Dante. Le mucine costituiscono. di marcatori immunoistochimici. Delivery of AdvaNced TEchnology

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1 Dante Delivery of AdvaNced TEchnology Anno VI - n. 2 - Settembre 2007 In questo numero: Le mucine: una classe emergente di marcatori immunoistochimici La classificazione delle mucine Mucine di membrana Mucine secretorie che formano gel Le mucine: una classe emergente di marcatori immunoistochimici Marco Chilosi, Anatomia Patologica, Università di Verona Le mucine costituiscono un ampia famiglia di glicoproteine di grandi dimensioni (peso molecolare 2-20 x 10 5 Dalton) secrete da cellule epiteliali o espresse sulla loro membrana. Sono stati individuati più di 20 tipi differenti di mucina e la loro distinzione si basa sulla sequenza dei differenti backbone proteici (apomucine) codificati da geni MUC (localizzati su differenti cromosomi). La struttura molecolare delle mucine è complessa ed è caratterizzata dalla presenza di numerosi TR (tandem-repeats) capaci di formare un numero enorme di siti di potenziale O-glicosilazione tramite residui di serina o treonina. La presenza di questo peculiare involucro di zuccheri permette alle mucine di assorbire grandi quantità d acqua e di impedire la proteolisi, contribuendo così al 123 mantenimento delle barriere mucose. Le mucine formano infatti la parte preponderante della frazione proteica del muco, con funzioni di protezione delle mucose dall autodigestione e dalla penetrazione di patogeni e tossine, contribuendo alle difese immunitarie nel tratto gastrointestinale, nel sistema respiratorio e in quello riproduttivo. Le molteplici e importanti funzioni specifiche delle mucine sono legate alle loro caratteristiche visco-elastiche nella protezione delle mucose, ma sono coinvolte anche nella modulazione dell adesione cellulare e nella regolazione di importanti pathways molecolari. Negli ultimi anni le conoscenze sull eterogeneità delle mucine e sulle loro differenti funzioni ne hanno sottolineato l importanza Anno VI - n. 2 - Settembre 2007 Reg. Trib. di Milano n. 32 del 28/01/2003 Editore Springer-Verlag Italia Srl via Decembrio Milano Realizzazione a cura di Medicom divisione di Springer-Verlag Italia Srl Direttore Responsabile Maria Antonietta Argentiero Stampa Geca SpA - via Magellano 11 Cesano Boscone (MI) Contiene IP

2 Dante Delivery of AdvaNced TEchnology nella fisiologia e patologia delle mucose. La disponibilità di anticorpi monoclonali che riconoscono i cores proteici delle apomucine ha consentito il superamento delle tipizzazioni istochimiche, sostituite dall analisi immunoistochimica. Questo approccio metodologico, più specifico e riproducibile, è in notevole espansione. L analisi qualitativa e quantitativa delle mucine non è semplice a causa della complessità della loro classificazione, nonché per l occorrenza di polimorfismi e splicing alternativi. Non sempre l espressione di mrna corrisponde a quella della relativa proteina e dati contrastanti sono riportati in letteratura a causa dell eterogeneità metodologica. La disponibilità di anticorpi monoclonali, specifici e sensibili, è fondamentale per poter analizzare con precisione e riproducibilità il pattern di espressione delle mucine nella patologia umana. Le applicazioni in patologia umana sono numerose e abbracciano diversi campi. Tra i principali ricordiamo la caratterizzazione delle lesioni pre-neoplastiche e neoplastiche del sistema gastrointestinale, quella di neoplasie ovariche e uterine, e quella dei tumori del polmone. Appaiono rilevanti anche le informazioni ricavabili dallo studio delle mucine nella fisiopatologia del microambiente delle mucose, in particolare in quello del sistema respiratorio. Anomalie qualitative e quantitative delle mucine caratterizzano infatti la patogenesi di malattie croniche importantissime quali l asma, la BPCO e la fibrosi cistica (1). Le mucine sono presenti in tutte le mucose in differenti combinazioni, correlate alle funzioni specifiche del tessuto nonché a stimoli microambientali capaci di influenzarne qualitativamente e quantitativamente l espressione. Il pattern di espressione è in parte conservato nella trasformazione neoplastica, seguendo il fenotipo tissutale, e peculiari patterns di espressione possono essere utilizzati diagnosticamente come marcatori istogenetici e di differenziazione. La classificazione delle mucine TABELLA 1. Le mucine si suddividono, in base alle loro caratteristiche molecolari (con o senza TR) e in base alle caratteristiche biologiche e al pattern di espressione, in mucine secretorie e mucine di membrana. Mucine di membrana: MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC11, MUC12, MUC13, MUC16, MUC17, MUC20 Mucine secretorie (ricche in cisteina): MUC6, MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC19 Mucine secretorie (povere di cisteina): MUC7, MUC8, MUC9 Mucine prive di TR: MUC14, MUC15, MUC18(CD146) Da: Gene Bank e Callaghan Rose M, and Voynow JA, Physiol Rev 86:245,2006 (1) Vedi anche:

