose raccomandata variabile in dipendenza dalla patologia (infarto miocardico, embolia polmonare) e del peso corporeo 0.9 mg/kg per infusione di 60, il 10% di farmaco deve essere iniettato in bolo in 1 min CLEARANCE EPATICA recettore-mediata: Le cellule del Kuppfer e endoteliali attraverso il recettore del mannosio, gli epatociti con un recettore carboidrato indipendente
35 RETEPLASE (seconda generazione) MUTANTE DI DELEZIONE mancano Kringle 1, Finger e EGF-like domains non glicosilato prodotto in E. Coli AUMENTA L EMIVITA (15 MIN) AUMENTA LA SELETTIVITA PER LA FIBRINA
36 TENECTEPLASE (seconda generazione) sostituzioni aa in due punti del Kringle 1 AUMENTA SPECIFICITA CON LA FIBRINA 4 sostituzioni aa nel sito catalitico DIMINUISCE CLEARANCE PLASMATICA EMIVITA PROLUNGATA ( 17 min) Asn117 Gln AUMENTA RESISTENZA AL PAI-1 Thr103 Arg AUMENTA SPECIFICITA PER LA FIBRINA Lys-His-Arg-Arg Ala Ala Ala Ala
37 LANOTEPLASE (nuove prospettive) MUTANTE DI DELEZIONE DEL t-pa NATIVO Mancano Finger e EGF-like domains Mutazione puntiforme Asn 117 Gln) prodotto in CHO EVITA CLEARANCE DA PARTE DEI RECETTORI PER IL MANNOSO EPATICI PROLUNGA L EMIVITA A 10 MIN
38 PROTEINE IBRIDE (=DI FUSIONE) (nuove prospettive) AUMENTA L AFFINITA PER I COAGULI EVITA EMORRAGIE DOVUTE A DEGRADAZIONE DEL FIBRINOGENO
39 Prodotti farmaceutici a base di t-pa Alteplase Reteplase Non modificato Disponibili 2 prodotti con 20 e 50 mg principio attivo FORMULAZIONI: Liofilizzata SOMMINISTRAZIONE: Endovenosa (bolo iniziale +...) EMIVITA (iniziale e terminale) Eliminazione bifasica: (t 1/2a) 4-5 min; (t 1/2b) 40 min INDICAZIONI TERAPEUTICHE: Infarto acuto del miocardio (AMI) Embolia polmonare massiva acuta Ripristino della funzionalità cateteri vascolari EFFETTI COLLATERALI: Sanguinamento (caduta Ht e Hb) Mutante di delezione FORMULAZIONI: Liofilizzata SOMMINISTRAZIONE: Endovenosa EMIVITA (iniziale e terminale): (t 1/2a) 18 min; (t 1/2b) 5-6 ore INDICAZIONI TERAPEUTICHE: Infarto acuto del miocardio (AMI) EFFETTI COLLATERALI: Sanguinamento (caduta Ht e Hb) Tenecteplase Diverse sostituzioni aminoacidiche FORMULAZIONI: Liofilizzata SOMMINISTRAZIONE: Endovenosa EMIVITA (iniziale e terminale): (t 1/2a) 25 min; (t 1/2b) 130 min INDICAZIONI TERAPEUTICHE: Infarto acuto del miocardio (AMI) EFFETTI COLLATERALI: Sanguinamento (caduta Ht e Hb)
40 PRODOTTI COMMERCIALIZZATI Nome Alteplase Alteplase Reteplase Tenecteplase Nome Commerciale Activase Catfhlo Activase Ratavase TNKase Casa Produttrice Genentech Genentech Boehringer Mannheim Genentech Uso terapeutico Infarto acuto del miocardio (AMI) Ripristino della funzionalità cateteri vascolari Infarto acuto del miocardio (AMI) con aumento della funzione ventricolare in seguito all evento Riduzione della mortalità associata all infarto del miocardio acuto (AMI)
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42 Approfondimenti Testi di riferimento Calabrò M.L. Compendio di Biotecnologie farmaceutiche (EdiSES) Cap. 10
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