IL SEGNALE SULLA CURVA DI CALIBRAZIONE

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1 IL PROCESSO ANALITICO CALIBRAZIONE Metodi analitici relativi Richiedono la costruzione di una curva di calibrazione, che descrive la relazione fra il segnale misurato e la concentrazione dell analita. A questa categoria appartiene la maggior parte dei metodi analitici strumentali. La curva di calibrazione si ricava attraverso la misura di standards chimici (campioni a concentrazione nota di analita). Metodi analitici assoluti La correlazione fra la grandezza misurata e la quantità di analita è univocamente determinata da leggi fisiche (es. tecniche gravimetriche e coulometriche). A tale categoria appartengono anche le titolazioni, nelle quali la quantità di analita viene determinata sfruttando una reazione chimica con un reagente a concentrazione nota aggiunto fino all equivalenza stechiometrica con l analita presente nel campione (standardizzazione). Le principali procedure di calibrazione sono: Calibrazione con uno standard esterno Calibrazione con uno standard interno Metodo dell aggiunta standard

2 IL SEGNALE SULLA CURVA DI CALIBRAZIONE Il segnale misurato in un metodo strumentale può avere varia natura, e talvolta è possibile scegliere fra diverse possibilità: ad esempio in un analisi cromatografica si possono utilizzare sia le altezze che le aree dei picchi cromatografici. Solitamente in un analisi strumentale non si utilizza direttamente il segnale misurato, ma si corregge il segnale sottraendogli il segnale del bianco, misurato in genere prima di tutti gli altri campioni, in modo da tenere conto di tutti i fattori (chimici, strumentali, ecc.) che influenzano la risposta in modo indipendente dalla concentrazione dell analita. Il bianco dovrebbe essere idealmente identico al campione in analisi, ma non contenere l analita, ed essere misurato utilizzando esattamente la stessa procedura impiegata per i campioni. In pratica, in particolare per campioni complessi, non è possibile ottenere un vero e proprio bianco poiché non è possibile simulare esattamente la composizione del campione. In tal caso si usano spesso: bianco del solvente: contiene semplicemente lo stesso solvente nel quale è disciolto il campione bianco dei reagenti: contiene il solvente più tutti i reagenti utilizzati nella preparazione del campione o necessari alla produzione del segnale che viene misurato

3 CALIBRAZIONI Nella quasi totalità dei metodi analitici quantitativi il dato di quantità incognita viene ottenuto per interpolazione sulla CURVA DI CALIBRAZIONE. Si definisce CURVA DI CALIBRAZIONE il grafico che riporta il segnale analitico (S) in funzione della quantità di analita (q) e viene ottenuta sottoponendo a misura degli standard a quantità nota di analita 1.0 S q

4 INTERVALLO DINAMICO E LINEARE Si definisce INTERVALLO DINAMICO quell intervallo di quantità di analita entro il quale il SEGNALE ANALITICO varia al variare della quantità stessa 1.0 S Si definisce INTERVALLO LINEARE un intervallo dinamico entro il quale il SEGNALE ANALITICO varia linearmente al variare della quantità di analita A q c

5 CALIBRAZIONE CON UNO STANDARD ESTERNO Nella calibrazione con standard esterno la curva di calibrazione viene ricavata dall analisi di una serie di standard esterni a concentrazione nota di analita preparati separatamente dal campione. La concentrazione dei campioni incogniti - trattati nello stesso modo degli standard esterni - viene poi determinata per interpolazione del segnale misurato sulla curva di calibrazione. S S4 S S S3 S2 S S1 C1 C2 C3 C4 [A] [A] C [A] Misura degli standard esterni a concentrazione nota C1 - C4 Determinazione della curva di calibrazione (generalmente con un analisi di regressione) Misura del segnale S del campione a concentrazione incognita ed interpolazione sulla curva di calibrazione

6 segnale segnale METODO DEI MINIMI QUADRATI Un operazione comune in chimica analitica consiste nel ricavare la curva di calibrazione, cioè la relazione fra il segnale misurato durante un analisi e la concentrazione dell analita, e da essa ricavare la concentrazione di un campione incognito per interpolazione del segnale misurato. Anche se l equazione di questa relazione è nota, il calcolo dei suoi coefficienti è complicato dalla presenza degli errori indeterminati, che fanno si che i punti sperimentali non si trovino effettivamente sulla curva, ma se ne discostino in maniera casuale. Caso ideale: nessun errore di misura Caso reale: misure affette da un errore indeterminato? concentrazione concentrazione Dal punto di vista matematico l analisi di regressione applicata attraverso il metodo dei minimi quadrati permette, una volta definita la forma della relazione che lega il segnale (y) alla concentrazione (x), di ottenere i coefficienti della migliore curva che passa attraverso una serie di punti sperimentali (x i, y i ).

7 ASSUNZIONI DI BASE DEL METODO DEI MINIMI QUADRATI Nel caso più semplice la relazione fra il segnale (y) e la concentrazione (x) è lineare e si può utilizzare un analisi di regressione lineare. La dipendenza di y da x ha la forma y = mx + b ed è definita una volta che vengono determinati i coefficienti m (pendenza) e b (intercetta) della retta. y Dy/Dx = pendenza (m) Dx intercetta (b) Dy Per semplicità si assume poi che ogni deviazione dei punti sperimentali dalla retta dipenda da un errore commesso durante la misurazione. In altre parole, lo scostamento dei punti sperimentali dalla retta si ha soltanto lungo la direzione y, mentre ai valori di x non è associato alcun errore. Lo stesso concetto può essere utilizzato anche se la correlazione fra y ed x non è lineare (regressione non lineare). Esistono poi tecniche di regressione più complesse che prevedono errori associati ad entrambi gli assi, oppure assegnano differente importanza ai vari punti in funzione dell entità dell errore ad essi associato. errore solo su y x

8 CALCOLO DEI COEFFICIENTI Il calcolo dei coefficienti della retta con il metodo dei minimi quadrati si basa sulla seguente considerazione (ricavabile su base statistica): punto sperimentale la retta migliore che approssima i punti sperimentali è quella per la quale la somma dei quadrati dei residui è minima In termini matematici: y i mx i + b residuo x i corrispondente punto teorico sulla retta di calibrazione SS resid 2 y (mx b) MIN i i i Per calcolare i valori di m e b, in primo luogo si definiscono per semplicità le quantità S xx, S yy e S xy 2 2 Sxx (xi x) S yy (yi y) Sxy (xi x)(y i y) i i dove (x i, y i ) sono le coordinate dei singoli punti, in numero di N, ed x ed y sono i valori medi delle coordinate x ed y dei punti. i

