Le proteine-g: trasduttori di segnale Esiste una famiglia assai numerosa di proteine, le proteine-g (G perché legano GTP oppure GDP), che svolgono

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1 Le proteine-g: trasduttori di segnale Esiste una famiglia assai numerosa di proteine, le proteine-g (G perché legano GTP oppure GDP), che svolgono una funzione trasduttiva. Tale funzione apparve una novità nel campo delle proteine. In effetti la trasduzione (da non confondere con traduzione) è un processo biologico che, paradossalmente, potrebbe apparire non-necessario. Infatti una proteina-g trasferisce un cambio di conformazione: da una proteina che riceve un segnale (per esempio un recettore β-adrenergico inserito nella membrana plasmatica di una cellula che avverte la presenza dell ormone, legandosi ad esso quando la concentrazione dell ormone aumenta, in ossequio alla legge di azione di massa), alla proteina enzimatica che, grazie a questo cambio di conformazione che riceve dalla proteina- G, cambia essa stessa conformazione e si attiva: per esempio la ben nota adenilato ciclasi, che sintetizza AMPciclico. In definitiva la proteina-g trasferisce un cambio di conformazione, nell esempio classico ora citato, da una macromolecola recettore alla macromolecola enzimatica. Per assurdo, potremmo porci la seguente domanda: Questo cambio di conformazione non potrebbe avvenire direttamente, senza richiedere l interposizione della proteina-g? In realtà l interposta proteina-g svolge diversi compiti importanti: amplifica il segnale, partecipando ad un processo a cascata. Quindi un recettore può interagire con molte proteine-g, che a loro volta possono interagire (nell esempio sopra citato) con molte macromolecole di adenilato ciclasi. assicura la transitorietà del segnale stesso. Infatti la proteina-g idrolizza il GTP ad essa legato, che diventa GDP, e la proteina-g diventa inattiva nella sua capacità trasduttiva (non usiamo il termine trasduzionale, perché esso, di norma, indica la sintesi proteica); può rendere adattabile ad altri segnali lo stesso processo trasduttivo: infatti molte proteine-g possono attivarsi o disattivarsi in seguito all azione di altre entità molecolari. Abbiamo già visto che la proteina SOS attiva la proteina RAS, che è una proteina-g. Scoperta delle proteine-g (da Le Scienze, sett. 92, pag.40) Visto che le proteine-g svolgono una funzione che, a prima vista, sembrerebbe non-essenziale, risulta interessante comprendere come e quando furono scoperte. Intorno al 1975 risultò cruciale (per arrivare alla scoperta delle proteine-g) la disponibilità di cellule mutanti, che non sintetizzano AMPcicl, che per tale proprietà sono state siglate cyc -. Si riteneva, erroneamente (e vediamo ora perché), che non sintetizzassero AMP-cicl in quanto prive dell enzima adenilato ciclasi. Elliot M. Ross, che lavorava nel laboratorio di Alfred G. Gilman (il padre delle proteine-g), condusse alcuni esperimenti classici con l obiettivo di dimostrare l effettiva assenza di adenilato ciclasi nelle cellule cyc -. Ross si proponeva di aggiungere l enzima ritenuto mancante alle cellule cyc - (l adenilato ciclasi) per verificare la ripristinata capacità a sintetizzare AMPcicl. Si tenga presente che l adenilato ciclasi è un enzima di membrana (vedi pag.171), e in quegli anni non erano ancora state messe a punto in maniera soddisfacente le tecniche sofisticate di laboratorio per la purificazione di proteine di membrana. Pertanto Ross non aveva la disponibilità di adenilato ciclasi pura, che avrebbe consentito l esecuzione del seguente esperimento pulito : aggiunta diretta e della sola adenilato ciclasi alle cellule cyc -, con verifica della riacquistata capacità sintetica per l AMPcicl. Pertanto, non essendo disponibile l adenilato ciclasi pura, Ross esegui un esperimento (che denominiamo Prova, vedi figura della pagina seguente), aggiungendo alle cellule cyc - altre membrane ottenute da cellule normali che, in quanto tali, contengono l adenilato ciclasi che, di norma, è presente. L esperimento riuscì, ma non poteva essere considerato conclusivo: infatti, le cellule cyc acquistarono la capacità sintetica per l AMPcicl, ma occorre tener presente che aggiungendo membrane di cellule normali era stato introdotto, di fatto, tutto il patrimonio di proteine presenti nella membrana, quindi il ripristino della capacità sintetica per l AMPcicl poteva anche dipendere da altre proteine, diverse dall adenilato ciclasi. 288