3 TABELLA 2. Gene Tipo Espressione prevalente Cromosoma MUC1 M pan-epiteliale 1q21 MUC2 S intestino 11p15.5 MUC3A M intestino 7q22 MUC3B M intestino 7q22 MUC4 M bronchi, colon 3q29 MUC5AC S bronchi, stomaco 11p15.5 MUC5B S bronchi, salivari 11p15.5 MUC6 S stomaco, intestino, vescica 11p15.5 MUC7 S salivari 4q13-21 MUC8 S bronchi 12q24.3 MUC9 S, M tube 1p13 MUC11 M colon, bronchi 7q22 MUC12 M colon, pancreas 7q22 MUC13 M colon, trachea, rene 3q13.3 MUC15 M colon, bronchi 11p14.3 MUC16 M ovaio 19q21 MUC17 M intestino 7q22 MUC18 M polmone, mammella 11q23 MUC19 S salivari, trachea 12 MUC20 M rene, placenta, polmone ecc. 3q29 M: mucine di membrana S: mucine secretorie Mucine di membrana Tra le mucine di membrana MUC1 e MUC4 sono state particolarmente studiate in campo oncologico per le potenzialità diagnostiche e prognostiche. MUC1 Èuna mucina di membrana espressa da quasi tutti gli epiteli (nel duodeno è caratteristicamente assente). Questa mucina è anche conosciuta come epithelial membrane antigen (EMA), un ben noto marcatore in patologia e immunoistochimica. L espressione di MUC1 può subire variazioni in differenti tumori (ad es. nel carcinoma della mammella). La molecola può essere iper-espressa e contemporaneamente ipo-glicosilata nello stesso tumore e questa combinazione rende MUC1 un potenziale bersaglio per strategie immunoterapeutiche e vaccini anti-tumorali (2). MUC1 è espressa al polo apicale delle cellule epiteliali nella maggior parte dei tessuti ove svolge un importante ruolo fisiologico (adesione cellulare, differenziazione, modulazione del sistema immune, regolazione dell adesione cellulare). La porzione intra-citoplasmatica di MUC1 è fosforilata e può interagire con importanti pathways molecolari (ad es. betacatenina, recettori ormonali ecc.). La genetica di MUC1, soprattutto particolari polimorfismi (ad es. l omozigosi di forme di MUC1 di piccole dimensioni) appare correlata con la suscettibilità a sviluppare gastrite cronica, metaplasia intestinale e carcinoma gastrico. MUC4 Èuna mucina di membrana estesamente espressa a livello tracheo-bronchiale, intestinale, nel sistema riproduttivo ecc. Dati recenti hanno dimostrato per questa mucina un ruolo fisiologico complesso e importante. MUC4, infatti, a livello citoplasmatico è capace di interagire come ligando con la tirosin-kinasi recettoriale