9 CALCOLO DEI COEFFICIENTI La condizione di minimo sulla somma dei quadrati dei residui conduce ai seguenti valori per i coefficienti: m S S xy xx b y mx

10 Ovvero l espressione quantitativa dell aderenza dei punti alla retta di regressione. Il valore del coefficiente di determinazione è compreso nell intervallo 0 1: nell ipotesi di una dipendenza lineare, per R 2 = 1 y è esattamente proporzionale ad x, mentre per R 2 = 0 y ed x non sono correlati fra di loro. COEFFICIENTE DI DETERMINAZIONE R 2 y R 2 = 1 x 0 < R 2 < 1 x R 2 = 0 x Il coefficiente di determinazione è però valido solo nell ambito della relazione fra y ed x per la quale è stato definito. Un valore di R 2 elevato non implica necessariamente che la relazione ipotizzata fra y ed x sia quella corretta, mentre un valore basso potrebbe semplicemente significare che y ed x sono legati fra di loro in un altro modo. y R 2 alto x y R 2 basso x

11 Dati i seguenti dati relativi alle concentrazioni dell analita methomyl in soluzioni standard determinare la retta di regressione lineare, e calcolare la concentrazione del pesticida nel campione. Calibrazione: [analita] in ng/g segnale in A.U Campione: 1 det: 330 A.U. 2 det: 345 A.U.

12 [analita] in ng/g segnale in A.U Y=mX+b _ X= /6= _ Y= /6=292.7 S xx =( ) 2 +( ) 2 +( ) 2 +( ) 2 +( ) 2 +( ) 2 = = 1.74 * 10 7 S xy = [( )*( )+ ( )*( ) + ( )*( )+ ( )*( )+ ( )*( ) + ( )*( ) = 3.12 * 10 6 m= S xy / S xx =3.12 * 10 6 / 1.74 * 10 7 =0.179; b=y-mx; b=292.7-(0.179*1466.7)=29.7 Retta regressione: Y=0.179 X +29.7

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14 LIMITAZIONI DELLA CALIBRAZIONE CON UNO STANDARD ESTERNO La calibrazione con standard esterno è la procedura di calibrazione più comunemente usata se si ha a disposizione uno standard con caratteristiche adeguate (stabilità, purezza, ecc.): Semplice Rapida (una singola curva di calibrazione può essere utilizzata per tutte le analisi) Richiede un piccolo numero di standard (soprattutto se la curva di calibrazione è una retta) Questo metodo presuppone però che la risposta all analita nello standard e nel campione sia identica: la forma chimica dell analita negli standard deve essere identica a quella dell analita presente nel campione e non si devono avere interferenze da parte della matrice del campione (con matrice del campione si intendono tutti i costituenti del campione - eccetto l analita - che sono potenzialmente in grado di determinare variazioni nella risposta del metodo indipendenti dalla concentrazione della specie in esame). Questa condizione può essere difficile da soddisfare, soprattutto per campioni a composizione complessa (es. materiali biologici).

15 IL PROCESSO ANALITICO CALIBRAZIONE CON UNO STANDARD INTERNO Nella calibrazione con standard interno una quantità nota di una specie di riferimento (standard interno) che può essere determinata separatamente dall analita viene aggiunta prima dell analisi a standard, campioni e bianco. Il segnale di risposta, utilizzato per la costruzione della curva di calibrazione, è il rapporto fra il segnale dell analita e quello della specie di riferimento. Il metodo della standard interno può compensare diversi tipi di errori a condizione che essi influenzino nello stesso modo sia l analita che la specie di riferimento. Perché ciò avvenga, la specie di riferimento deve avere caratteristiche chimico-fisiche quanto più possibile simili a quelle dell analita. Una delle possibilità più interessanti è quella di utilizzare come specie di riferimento un analita marcato con un isotopo stabile poco diffuso in natura (ad esempio 13 C per una molecola organica). In tal modo analita e specie di riferimento hanno esattamente le stesse proprietà chimico-fisiche ma restano comunque distinguibili mediante tecniche di spettrometria di massa. Una tecnica strettamente correlata con l uso di analiti marcati con isotopi stabili è l analisi mediante diluizione isotopica.

16 CALIBRAZIONE CON UNO STANDARD INTERNO (II)

17 CORREZIONE DEGLI ERRORI MEDIANTE CALIBRAZIONE CON STANDARD INTERNO

18 METODO DELL AGGIUNTA STANDARD Premesso che le interferenze di tipo chimico vanno assolutamente eliminate per non commettere errori analitici, il metodo più usato per compensare le interferenze dovute a matrici più o meno complesse è quello dell'aggiunta multipla di standard e, nella sua variante più semplice, il metodo dell'aggiunta singola. Nel metodo dell aggiunta standard il campione viene analizzato sia da solo che in presenza di quantità note di soluzione standard dell analita. L aggiunta di analita può essere singola (metodo dell aggiunta standard singola) o possono essere effettuate più aggiunte a concentrazioni crescenti (metodo dell aggiunta standard multipla). La concentrazione dell analita viene determinata sulla base della risposta assumendo una relazione lineare tra la risposta e la concentrazione dell analita. Poiché il segnale dello standard viene misurato in presenza della matrice del campione, questo metodo permette in linea di principio di compensare qualunque effetto di interferenza da parte della matrice, anche se non noto a priori, assumendo che la matrice influenzi nello stesso modo l analita aggiunto e quello già presente nel campione (NON è Sempre Vero!!!). Per evitare errori eccessivi le concentrazioni dell analita aggiunto dovrebbero essere dello stesso ordine di grandezza di quelle già presenti nei campioni.

19 IL PROCESSO ANALITICO METODO DELL AGGIUNTA STANDARD (II) Le limitazioni principali di questo metodo sono: L analisi richiede un tempo maggiore, poiché per ogni campione sono richieste almeno due misure (nel metodo dell aggiunta standard multipla deve essere costruita e misurata una curva di calibrazione per ogni campione in esame) E indispensabile avere una risposta lineare alla concentrazione dell analita nella matrice del campione (questo può essere comunque verificato direttamente nel corso dell analisi se si utilizza il metodo dell aggiunta standard multipla). L analita aggiunto deve essere esattamente nella stessa forma chimica di quello già presente nel campione e subire le stesse interferenze (è possibile che alcuni tipi di interferenze da parte della matrice si instaurino solo dopo un certo tempo es. reazioni di complessazione relativamente lente) E fondamentale avere a disposizione un bianco adeguato, che permetta di eliminare qualunque segnale di tipo aspecifico.