2 L inadeguatezza del preparato aggiunto (membrane di cellule normali) era ben nota a Ross, che eseguì parallelamente anche un esperimento Controllo che, nelle intenzioni di Ross, avrebbe dovuto essere negativo. Per eseguire l esperimento Controllo indusse preventivamente l inattivazione dell enzima adenilato ciclasi (mediante trattamenti chimici specifici) in un campione di membrane ottenute da cellule normali, che aggiunse poi alle cellule cyc -. In tale esperimento di controllo era previsto il non-ripristino della capacità sintetizzante per AMPcicl, congruente con la ipotizzata aggiunta di adenilato ciclasi alla Prova. Con gran sorpresa di Ross anche C produsse AMPcicl. CONCLUSIONE DELL ESPERIMENTO DI ROSS: le cellule cyc - non sintetizzano AMPcicl non per l assenza dell adenilato ciclasi, ma perché tali cellule cyc - risultano effettivamente mancanti di un componente, che allora era incognito. Tale componente andava ricercato (presumibilmente) tra le proteine di membrana presenti normalmente nelle cellule in grado di sintetizzare l AMPcicl. Quindi con l esperimento Prova era stata ottenuta la produzione di AMPcicl perché l aggiunta di membrane ottenute da cellule normali alle cellule cyc - forniva alle cellule cyc - un componente di cui le cellule cyc - erano effettivamente prive, ma che non era (come inizialmente ipotizzato), l adenilato ciclasi. Esperimenti successivi portarono alla dimostrazione che le cellule cyc - erano, in realtà, deficienti di una proteina allora ignota, una proteina-g. Nello schema seguente sono illustrate in forma schematica le prove di laboratorio di Ross: Esperimento Prova Esperimento Controllo Schema degli esperimenti di Elliot M. Ross. Nella Prova alle cellule cyc - era aggiunta (senza esserne a conoscenza) la proteina-g, di cui le cellule cyc - erano prive. Si riteneva di aver rimpiazzato la adenilato ciclasi. Le membrane ricostruite producevano AMP-cicl per aggiunta di adrenalina. Nel Controllo era inattivata l adenilato ciclasi nelle membrane aggiunte ma, di fatto, era aggiunta la proteina-g in cyc -, componente di cui le cellule cyc - erano realmente mancanti. Per dimostrare l effettiva mancanza dell Adenilato Ciclasi il Controllo non avrebbe dovuto produrre AMP-cicl per aggiunta di adrenalina alle membrane ricostruite. 289