4 Dante Delivery of AdvaNced TEchnology ErbB2 e può contribuire alla regolazione della p27, importante inibitor e del ciclo cellular e. Queste funzioni sono presumibilmente correlate con le caratteristiche di marcatore prognostico di MUC4 (come ad es. nel carcinoma del polmone e nel carcinoma del pancreas) (3). In diversi tipi di epitelio MUC4 non è normalmente espressa, a differenza di quanto osser vato nelle corrispondenti neoplasie. Questa eterogeneità di espressione può essere utilizzata a livello diagnostico. Ad esempio nel pancreas MUC4 non è espressa, a differenza del carcinoma intraduttale, in cui sono rilevabili consistenti livelli di espressione. Una interessante applicazione diagnostica di MUC4 è stata recentemente proposta nell ambito della diagnosi differenziale tra mesotelioma (MUC4-negativo) e carcinoma sieroso dell ovaio (MUC4-positivo) (4). Mucine secretorie che formano gel In questo gruppo ci sono le mucine più utilizzate in patologia (MUC2, MUC5AC, MUC5B, e MUC6). I geni di queste mucine sono localizzati sul cromosoma 11 e presentano significative analogie di funzione e di struttura. MUC2 Questa mucina è il marker tipico della cellula goblet intestinale. La proteina, che è scarsamente solubile, caratterizza il denso muco intestinale ed è fondamentale per le funzioni di barriera contro la penetrazione di patogeni intestinali (ad es. la Entamoeba histolytica aderisce alla mucina utilizzando una lectina di 170 kd ed è bloccata da questa interazione), mentre nell amebiasi l invasività è determinata dalla dissociazione del gel del muco intestinale operata dall azione di una proteasi MUC2-specifica. MUC2 è considerata un ottimo marcatore di differenziazione intestinale (insieme al fattore di trascrizione cdx-2). Elevati livelli di espressione di MUC2 sono dimostrabili immunoistochimicamente nelle cellule goblet intestinali, nei carcinomi dell intestino, nelle lesioni neoplastiche e pre-neoplastiche che presentano caratteri di differenziazione intestinale in diversi organi come: ovaio, polmone e stomaco, metaplasia intestinale nello stomaco ecc. Nell esofago di Barrett, il profilo di espressione delle mucine contribuisce alla definizione del tipo di metaplasia (completa, incompleta) e del rischio di sviluppare un carcinoma (5, 6). Interessante notare come nei topi knock-out (Muc2 -/-) sia possible dimostrare un aumento della proliferazione e della motilità cellulare a livello intestinale, come anche il decremento dell apoptosi. Queste anomalie sono verosimilmente correlate nei topi Muc2 -/- all elevata frequenza di adenomi e carcinomi gastrointestinali. MUC5AC Nota come mucina tracheobronchiale, viene espressa anche a livello gastrointestinale (in particolare nelle foveole gastriche). Nel polmone normale questa mucina è espressa a livello delle cellule caliciformi (goblet) e ne evidenzia molto precisamente l incremento a livello bronchiolare in corso di stimolazioni flogistiche. L espressione di differenti tipi di mucina, e in par ticolare di MUC5AC, è stata utilizzata per distinguere e caratterizzare differenti tipi di adenocarcinoma del polmone. Il carcinoma a cellule con castone è caratterizzato da elevata espressione di MUC1, ma modesta o nulla espressione di MUC5AC. Il carcinoma bronchiolo-alveolare mucinoso (m-bac) è caratterizzato da elevati livelli di espressione di MUC5AC, mentre MUC1 è assente o ipo-espressa. Questo particolare profilo di espressione rappresenta un utile marcatore diagnostico nell ambito della diagnosi differenziale degli adenocarcinomi del polmone. Questa distinzione è clinicamente rilevante alla luce della corrispondenza tra fenotipo mucinoso e peculiari alterazioni molecolari (assenza di mutazioni di EGFR, ma presenza di mutazioni

5 di KRAS), che determinano la predittività sulla risposta a inibitori delle tirosin-kinasi (7). Nel pancreas MUC5AC non è normalmente espressa, ma è rilevabile nel carcinoma duttale e questa espressione è un utile marcatore diagnostico, specialmente su prelievi con ago sottile (8). Il profilo di espressione delle mucine, e in particolare l espressione di MUC5 e MUC2, caratterizza le forme mucinose intraduttali (9). Espressione aberrante di MUC5AC caratterizza anche i processi oncogenetici del grosso intestino (10). MUC5B Vede tra le sue funzioni principali quella di fornire le proprietà visco-elastiche e lubrificanti alla saliva: è infatti una mucina espressa nelle ghiandole salivari. Livelli significativi di espressione sono dimostrabili anche nei bronchi, nelle ghiandole submucose e nelle cellule goblet bronchiali, nell endocervice, nel pancreas e nella cistifellea. L epitelio dell endocervice esprime tre delle mucine secretorie: MUC5AC, MUC5B e MUC6. MUC6 Èdefinita mucina gastrica ghiandolare a causa del ruolo fondamentale che ricopre nella protezione della mucosa gastrica (acidità, proteasi, patogeni e traumi). Livelli significativi di espressione sono però dimostrabili anche nella cistifellea e, in minor quantità, a livello intestinale, nelle ghiandole di Brunner. Nel carcinoma gastrico l espressione di MUC6 è spesso diminuita e la riduzione è correlata con l aggressività del tumore. In questo tumore la distin- a b c d Figura 1. Espressione di MUC2 [Ab NCL-MUC-2] nel colon (a) e nel digiuno (b); espressione di MUC4 [Ab NCL-MUC-4] (c) e MUC1 [Ab NCL-MUC-1] (d) nel digiuno