20 IL PROCESSO ANALITICO METODO DELL AGGIUNTA STANDARD SINGOLA Nel metodo dell aggiunta standard singola la concentrazione dell analita nel campione viene ricavata dal confronto fra i segnali misurati in assenza e presenza dell analita aggiunto, assumendo una dipendenza lineare del segnale dalla concentrazione (S = kc) e nessun segnale aspecifico. Bianco Campione (Cx) Aggiunta di analita B 0 1 S S 0 1 kc x k(c x C ) 1 C x S0 S S 1 0 C 1 Analita aggiunto C1 Conc. effettiva 0 Cx Cx+C1 (trascurando l effetto dell eventuale diluizione)

21 METODO DELL AGGIUNTA STANDARD MULTIPLA Si parte da una serie di aliquote di soluzione campione tutte uguali e si effettuano aggiunte diverse, ma note, dell'analita. Si ottiene così una serie di soluzioni, che contengono una parte di analita in quantità incognita (da determinare), ma uguale per tutte le soluzioni, e un'altra parte di analita nota (perché aggiunta), ma diversa per ogni soluzione. Dalla risposta strumentale registrata per tutte le soluzioni si può risalire alla concentrazione dell'analita presente nel campione. Esistono sostanzialmente due modi per applicare questo metodo: si possono effettuare le aggiunte su un'aliquota fissa di campione, ottenendo soluzioni di volume crescente; si possono portare a volume costante le diverse soluzioni preparate con le aggiunte.

22 METODO DELL AGGIUNTA STANDARD MULTIPLA (I)

23 Semplificando si ottiene una retta che intercetta l asse delle y ad un valore negativo di concentrazione di standard aggiunto (C agg ) che corrisponde alla concentrazione dell analita, Infatti considerando la retta di regressione generica Y= mx+b avremo che m=k, X= Cagg, se Cagg= 0 avremo b=k Cx; mentre genericamente Y=S(egnale): S analita =k*c agg + k*cx; per S=0 avremo: k*cx=-k*c agg ovvero Cx=-C agg

24 CARATTERISTICHE DI UNA METODICA ANALITICA Le prestazioni di un metodo analitico possono essere definite attraverso una serie di grandezze: Accuratezza Precisione Specificità/selettività Intervallo di linearità Limite di rilevabilità (LOD) Limite di quantificazione (LOQ) Robustezza (Robustness) Solidità (Ruggedness) La definizione esatta di questi parametri, anche in funzione delle differenti tecniche analitiche utilizzate, è stata stabilita da varie istituzioni (es. IUPAC) nell ambito delle linee guida generali per la validazione di una metodica analitica. Esistono anche variabili più direttamente connesse all applicazione pratica del metodo, quali ad esempio la definizione dei costi e dei tempi richiesti per l analisi o lo studio della stabilità dei rettivi.

25 ACCURATEZZA L accuratezza è definita come la concordanza del risultato ottenuto in un analisi con il valore accettato come vero (valore di riferimento). Viene espressa attraverso l errore relativo (detto anche bias): x Errore relativo (bias) Un altro parametro comunemente utilizzato è il recupero: x Recupero x 100 L accuratezza (e la precisione) di un metodo analitico spesso variano in funzione della concentrazione dell analita. Per definire meglio le caratteristiche di un metodo queste grandezze vengono spesso determinate per tre concentrazioni diverse di analita ( bassa, media, alta ) comprese dell intervallo di analisi. Le caratteristiche di accuratezza e precisione minime richieste per un metodo analitico variano con l importanza relativa del componente da analizzare. Per componenti in tracce sono tollerate accuratezze e precisioni minori rispetto a quelle richieste per componenti presenti in grandi quantità. trovato trovato vero x x vero 100 vero

26 IL PROCESSO ANALITICO ATTENDIBILITA DEI RISULTATI La precisione e l accuratezza accettabili di un analisi dipendono anche dalla frazione di analita nel campione: per analiti presenti in tracce ed ultratracce sono tollerate accuratezze e precisioni molto minori rispetto a quelle accettate per i costituenti principali di un campione.

27 PRECISIONE La precisione esprime la riproducibilità dei risultati ottenuti da una serie di misure ripetute dello stesso campione. Viene espressa attraverso deviazione standard, deviazione standard relativa, coefficiente di variazione, ottenute effettuando analisi ripetute dello stesso campione. In un metodo analitico possono essere definiti svariati livelli di precisione. In particolare si può parlare di Ripetibilità (precisione intra-assay): è il parametro base per il calcolo della precisione di un metodo analitico. Viene definita come la riproducibilità di una serie di analisi effettuate in un breve periodo di tempo (replicati). Riproducibilità (precisione inter-assay): è la precisione di una serie di misure effettuate con lo stesso metodo analitico, ma in momenti differenti. La riproducibilità è in genere più elevata della ripetibilità, poiché è più difficile mantenere la costanza delle variabili sperimentali su di un lungo arco di tempo.

28 Segnale SENSIBILITA La sensibilità rappresenta una misura della capacità del metodo analitico di discriminare fra campioni con concentrazioni simili fra di loro. La sensibilità della calibrazione è la pendenza della curva di calibrazione ed esprime la variazione della risposta per unità di variazione della concentrazione dell analita. In funzione della forma della curva di calibrazione, un metodo analitico può avere sensibilità della calibrazione costante oppure no all interno dell intervallo di concentrazioni nel quale esso è applicabile. sensibilit à DS D D[A] A DS [A]