3 Negli anni due ricercatori del gruppo di Gilman riuscirono a dimostrare l effettiva esistenza della proteina-g, che svolgeva un ruolo essenziale nel trasferimento dell attivazione innescata dall adrenalina. Per individuarla risultò cruciale la sua proprietà di attivarsi in presenza di GTP. La superfamiglia delle proteine-g Le proteine-g furono studiate dal gruppo di Gilman. Erano caratterizzate dal possedere una struttura eterotrimerica, essendo formate da tre diverse subunità: α, β e γ. La subunità più caratterizzante è la α, che scambia il GDP con GTP e che è in grado di idrolizzarlo a GDP. La struttura eterotrimerica è propria della proteina-g che lega GDP. Quando lega GTP, le subunità β e γ si dissociano dalla α, che nella forma attiva interagisce con le molecole bersaglio, per esempio l Adenilato Ciclasi. Contemporaneamente alle scoperte del gruppo di Gilman, intorno alla metà degli anni 80, furono scoperti i meccanismi della fotorecezione nella retina dei vertebrati (vedi inserto di pag.292). In breve si scoprì che il GMPciclico teneva aperti i canali per il sodio nei segmenti esterni dei bastoncelli. La luce (anche un singolo fotone) colpisce la molecola cromoforo retinale, che è inserita nella macromolecola recettoriale rodopsina. Il retinale cambia configurazione: da 11-cis diventa alltrans e si verifica un cambio conformazionale del recettore stesso. Per inciso la rodopsina ha una buona omologia strutturale con i recettori β- adrenergici. Quindi esiste un buon parallelismo tra segnale scatenato dall adrenalina e segnale scatenato dalla luce. Nei fotorecettori il cambiamento conformazionale della rodopsina induce un cambio di conformazione in una molecole trasduttrice del segnale specifica dei fotorecettori, denominata trasducina, che è una importante proteina-g. Infatti questa si attiva legando GTP (attenzione: il ruolo svolto dal GTP nella trasducina è del tutto indipendente dal ruolo svolto dal GMP-ciclico sui canali; ambedue le macromolecole -trasducina e canali sensibili al GMPciclico- sono dipendenti ambedue in forma casuale da nucleotidi della base purinica azotata Guanina). La trasducina, nella forma attiva, trasmette un cambio di conformazione (attivandolo) all enzima fosfodiesterasi del GMP-ciclico, che idrolizza il GMP-cicl, rimuovendolo dal segmento esterno. I canali per il sodio si chiudono (restano aperti solo se è presente GMPcicl), determinando un segnale elettrico (iperpolarizzazione).la scoperta della trasducina si rivelò della massima importanza per lo studio delle proteine-g in generale. Il motivo è semplice. Le membrane dei segmenti esterni dei bastoncelli contengono grandi quantità di trasducina, direttamente evidenziabile con una semplice elettroforesi, mentre in altre cellule le proteine-g sono presenti a livelli di gran lunga inferiori. Molti studi sulle proteine-g in generale furono pertanto condotti sulla trasducina. Oltre all importantissima trasducina esistono altre proteine-g. In realtà sottrae la subunità γ dalla PDE (fosfodiesterasi), che si attiva idrolizzando velocemente il GMPciclico. 290

4 Furono infatti scoperte le proteine-g cosiddette monomeriche, che appartengono ad una famiglia numerosa. Ne vedremo alcune. La prototipo è la RAS-p21, formata da una unica subunità di peso molecolare Da. Di essa abbiamo già parlato, essendo attivata (incorporando GTP) per azione della proteina SOS. Altre proteine-g monomeriche sono le Rho, le Rab, le Arf, le Ran. Ciascuna di esse forma una subfamiglia. Per esempio H-Ras. K-Ras e N-Ras appartengono alla subfamiglia Ras. Occorre ricordare che una proteina-g era nota ancor prima delle scoperte di Gilman e collaboratori, solo che possedeva una funzione assai specializzata. Si tratta del Fattore di allungamento Tu (EF-Tu), che partecipa alla sintesi proteica ribosomiale. Ricordiamo brevemente che EF-Tu si attiva legando GTP che sposta il GDP, legato, di norma, ad EF-Tu non attivo. EF-Tu (GTP) lega l amminoacil-trna e ne favorisce l inserimento nel sito A ribosomiale. Tale inserimento comporta l idrolisi del GTP di EF-Tu che ritorna, pertanto, nella forma quiescente, con GDP legato. Ricordiamo che anche le tubuline, che formano i microtubuli (questi sono strutture cilindriche e cave del diametro di circa 30 nm formate da tubulina α e β), consumano GTP per la reazione di polimerizzazione, ovvero per la formazione dei microtubuli. Invece l actina, che forma i microfilmanti (del diametro di 7 nm) consuma ATP per la reazione di polimerizzazione. Quindi le proteine-g formano una super-famiglia di proteine, tutte caratterizzate dal legame al GTP e dalla capacità intrinseca di idrolizzarlo (formando GDP). In definitiva le proteine -G sono così classificabili: super-famiglia, formata da famiglie (almeno 5), ciascuna delle quali è formata Le proteine-g, nel loro insieme, formano una super-famiglia da sub-famiglie Famiglie di proteine-g: le eterotrimeriche Gαβγ, le trasducine, le monomeriche, forma-te, a loro volta, da diverse subfamiglie: i fattori di allungamento EF- Tu, le tubuline Schematizziamo il ciclo di attivazione che caratterizza le proteine-g: Le più note sono le subfamiglie della famiglia delle proteine-g monomeriche: Sub-famiglia Ras Sub-famiglia Rho Sub-famiglia Rab Sub-famiglia Arf, Sar Sub-famiglia Ran Occorre tener presente che tale schema è generalmente valido per tutta la super-famiglia delle proteine-g, ad esclusione di quelle monomeriche, prive di subunità β e γ. 291