29 Segnale LIMITE DI RIVELABILITA E LIMITE DI QUANTIFICAZIONE Il limite di rivelabilità (LOD) di un metodo analitico è definito come la minima concentrazione di analita rivelabile ad un determinato livello di fiducia. In genere in corrispondenza del LOD la precisione del metodo analitico è relativamente bassa e non permette di ottenere dati quantitativi affidabili: il LOD viene quindi utilizzato a fini qualitativi, ad esempio come concentrazione limite per definire la presenza o l assenza dell analita. Per i metodi che ammettono una curva di calibrazione, il LOD viene definito come la concentrazione di analita che produce un segnale pari al segnale del bianco più k volte la sua deviazione standard: ksb LOD m Dove s b è la dev standard del segnale del bianco e m è la pendenza della curva (sensibilità). Il valore di k dipende dal livello di fiducia prescelto (es. per k = 3 il livello di fiducia è del 98,3%).Infatti: Il segnale di un analita (Y) al LOD sarà pari a 3 volte la dev. Standard del bianco + il segnale del bianco. D altra parte noi avremo che Y-S B = [analita]*m=ksb; e quindi ksb LOD m S B + ksb S B LOD [A]

30 LIMITE DI RIVELABILITA E LIMITE DI QUANTIFICAZIONE A fini quantitativi si usa il limite di quantificazione (LOQ), definito come la concentrazione alla quale l analita è determinabile con precisione ed accuratezza accettabili. Può essere espresso come il LOD, ma con valori di k più elevati (es. k = 10).

31 Segnale Segnale LIMITE DI RIVELABILITA E LIMITE DI QUANTIFICAZIONE (II) La definizione di limite di rivelabilità e limite di quantificazione può essere più complessa se il metodo non usa una curva di calibrazione o se è difficile definire il segnale del bianco. Ad esempio, nelle tecniche cromatografiche si può determinare la deviazione standard del segnale in un area del cromatogramma nella quale certamente non vi sono analiti ( bianco ), e considerare quindi significativi solo i segnali con un intensità pari al segnale medio in assenza di analita più k volte la sua deviazione standard. Sezione del cromatogramma priva di analiti ( bianco ) SB + ksb Segnale significativo Segnale non significativo SB Calcolo di SB ed sb Tempo Tempo

32 Segnale INTERVALLO DINAMICO DI LINEARITA L intervallo dinamico di linearità rappresenta l intervallo di concentrazioni dell analita che può essere determinato con una curva di calibrazione lineare. Nelle tecniche analitiche vengono preferite le curve di calibrazione lineari, poiché possono essere trattate in modo semplice e la loro costruzione richiede un numero limitato di standards. L intervallo dinamico di linearità è delimitato dal limite di rivelabilità e dalla concentrazione alla quale diventano rilevanti le deviazioni dalla linearità (dovute a comportamento non ideale del sistema o a limitazioni del rivelatore). L ampiezza dell intervallo dinamico di linearità dipende anche dalla tecnica di rivelazione utilizzata. Se le variazioni della concentrazione dell analita sono relativamente piccole non è comunque necessario un intervallo dinamico di linearità molto ampio. Se la curva di calibrazione non è lineare, si può definire semplicemente un intervallo dinamico, all interno del quale il segnale dipende dalla concentrazione dell analita. LOD [A] [A]max

33 Segnale SENSIBILITÀ, INTERVALLO DINAMICO DI LINEARITÀ E LOD Sensibilità, intervallo dinamico di linearità e limite di rivelazione sono spesso correlati fra di loro: a causa delle limitazioni insite nelle tecniche di misura e nei rivelatori una tecnica molto sensibile presenta spesso un limite di rivelazione inferiore (a parità di analita il segnale è più alto e quindi più facilmente misurabile con accuratezza) ma anche un intervallo dinamico di linearità più ristretto, poiché il segnale raggiunge valori troppo elevati a concentrazioni di analita inferiori. Sensibilità2 > Sensibilità1 2 1 LOD2 LOD1 [Amax]2 [Amax]1[A]

34 ROBUSTEZZA (ROBUSTNESS) La robustezza di un metodo analitico misura la sua capacità di non essere influenzato da piccole variazioni dei parametri sperimentali nell intorno dei loro valori ottimali. Un metodo analitico robusto fornisce quindi risultati riproducibili anche senza un controllo rigoroso delle condizioni sperimentali. Questo parametro può essere valutato variando deliberatamente le condizioni sperimentali in un ristretto intervallo e verificando se il risultato analitico risulta soggetto, oltre che alle fluttuazioni casuali, anche a variazioni sistematiche legate ai parametri modificati. SOLIDITA (RUGGEDNESS) La solidità è una valutazione del grado di riproducibilità del metodo analitico, espressa attraverso il rapporto fra la deviazione standard ottenuta da studi di riproducibilità e la deviazione standard ottenuta da studi di ripetibilità. In modo simile alla grandezza precedente, descrive la suscettibilità del metodo alle variazioni incontrollate dei parametri sperimentali. Per un metodo analitico la deviazione standard ottenuta da studi di riproducibilità dovrebbe essere al massimo 2-3 volte maggiore di quella ottenuta da studi di ripetibilità.

35 SPECIFICITA La specificità è la capacità di un metodo analitico di rispondere soltanto all analita in esame anche in presenza degli altri componenti del campione. Pochi metodi in realtà sono realmente specifici, soprattutto in presenza di altri composti con caratteristiche chimico-fisiche simili a quelle dell analita (da questo punto di vista le tecniche bioanalitiche, basate su anticorpi od enzimi, danno maggiori garanzie). In generale i metodi analitici mostrano soltanto un certo grado di preferenza (selettività) per la sostanza che interessa nei confronti della altre specie presenti. La selettività di un metodo nei confronti di un possibile interferente può essere definita come il rapporto fra le concentrazioni di interferente [X] ed analita [A] che danno lo stesso segnale:

36 VALIDAZIONE DI UNA METODICA ANALITICA Con questo termine si intende la valutazione complessiva dell affidabilità di una metodica analitica. Tale procedura si può effettuare mediante: Uso di campioni standard di riferimento Essi permettono di verificare l affidabilità di tutti gli stadi della procedura, inclusi quelli pre-analitici. I campioni standard di riferimento devono comunque essere molto simili ai campioni da analizzare per quanto riguarda la concentrazione dell analita e la composizione totale. In alternativa, in assenza di tali materiali, è possibile sintetizzare standard combinando composti puri in modo da riprodurre la composizione dei campioni (tecnica adatta solo per campioni di composizione relativamente semplice), o utilizzare soluzioni di analita a concentrazione nota di composizione simile a quella delle soluzioni che verranno analizzate realmente (questo non permette però di avere informazioni sull accuratezza dei processi di decomposizione e dissoluzione) Aggiunta standard al campione Vengono analizzate aliquote di campioni alle quali sono state aggiunte quantità note di analita, e viene valutato il recupero della procedura nei confronti della quantità nota addizionata.