5 Inserto: Biochimica della fototrasduzione nei Vertebrati 292

6 Relazioni struttura-funzione delle proteine-g (da Kaziro & Coll. Ann. Rev. Biochem. 60, 349, 1991) Confrontiamo le strutture primarie delle varie famiglie di proteine-g. In esse sono individuabili regioni che assolvono alle specifiche funzioni della proteine-g, che dovrà: essere in grado di legare il GTP oppure il GDP; essere in grado di idrolizzare il GTP; possedere una zona di interazione con una molecola committente, per esempio il Recettore (R), che induce il cambio di conformazione sulla proteina-g stessa; possedere una zona di interazione con una molecola Effettore (E), per esempio l Adenilato Ciclasi, sulla quale la proteina-g induce il cambio di conformazione. Tenendo presenti queste necessità funzionali, possiamo ricercare le regioni associate alle funzioni sopra citate in alcune proteine-g. Con questo obiettivo occorre considerare le strutture primarie di alcune proteine-g. Nelle Figure 4 e 5 della pagina seguente sono confrontate le strutture di: EF-Tu, che interagisce con il sito A dei ribosomi; G s α - è la subunità α della proteina-g s (s = stimolatoria dell adenilato ciclasi). G i 2α - è la subunità α della proteina-g i (i = inibitoria dell adenilato ciclasi nelle cellule sensoriali olfattive). G o α - è la subunità α della proteina-g o (o = others, altre). G t α - è la subunità α della proteina-g t (t = trasducina), che interagisce con la fosfodiesterasi nei fotorecettori dei vertebrati. Ras 2- è una proteina-g appartenente alla subfamiglia Ras delle proteine-g monomeriche. La Ras-2, insieme alla Ras-1, forma un gruppo di proteine-g del lievito che regola la progressione della fase G1. H-Ras - è stata la prima proteina-g monomerica studiata. E il prototipo della famiglia delle monomeriche. Fu individuata da Harvey (H) in un retrovirus, dove esiste la forma virale che porta una singola mutazione rispetto alla controparte proto-oncogenica. Teniamo presente che le differenze più salienti esistono tra le proteine-g eterotrimeriche e le monomeriche. La subunità α delle eterotrimeriche presenta un peso molecolare tra 40 e Da. Nel capitolo successivo analizzeremo più a fondo la famiglia della proteine-g monomeriche, che non si legano a subunità βγ, e che possiedono un peso molecolare che è circa la metà. Infatti la Ras è nota anche come p21, ovvero proteina di peso molecolare Da. Anche le altre proteine-g monomeriche presentano un peso molecolare intorno a tale valore, con qualche eccezione. Confrontiamo ora le strutture delle principali proteine-g che sono state allineate nella Figura 4 e schematizzate nella Figura 5. A partire dall N-terminale troviamo: regione P (G1) - (P = fosfato)..lega la catena polifosforica del nucleotide. Emerge l esistenza di una sequenza consenso -G-X-X-X-X-G-K-S/T-, che è simile al Rossmann Motiv trovato nelle proteine cinasi. In esso è prevista una G al posto di X in 3 a posizione. Tuttavia, se si osserva la figura 4 (A), si può constatare che ben 8 sequenze, tra le 10 prese in considerazione, presentano G nella 3 a posizione, quindi l analogia con il Rossmann motiv è reale. Interessante constatare che proteine diverse ricorrono a sequenze analoghe per assolvere alle medesime funzioni. Infatti le proteine cinasi usano il Rossmann motiv per legare il trifosfato dell ATP, mentre le proteiene-g usano un motivo assai simile per legare il trifosfato del GTP. Anche l adenilato ciclasi (vedi pag.175) presenta il Rossmann motiv nella regione che lega il polifosfato dell ATP. regione E (G2) - (E = effettore). Questa regione, non indicata nelle figure, è diversa nelle varie proteine-g. E leggermente conservata solo nell ambito di una sub-famiglia. In Ras occupa 10 AA, tra il 32 ed il 42. Una mutazione di p21ras in tale regione determina scomparsa delle capacità trasformanti. In H-Ras esiste la T-35, che è conservata in tutte le Proteine-G. 293