37 Metodo in esame VALIDAZIONE DI UNA METODICA ANALITICA Utilizzo parallelo di altri metodi Un metodo analitico può essere validato mediante l analisi simultanea degli stessi campioni con un secondo metodo di riferimento (cioè di cui è gia stata dimostrata l accuratezza), possibilmente basato su principi differenti da quelli del metodo in esame. Questo confronto si effettua spesso mediante i diagrammi di correlazione: I due metodi danno lo stesso risultato Il metodo in esame presenta una sovrastima sistematica Metodo valido Sottostima sistematica Il metodo in esame presenta una sottostima sistematica Metodo di riferimento Sovrastima costante

38 CONTROLLO DI QUALITÀ Una carta di controllo permette di tenere sotto controllo le prestazioni di una metodica analitica nel tempo, in modo da individuare il verificarsi di errori sistematici. Una tipica carta di controllo prevede l analisi, ad intervalli regolari, di N replicati di uno o più campioni di controllo, per i quali sono stati determinati in precedenza s e m. Qualunque deviazione del risultato oltre i limiti di controllo superiore (LCS) od inferiore (LCI) viene considerata indicativa di un errore nella procedura, che deve essere individuato e corretto. Possibile errore sistematico LCS m 3s N m LCI m 3s N tempo

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40 LA PESATA Molti procedimenti analitici partono dall acquisizione accurata della massa di uno o più campioni o di campioni di riferimento. Nella procedura di pesata la quantità di sostanza da prelevare dipende da numerosi fattori. Il più importante di questi è la sensibilità della bilancia. Con le bilance analitiche normali, la cui sensibilità è ± 0,2 mg, se si vuole che l'errore di pesata non sia maggiore dello 0,1 % si devono eseguire pesate di quantità che non siano inferiori a 0,2 g. Con le bilance più sensibili, di sensibilità ± 0,02 mg (cosiddette semi-microanalitiche) si potranno pesare, con lo stesso errore, 20 mg e con le microbilance, di sensibilità ± 0,002 mg, 2 mg. D'altra parte un prelievo troppo abbondante, che eliminerebbe praticamente ogni errore di pesata, porterebbe altri inconvenienti, quale quello di dover eseguire la precipitazione su grandi volumi di liquido, la filtrazione su filtri troppo grandi e la calcinazione su crogioli il cui peso non sarebbe più adatto alle bilance analitiche (la portata delle bilance è generalmente di 100 g, ma non è opportuno caricarle fino al limite massimo). Perciò si fa generalmente il prelievo minore possibile, compatibile con la precisione della propria bilancia e con le apparecchiature di cui si dispone. Solitamente la scelta migliore è quella di pesare esattamente una quantità dell'ordine di quella prescelta, ma non precedentemente fissata.

41 LA BILANCIA La bilancia analitica è lo strumento essenziale per ogni laboratorio chimico poiché tutte le misure di peso direttamente e quelle di volume indirettamente, vengono effettuate per mezzo di essa. È perciò molto importante saperla usare in modo appropriato sì da ottenere ogni pesata con la massima velocità ed esattezza possibile. Bilancia ad oscillazione a piatti Bilancia a smorzamento ad aria

42 COSTITUZIONE DI UNA BILANCIA ANALITICA Una bilancia analitica può venire considerata come una semplice leva a due bracci di eguale lunghezza, libera di oscillare su di un fulcro (coltello) posto al centro. L'oggetto da pesare viene sospeso da una parte della leva e pesi di massa nota vengono sospesi all'altra estremità della leva. I punti di sospensione dell'oggetto e dei pesi sono equidistanti dal fulcro. Quando la massa di un oggetto è uguale alla massa dei pesi, la leva che è costituita dal giogo della bilancia, rimane in posizione orizzontale. Un lungo puntale o indice (F), collegato al centro del giogo, indica lo spostamento del giogo dalla posizione orizzontale. La bilancia analitica ha una sensibilità a variazioni di massa dell'ordine di 0,1 mg (0,0001 g). E' di solito racchiusa in una apposita custodia di legno e vetro, con finestre che si aprono lateralmente e davanti uno sportello di vetro che si può alzare e abbassare. Non è mai collocata nella stanza dove si eseguono le analisi, ma in ambienti vicini e isolati e su piani resistenti livellati. La messa a livello viene eseguita mediante una livella a bolla posta sul piano della bilancia agendo su viti situate ai piedi della bilancia. Solitamente all'interno della bilancia, dietro i piatti, vengono posti recipienti contenenti sostanze disidratanti come CaCl 2 o gel di silice. I pesi sono contenuti in una opportuna scatola (pesiera) e con una pinzetta vengono posti sui piatti. I pesi variano in dipendenza della portata e della sensibilità della bilancia a cui sono destinati.

43 PESATA CON BILANCIA A SMORZAMENTO CON DUE PIATTI Si controlla preliminarmente che non vi siano oggetti o pesi sui piatti, che la manopola dei decigrammi e centigrammi stia sulla posizione di zero e quindi che il punto di zero sia esatto. A tale scopo si sblocca la bilancia con l'apposita manopola, si attende una leggera oscillazione e si osserva il punto di zero regolando eventualmente la scala con una apposita levetta di correzione posta al di sotto della bilancia vicino alla manopola di sblocco del giogo. Si pone quindi l'oggetto da pesare sul piatto di sinistra mentre sul piatto di destra si pongono i pesi operando per tentativi tenendo presente di iniziare sempre dai pesi più alti scendendo via via. Queste operazioni verranno effettuate utilizzando gli sportellini laterali di destra e di sinistra. Non si deve sbloccare durante i tentativi completamente il giogo e si passerà da un peso all'altro osservando le oscillazioni dell'indice, se va nella scala a sinistra pesa di più il piatto destro e viceversa. Quando si è arrivati ad una posizione di equilibrio a ± 1 g, (ricordare che il carico massimo delle cifre decimali è 0,990) si può iniziare la ricerca delle cifre decimali operando con l'apposita manopola esterna fino che l'ago della bilancia entri nella scala dalla parte destra, cioè positiva, e si fermi quindi nella nuova posizione di equilibrio. Il valore finale sarà indicato dalla somma del peso posto sul piatto, dal valore della manopola e dalla lettura dell ago. PESATA CON BILANCIA A SMORZAMENTO AD UN PIATTO Le operazioni preliminari sono identiche a quanto già descritto per la bilancia a due piatti. Si introdurrà l'oggetto da un apposito sportellino posto a destra e quindi agendo con le manopole esterne si troverà per tentativi il peso esatto. E' opportuno durante questi tentativi non sbloccare completamente la bilancia e per passare da un peso all'altro osservare la scala luminosa: se il peso caricato è eccessivo oppure inferiore la scala, a seconda del tipo di bilancia, si alzerà o si abbasserà nel quadrante; bisognerà quindi passare al peso più piccolo oppure lasciare il peso caricato e agire sulla manopola successiva. Quando la bilancia raggiungerà il nuovo punto di equilibrio si leggerà direttamente il peso sulla scala frontale.

44 Bilance analitiche moderne: Le bilance analitiche sono strumenti esatti e precisi utilizzati per misurare le masse. Richiedono una posizione ampia e libera su un banco solido che è esente dalle vibrazioni. Alcune bilance moderne hanno masse di precisione incorporate per effettuare la calibrazione. Le bilance più vecchie dovrebbero essere calibrate periodicamente con una massa standard. Qui sono riportate alcune precauzioni da seguire ogni volta che state usando una bilancia elettronica. Non si urti o non disponga oggetti sul banco dopo l'azzeramento della bilancia. Si pongano le polveri su carta o sui piatti. Si Maneggi gli oggetti con le tenaglie, le pinzette, i guanti, o la carta evitare di lasciare le impronte digitali e quindi sostanza grassa sul piatto di pesata o sulla carta. Si facciano equilibrare a T.A. gli oggetti caldi o freddi prima pesarli. Si pesino velocemente i materiali igroscopici poiché assorbiranno l'acqua durante la pesata. Si usi sempre la stessa procedura. Non si estraggano e non lascino i prodotti chimici rovesciati su o intorno alla bilancia Si segnali alla manutenzione l eventuale caduta di liquidi o solidi in modo da potere pulire efficacemente e se necessario ricalibrare la bilancia. Bilancia anlaitica Mettler AJ100 : Prima di accendere, assicurarsi che i portelli siano chiusi ed il piatto non tocchi l anello esterno Accendere premendo sulla barra Si prema nuovamente la barra se la lettura digitale non mostra g. Si disponga l'oggetto da pesare nel centro del piatto e si chiuda il portello. Si attenda la stabilizzazione del Display; il simbolo (g) comparirà dopo il numero. Si trascriva il risultato e si rimuova l'oggetto dal piatto, si richiudano tutti i portelli e se necessario si ri-azzeri la bilancia.

45 Errori di pesata. Una pesata può essere influenzata da numerosi errori, i più comuni dei quali sono l ineguaglianza della lunghezza dei bracci della bilancia, il differente effetto della spinta dell'aria sull'oggetto e sui pesi, eventuali variazioni nei pesi dei recipienti e della sostanza durante le pesate e l alterazione nel valore dei pesi. Ineguaglianza della lunghezza dei bracci : Tale errore è talvolta presente nelle tradizionali bilance a due bracci uguali, ma può essere ovviato ricorrendo alla pesata con il metodo della tara. Questo problema ovviamente non si verifica nelle bilance a singolo braccio e in quelle elettroniche. Spinta dell aria : Nel caso di oggetti di densità notevolmente differente da quella dei pesi è da tenere conto dell'errore dovuto alla spinta dell'aria. Nelle bilance elettroniche non sono usati pesi campione pertanto l effetto della spinta dell aria grava solo sul corpo da pesare e non è controbilanciata un nessun modo dai pesi. E' noto che in base al principio di Archimede, un corpo immerso in un fluido riceve una spinta diretta dal basso verso l'alto eguale alla massa di fluido spostato per cui il peso di questo risulta diminuito di un valore corrispondente a quello del fluido spostato, quindi nel vuoto un oggetto ha un peso maggiore che in aria. Pertanto il peso reale di un oggetto può venire ricavato dal valore sperimentale apportando una correzione per la spinta dell'aria.

46 Effetto della temperatura : Variazioni della temperatura possono influenzare in modo notevole una pesata. La densità dell'aria in primo luogo e la densità dei corpi e dei pesi varia con la temperatura così che la spinta dell'aria risulta differente. Questo effetto non è però così importante come quello che si osserva quando l'oggetto da pesare non è alla stessa temperatura della bilancia o dell'ambiente: si possono avere delle correnti d'aria che possono completamente falsare le condizioni di equilibrio. E' questa la ragione per cui si raccomanda di accertarsi che l oggetto da pesare sia alla stessa temperatura della stanza delle bilance. Calibrazione dei pesi e taratura (per bilance elettroniche): Uno degli errori di maggiore entità in una pesata è causato dall'impiego di pesi non calibrati. Questo inconveniente non può comunque essere eliminato.

47 Come diminuire gli errori di pesata in pratica Prendendo alcune precauzioni, è possibile ridurre al minimo gli errori della pesata. È buona norma non toccare mai con le mani un contenitore da pesare, dal momento che le impronte digitali ne modificherebbero la massa. Prima della pesata, un campione deve essere sempre tenuto a temperatura ambiente, per evitare errori dovuti alle correnti d'aria di convezione. Per far raffreddare un campione che è stato essiccato in una stufa. è necessario lasciarlo per mezz'ora circa o più in un essiccatore a temperatura ambiente. Per le bilance meccaniche il piatto della bilancia dovrebbe essere in posizione di arresto quando si aggiunge il campione, e di semi-arresto quando si selezionano i pesi: ciò permette di evitare gli strattoni che logorerebbero i fili dei coltelli che servono da fulcro e da punto di appoggio. I portelli di vetro della bilancia analitica devono rimanere chiusi durante le letture a protezione dalle oscillazioni causate dalle correnti d'aria. Spesso una bilancia sensibile è posta su una base pesante, come una grossa lastra di marmo, per minimizzare l'effetto delle vibrazioni del locale sulla lettura. Le bilance devono essere mantenute in piano. Dei piedini regolabili e un indicatore a bolla sulla parte superiore consentono di mantenere la bilancia in posizione orizzontale. Infatti altrimenti si misurerebbe una componente della forza peso e quindi verrebbe falsato il principio della pesata. (paragone tra due masse su cui agiscono identiche forze)