7 Regione G (G3) - (G = GTP). Esprime funzione GTPasica. La sequenza consenso -D-X-X-G-Q- è altamente conservata (vedi Figura 4B). Il primo Aspartico (D) è probabilmente coordinato allo ione Mg 2+. Mutazioni in questa regione generano, sovente, un fenotipo trasformato. v-ras presenta in posizione 59 una treonina al posto della valina, che viene fosforilata. Regione G (G4) - (G = GTP). Questa regione interagisce direttamente con l anello purinico del nucleotide, cioè con il residuo di guanina. In tale regione (vedi Figura 4-C) esiste la sequenza -N- K-X-D- altamente conservata. Regione G (G5) - E un altra regione strettamente legata all anello guanilico del GTP. Contiene la sequenza consenso conservata -E-T-S-A-K- in Ras. La struttura tridimensionale verrà studiata in Ras (vedi pag.300). 294

8 Analoghi non-idrolizzabili del GTP Per lo studio delle proteine-g sono largamente impiegati in laboratorio analoghi del GTP non idroolizzabili. Sono composti preparati per sintesi chimica, che presentano una leggera modifica al fosfato γ del GTP. Pertanto una proteina-g può legare il derivato al posto del normale GTP, ma non può idrolizzarlo, per cui il composto resta permanentemente legato alla proteina- G. Se il composto è radioattivo può essere usato per rilevare le proteine-g. 295

9 Tossine batteriche Alcuni batteri producono esotossine che colpiscono le cellule vittime disarticolando alcuni centri di smistamento dei segnali chimici. Abbiamo già visto che il batterio patogeno Bordetella Pertussis produce una proteina che è adenilato ciclasi attivabile da calmodulina (vedi pag.176). Lo stesso batterio produce anche un altra tossina che colpisce una proteina-g: si tratta della subuntà α della proteina-g i (i = inibitoria dell enzima adenilato-ciclasi). Il Vibrio Cholerae produce una tossina (formata da 6 subunità: 1 A + 5 B). La A riconosce il ganglioside GM1 sulla membrana plasmatica ed introduce le subunità B nella cellula. Tale subunità B modifica covalentemente la subunità α della proteina-g s (s = stimolatoria dell enzima adenilato-ciclasi). La reazione di ADPribosilazione, portata avanti da tali tossine enzimatiche, consiste nel trasferimento del residuo adenosindifosfato-ribosio dal NAD (che rilascia Nicotinammide libera) ad un residuo di arginina delle rispettive subunità α (vedi pag.193). In ambedue i casi la tossina è un enzima che catalizza una reazione di ADPribosilazione delle rispettive subunità α (vedi pag.193), che così modificate subiscono la inattivazione della propria capacità idrolizzante nei confronti del GTP legato. Pertanto restano permanentemente attive, risultando compromessa la loro capacità di assicurare una transitorietà del segnale: la tossina del Vibrio Cholerae determinerà uno stato permanentemente attivo nella α-stimolatoria, che attiverà in continuazione l enzima adenilato-ciclasi; la tossina del Bordetella Pertussis determinerà uno stato permanentemente attivo della subunità α-inibitoria, che inibirà in continuazione l enzima adenilatociclasi. 296

10 Famiglia delle proteine-g monomeriche - Proprietà generali Trattasi di una famiglia assai numerosa, composta da diverse sub-famiglie.come si è già detto sono caratterizzate da: basso peso molecolare ( Da); struttura monomerica, sono cioè prive di subunità βγ, e la unica subunità α presenta analogie, come abbiamo già visto, con le α delle eterotrimeriche. Le proteine-g di questa famiglia partecipano ad un ampio ventaglio di processi cellulari, che potremmo esemplificare in tre ambiti: trasmissione endocellulare del segnale: abbiamo già visto la Ras che è attivata da Sos e che attiva una MAPKKK (la Raf). ciclo e differenziazione cellulare: la Ras2 controlla la progressione in fase G1. organizzazione interna: le Rab controllano la maturazione del Golgi e la vescicolazione. Per riuscire a svolgere tale compito devono essere associate alle membrane. Infatti risultano cruciali le reazioni di miristoilazione (vedi pagg.23-24) che ancorano queste proteine-g alle membrane. Le proteine-g monomeriche richiedono un buon numero di altre proteine accessorie, che ne regolano l attività. Questa necessità deriva anche dalla bassa capacità di idrolisi intrinseca a carico del GTP legato: trattasi di una reazione con una costante di velocità dell ordine 0,01 min -1, mentre le eterotrimeriche idrolizzano GTP con una costante di velocità che è 3-5 min -1, quindi ben volte più elevata. Per innalzare tale velocità di idrolisi esistono le proteine GAP (GTPasi Activating Protein, proteina di attivazione dell attività GTPasica) che innalzano, appunto, la velocità di idrolisi del GTP legato. Esistono diverse GAP, ciascuna specifica di una determinata proteina G-monomerica. Sono state prese in considerazione alle pagg , dove è evidenziata una omologia di sequenza tra alcune GAP e la inositolo-5-p-fosfatasi e, molto interessante, con la subunità p85, regolatoria dell enzima PI3Cinasi. Anche la reazione di scambio GTP-GDP è lenta. Per innalzarla esistono le proteine GEP (Guanine nucleotide Excenge Protein) dette anche GEF(Guanine nucleotide Excenge Factor). Ne abbiamo parlato a pag.205, in fondo. Le GEP facilmente presentano uno o più domini Plekstrin Homology (PH). Anche la PKB contiene nella subunità catalitica p110 un dominio PH che funziona da zipcode per destinare la PKB alla membrana (vedi pag.206) Esistono poi delle proteine specifiche inibitrici GDI (GDP Dissociation Inhibitor) che bloccano la forma inattiva che lega GDP, ostacolando lo scambio con il GTP. Vediamolo in forma schematica: Ciclo delle proteine-g monomeriche con le proteine accessorie. 297

11 Sub famiglia delle proteine-g monomeriche di tipo Ras E già stato accennato che i primi geni di tipo ras furono identificati in un virus, scoperto da Harvey nel topo. Le sue osservazioni risalgono al 1964 ma ovviamente in quegli anni non si sapeva ancora nulla delle proteine-g. Solo intorno alla metà degli anni 80 fu scoperta la controporte cellulare di v-ras. Tale prodotto proteico fu denominato H-Ras (H da Harvey, Ras = Rat sarcoma). H-Ras è praticamente il prototipo della famiglia delle proteine-g monomeriche. E una proteina studiata in dettaglio. E stata la prima proteina-g ad essere cristallizzata nel La forma virale presenta mutazione, che determina la sostituzione della Alanina-59 con Treonina. L alanina si trova all inizio della regione G (vedi pag.294) che, come abbiamo visto, contribuisce all idrolisi del GTP legato. Nella forma virale tale T-59 è fosforilata, per cui v-ras non idrolizza GTP e resta, quindi, permanentemente attiva. E stata prodotta una v-h Ras modificata con Treonina- 59 sostituita da Valina (rendendo quindi impossibile la reazione di fosforilazione) ma non sono state rilevate alterazioni nella tumorigenità di tale v-ras modificato. Ras ha grandissima importanza. Almeno il 50 % dei tumori umani presentano un alterazione di Ras (in particolare è K-Ras). Nella Drosophila, è stata identificata la proteina Ras che è importante per garantire lo sviluppo della Retinula-7 (R7) mediante un segnale RTK ricevuto dal recettore Sev che interagisce con BOSS presente su R8 (vedi pag.264). E già stata analizzata l importantissima via che collega un recettore RTK all attivazione della MAPK (vedi pag.151; 216; 234). Alla subfamiglia Ras appartengono almeno 4 proteine, con le prime 3 (vedi sotto) con elevatissima omologia di sequenza: H-Ras. Ne abbiamo già parlato. K-Ras. E l oncogene del virus del sarcoma di Kirsten. Può essere di tipo A o di tipo B. La forma virale presenta la stessa sostituzione all Alanina-59 che diventa Treonina e che viene fosforilata (nel virus). Questa sostituzione, con conseguente fosforilazione, non avviene nella controparte cellulare K-Ras. N-Ras. (N = Neuroblastoma). E stata evidenziata come gene trasformante in una forma di Neuroblastoma. A differenza di H e K-Ras, non è nota una sua controparte virale. N-Ras è attivato per mutazione puntiforme in molti tipi di tumore. R-Ras. (R = Related). Ha solo un 55 % di omologia di sequenza con H-Ras, e la sua denominazione nasce proprio da questa caratteristica. Ovvero R-Ras è collegabile alle altre 3 Ras (H, K ed N-Ras), ma se ne discosta. Al loro C-terminale è presente il CAAX-box, ovvero tali proteine-g terminano con l amminoacido Cisteina in quart ultima posizione, seguita per due volte da amminoacidi Alifatici (A) e dall ultimo (X) che può essere qualsiasi AA. Alla Cisteina è aggiunto mediante legame covalente un residuo idrofobico di geranil-geranil fosfato, poi AAX è staccato ed il carbossile di C è metilato. Con H-Ras avviene un addizionale palmitoilazione (legame tioetere, vedi pag.23), in quanto esiste un altra cisteina due posizioni prima di quella del CAAX-box. Questa modifica post-traduzionale è importante per ancorare la Ras alla membrana. Altre proteine-g appartengono a questa numerosa sub-famiglia (almeno 12). Sub famiglia delle proteine-g monomeriche di tipo Rho (Rho da Ras Homology). Presentano un 30 % di omologia con Ras. Sino al 1994 ne erano note 9 tipi distinti. Anche esse regolano vie di trasduzione del segnale, come Ras. Al C-terminale presentano il CAAX -box. Alla cisteina in esso contenuta è aggiunto un residuo idrofobico di geranil-geranil fosfato, come nelle Ras. La prima Rho fu scoperta in seguito ad un artefatto in una procedura di clonazione da una libreria cdna di Aplysia. Le più note sono 3: Rho A, Rho B, Rho C - Regolano una via di trasduzione del segnale che lega recettori di membrana all assemblaggio delle placche di adesione focale e di actina. Rho A termina con CLVL, ovvero un CAAX box, come molte Ras. Tutte e tre sono ADPribosilabili dalla tossina estratta dal Clostrium Botulinum. 298