48 Come pesare una sostanza con una bilancia elettronica in pratica 1- Portare vicino alla bilancia : - barattolo della sostanza da pesare - o recipiente per pesata (pesafiltri, becher ) - recipiente di raccolta per la sostanza pesata (se il recipiente è un matraccio è necessario portare anche un imbuto asciutto) - spatola 2- Porre il recipiente per pesata sul piatto della bilancia 3- Chiudere lo sportello e lasciare stabilizzare 4- Azzerare 5- Aprire lo sportello e aggiungere sul recipiente per pesata circa la quantità di sostanza desiderata. 6- Chiudere lo sportello, lasciare stabilizzare e registrare la pesata (pesata A) 7- Versare il contenuto del recipiente per pesata nel recipiente di raccolta 8- Porre il recipiente per pesata sul piatto della bilancia 9- Chiudere lo sportello, lasciare stabilizzare e registrare la pesata (pesata B) 10- Togliere il recipiente per pesata dalla bilancia, pulire e lasciare la bilancia spenta 11- La quantità della sostanza aggiunta nel recipiente di raccolta sarà pari a : pesata A - pesata B

49 Recipienti e loro pulizia. Recipienti di vetro - Il materiale più comunemente impiegato nelle varie attrezzature di laboratorio è il vetro. Il vetro impiegato deve rispondere a particolari requisiti di resistenza agli agenti chimici, agli sbalzi termici e alle sollecitazioni meccaniche. Il comune vetro, a base di silicati alcalini e alcalinoterrosi, non possiede questa proprietà e vengono pertanto di solito impiegati vetri speciali costituiti da miscele ad alto contenuto in silice ( 80%) e anidride borica ( 10-12%) (vetri borosilicei) e percentuale minime di alcali ( 5%) e ossidi bivalenti e allumina. Le composizioni più note sono quelle murano (Ignis), Pyrex e Jena. Il coefficiente di espansione del pirex, che è un vetro borosiliceo (3.2 x 10-8 ), è notevolmente inferiore a quello del vetro comune (9 x 10-6 ) e pertanto oltre a sopportare notevoli sollecitazioni termiche, può essere utilizzato per la costruzione di vetrerie di maggiore spessore e quindi meccanicamente più resistenti. Per quanto riguarda la resistenza agli agenti chimici, si deve tenere presente che, anche queste particolari composizioni di vetro sono attaccate dall'acqua e dalle soluzioni specialmente se alcaline e a caldo. L entità dell'attacco dipende dalla composizione del vetro, dalla natura della soluzione e dal tempo di contatto. Il vetro viene invece attaccato poco da soluzioni acide (eccetto l'acido fluoridrico).

50 Recipienti di porcellana - La porcellana di buona qualità è più resistente del vetro sia all'attacco degli agenti chimici (specialmente alcali) che per le sollecitazioni meccaniche e per gli sbalzi di temperatura. Viene impiegata essenzialmente per la fabbricazione di capsule e crogioli. Recipienti di materie plastiche (bachelite, resine a base di polivinile) sono impiegate per la fabbricazione di becher, bacchette, tubi ecc. usati per soluzioni a temperatura ambiente. Trovano impiego quando è richiesta la resistenza all acido fluoridrico e alla rottura. Sono usati quando è necessario evitare la contaminazione da parte dei costituenti il vetro.

51 RECIPIENTI DI MISURA DELL'ANALISI QUANTITATIVA La misura accurata del volume è di fondamentale importanza nell'analisi volumetrica. Allo scopo si usano matracci, pipette e burette "tarati", ossia recipienti di vetro che portano dei particolari contrassegni per indicare esattamente un dato volume di liquido. Matracci Sono palloni di vetro a pareti sottili e a fondo piatto, con collo lungo e stretto sul quale è inciso un segno anulare corrispondente al volume nominale del recipiente. Sono provvisti di tappi di vetro smerigliato o di plastica a perfetta tenuta. In commercio sono reperibili matracci di differente volume

52 Pipette tarate Sono tubi di vetro che portano al centro un rigonfiamento cilindrico su cui è segnato il volume di liquido che è in grado di contenere quando il liquido raggiunge il segno anulare inciso sul gambo superiore (fig. a e b). Le pipette servono per il prelievo di volumi noti di liquido; vi sono pipette da 1 fino a 100 ml. Il riempimento delle pipette si effettua per aspirazione attraverso le apposite pompette di gomma. Lo svuotamento delle pipette avviene per scorrimento libero completo del liquido partendo dal segno superiore. Se la pipetta reca solo il segno nel gambo superiore (fig. b), il volume s'intende preciso quando il liquido è fatto defluire fino all'ultima goccia che può liberamente cadere dalla punta affilata della pipetta. Le pipette che portano due segni (fig. a), uno sul gambo superiore e uno su quello inferiore, sono più precise e pertanto sono consigliate. Queste sono svuotate allo stesso modo lasciando defluire liberamente il liquido che si trova fra i due segni.

53 Pipette graduate Sono tubi di vetro affilati ad un estremità e graduati in ml e frazioni di ml (fig.5c). Risultano particolarmente adatte per misurare con rapidità volumi di liquido variabili (da 0,01 a 25 ml.). Per il riempimento e lo svuotamento di queste pipette valgono gli stessi criteri esposti per le pipette tarate. E importante ricordare che se il volume di liquido da prelevare è inferiore al contenuto totale della pipetta, è opportuno che questa sia comunque riempita (azzerata).

54 Burette Sono tubi di vetro con diametro interno uniforme di mm., di varia capacità; quelle più comunemente impiegate hanno un volume da 5 a 100 ml con graduazione in decimi di millilitro. L'estremità inferiore è affilata e collegata ad un rubinetto di vetro (fig.6). Particolare importanza riveste la velocità di svuotamento: se è troppo rapida, lo scolamento lungo le pareti non è completo se invece è troppo lenta la titolazione diviene troppo laboriosa. La velocità del flusso è regolata mediante rubinetto opportunamente ingrassato con grasso di buona qualità.