12 Occorre citare una proteina accessoria, che svolge la funzione di GEP per Rho A: trattasi della Dbl (Diffuse B-cell linphoma), di cui abbiamo già parlato a pag.205. Costiuiscono una famiglia, con più di 20 membri. Tutti contengono l importante Plekstrin Homologhy (PH). Sub famiglia delle proteine-g monomeriche di tipo Rab (Rab da Rat brain). E la subfamiglia con maggior numero di membri. Le Rab controllano le comunicazioni tra organelli intracellulari. Ne abbiamo già parlato alle pagg , per quanto riguarda la loro possibile fosforilazione da parte di Cdc2. Possono essere anche loro rese idrofobiche al C-terminale, i n quanto possono contenere dei residui di cisteina (che accetta geranil-geranil fosfato) con una sequenza diversa dal CAAXbox. Infatti Rab1 a e b termina con la sequenza GGCC. Qui a lato è riprodotto uno schema di maturazione del reticolo endoplasmatico che è controllato da proteine della famiglia Rab. Sub famiglia delle proteine-g monomeriche di tipo Arf (Arf da ADP ribosylation factor). Controllano la vescicolazione. Sono quasi prive di attività GTPasica intrinseca. Sono quindi indispensabili le proteine centaurion (che sono le GAP di Arf). Mentre le citoesine sono le GEP di Arf. Sub famiglia delle proteine-g monomeriche di tipo Ran (Ran da Ras nuclear). Presentano funzioni associate a processi nucleari. Struttura tridimensionale della p21-ras La proteina-g monomerica di tipo p21-ras è stata cristallizzata e studiata con diffrazione a raggi- X. Nella pagina seguente è riportato lo schema di tale struttura, dove sono individuabili le regioni specifiche di una proteina-g. Ricordiamole brevemente: P (G1), E (G2), G (G3), G (G4), G (G5) (vedi pagg ). Si può osservare che esistono 6 filamenti-β, che si dispongono antiparalleli solo ai lati, mentre al centro 4 di essi sono paralleli. Partendo dall N-terminale esiste: l ansa P (G1) che lega il polifosfato. Poi esiste un α-elica e l ansa E (G2) che lega l effettore (per esempio Ras legherà Raf). Poi esistono due filamenti-β e la regione G (G3), che scinde il fosfato γ del GTP, cioè assicura la funzione GTPasica. Segue quindi una α-elica ed un filamento-β e poi l ansa con la regione G (G4) che lega l anello purinico della guanina. Infine abbiamo l ansa G (G5), che lega anch essa l anello purinico. 299

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