55 Norme pratiche per l'uso dei matracci, delle pipette e delle burette. a) Matracci. Il riempimento di un matraccio tarato va eseguito versando il liquido in getto continuo fino a raggiungere la base del collo, a questo punto si rallenta l'immissione, e in vicinanza del segno il liquido deve essere introdotto goccia a goccia fino a che il suo menisco inferiore combacia col segno stesso. Per osservare bene questo livello bisogna mettersi con l'occhio alla stessa altezza del menisco, se si vuole sollevare il recipiente, questo deve essere preso con due dita all'estremità del collo, e mai toccato alla base con la mano altrimenti il calore della mano si trasmetterebbe al liquido con conseguente aumento di volume. Se, nel portare a volume, si è sorpassato il segno, conviene fare evaporare un po di solvente, ponendo il matraccio su bagno Maria fino a che, dopo raffreddamento alla temperatura ambiente, si vede che il menisco è sceso sotto il segno. Con maggiore precauzione di prima si riporta adesso al volume esatto. Dopo aver riempito il matraccio, si chiude col suo tappo e si agita capovolgendolo e raddrizzandolo più volte, in modo da rendere perfettamente omogenea la soluzione.

56 Norme pratiche per l'uso dei matracci, delle pipette e delle burette. b) Pipette. Se la pipetta non è asciutta è necessario, prima di riempirla, avvinarla usando una piccola quantità del liquido che si vuol prelevare avendo cura che questo sia messo a contatto con tutta la pipetta prima di essere gettato. Il processo di avvinamento va ripetuto almeno tre volte. Il riempimento della pipetta si effettua immergendo la punta della pipetta nel liquido e aspirando lentamente con l apposita pompetta di gomma, fino a che il menisco abbia oltrepassato il segno superiore. La pipetta deve essere sempre tenuta in posizione verticale per evitare l ingresso di bolle d aria. Si apre la valvola di scarico della pompetta e si fa scendere in modo lento e uniforme il liquido fino a coincidenza col segno. La pipetta deve ora essere piena di liquido dalla punta fino al segno superiore, e non dovranno esistere bolle d'aria. Per lo svuotamento, si asciuga rapidamente l'esterno della punta della pipetta con una striscia di carta da filtro e la si porta a contatto della parete del recipiente dove il liquido deve essere introdotto, tenendo sempre la pipetta in posizione verticale. Premendo la valvola di scarico della pompetta, si fa scendere il liquido lungo la parete del recipiente fino, se presente, il segno sul gambo inferiore della pipetta, oppure, fino a svuotamento completo nel caso di pipette a volume con un solo segno. Al termine dello svuotamento si aspetta 15 secondi prima di ritirare la pipetta strisciando la punta lungo la parete del recipiente.

57 Norme pratiche per l'uso dei matracci, delle pipette e delle burette. c) Burette. - Prima di riempire una buretta, occorre assicurarsi che questa sia ben pulita e sgrassata, e che il rubinetto sia a perfetta tenuta, e possa essere agevolmente manovrato. Il rubinetto, soprattutto se di vetro, deve essere lubrificato con una traccia di grasso da rubinetto di buona qualità e girato più volte, fino a che non si vedono più striature sulla parte smerigliata. Il canale del rubinetto deve inoltre restare privo di grasso. Prima di riempire la buretta è necessario che questa sia accuratamente avvinata prelevando, con l ausilio di un piccolo imbuto, porzioni di non più di 10 ml di liquido. Si fissa quindi la buretta nell'apposito sostegno servendosi di pinze per burette le quali lasciano libero tutto il tratto graduato. Si riempie, sempre con 1'aiuto di un piccolo imbuto, la buretta fino a 2-3 ml. sopra lo zero, si toglie l'imbuto e si apre un poco il rubinetto in modo che il liquido riempia tutta la buretta fino alla punta. Se nell'ultimo tratto al di sotto del rubinetto si fossero formate bolle d'aria (fig.7a), queste deve essere eliminate facendo scorrere più velocemente il liquido e aiutandone il distacco con piccoli colpi. Si aggiusta, infine il volume del liquido, aggiungendolo o togliendolo in modo che il suo menisco coincida con la divisione zero.

58 Norme pratiche per l'uso dei matracci, delle pipette e delle burette. Lettura delle burette. La prima condizione per una buona lettura è mettersi con l'occhio all'altezza del menisco, come quando si porta a volume in un matraccio tarato o si fa un prelevamento con una pipetta. Per avere una lettura agevole le burette presentano lungo la parete interna, dalla parte opposta alle divisioni, una striscia azzurra su fondo di vetro latteo. Quando l'occhio si trova sullo stesso piano del menisco, si vede che la striscia è rotta, per effetto della rifrazione, in due punte combacianti: il tratto di divisione che coincide con l'incontro delle punte, indica il valore giusto (fig.7b). Quando è difficile osservare questo menisco, come nel caso di liquidi troppo colorati, si prende come livello di riferimento il menisco superiore.

59 Norme pratiche per l'uso dei matracci, delle pipette e delle burette. Uso delle burette nelle titolazioni E opportuno seguire alcune semplici regole: 1) Ogni titolazione deve essere iniziata con la buretta piena di liquido e perfettamente azzerata. 2) Durante la titolazione il rubinetto della buretta è controllato con la mano sinistra, la mano destra impugna la beuta come mostra la figura.

60 Norme pratiche per l'uso dei matracci, delle pipette e delle burette. Uso delle burette nelle titolazioni La soluzione all interno della beuta è agitata con un movimento circolare dalla mano destra. Il liquido deve essere fatto defluire goccia a goccia e con velocità uniforme. Quanto più rapido è lo svuotamento e tanto più tempo bisogna aspettare alla fine, affinché il liquido che bagna la parete della buretta termini di discendere e quindi il menisco si arresti ad un livello costante. 3) All'inizio e alla fine di una titolazione o di un prelevamento di liquido con la buretta, la punta di questa non deve portare alcuna goccia sospesa. Pertanto prima di controllare il volume finale, l'eventuale goccia sospesa deve essere raccolta facendola aderire alla parete del recipiente dove si è versato il liquido, e mai lavando la punta con una spruzzetta. 4) La scelta del tipo di buretta dipende dalla soluzione con la quale deve essere riempito. Ad esempio per alcune soluzioni non completamente stabili alla luce (come le soluzioni di I 2, di AgNO 3 ecc.) è consigliabile l'uso di burette costruite con vetro bruno. 5) Al termine di una titolazione o di una serie di titolazioni, la buretta deve essere vuotata completamente, lavata a fondo con acqua distillata e posta ad asciugare col rubinetto aperto.