6 Dante Delivery of AdvaNced TEchnology zione tra fenotipo intestinale e gastrico si basa sull identificazione di un profilo in cui le mucine sono componenti fondamentali (11). Nel carcinoma dello stomaco, infatti, vengono conservate, anche se eterogeneamente, le mucine gastriche (MUC1, MUC5AC, MUC6), ma viene espressa in modo anomalo MUC2 nelle forme mucinose a differenziazione intestinale. Bibliografia 1) Callaghan Rose M, Voynow JA. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiol Rev. 2006;86(1): Review. 2) Li Y, Cozzi PJ. MUC1 is a promising therapeutic target for prostate cancer therapy. Curr Cancer Drug Targets. 2007;7(3): ) Singh AP, Chatur vedi P, Batra SK. Emerging roles of MUC4 in cancer: a novel target for diagnosis and therapy. Cancer Res. 2007;67(2): Review. 4) Davidson B, Zhang Z, Kleinberg L, Li M, Florenes VA, Wang TL, Shih IM. Gene expression signatures differentiate ovarian/peritoneal serous carcinoma from diffuse malignant peritoneal mesothelioma. Clin Cancer Res. 2006;12(20): ) Piazuelo MB, Haque S, Delgado A, Du JX, Rodriguez F, Correa P. Phenotypic differences between esophageal and gastric intestinal metaplasia. Mod Pathol. 2004; 17(1): ) Warson C, Van De Bovenkamp JH, Korteland-Van Male AM, Buller HA, Einerhand AW, Ectors NL, Dekker J. Barrett's esophagus is characterized by a b c d Figura 2. Espressione di MUC1 [Ab NCL-MUC-1] (a, negativa), MUC2 [Ab NCL-MUC-2] (b), MUC5AC [Ab NCL-MUC-5AC] (c) e MUC6 [Ab NCL-MUC-6] (d) in un caso di esofago di Barrett

7 expression of gastric-type mucins (MUC5AC, MUC6) and TFF peptides ( TFF1 and TFF2), but the risk of carcinoma development may be indicated by the intestinal-type mucin, MUC2. Hum Pathol. 2002;33(6): ) Finberg KE, Sequist LV, Joshi VA, Muzikansky A, Miller JM, Han M, Beheshti J, Chirieac LR, Mark EJ, Iafrate AJ. Mucinous differentiation correlates with absence of EGFR mutation and presence of KRAS mutation in lung adenocarcinomas with bronchioloalveolar features. J Mol Diagn. 2007;9(3): ) Giorgadze TA, Peterman H, Baloch ZW, Furth EE, Pasha T, Shiina N, Zhang PJ, Gupta PK. Diagnostic utility of mucin profile in fine-needle aspiration specimens of the pancreas: an immunohistochemical study with surgical pathology correlation. Cancer. 2006; 108(3): ) Luttges J, Zamboni G, Longnecker D, Kloppel G. The immunohistochemical mucin expression pattern distinguishes different types of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas and determines their relationship to mucinous noncystic carcinoma and ductal adenocarcinoma. Am J Surg Pathol. 2001;25(7): )Forgue-Lafitte ME, Fabiani B, Levy PP, Maurin N, Flejou JF, Bara J. Abnormal expression of M1/MUC5AC mucin in distal colon of patients with diverticulitis, ulcerative colitis and cancer. Int J Cancer Jun 12; [Epub ahead of print]. 11)Tian MM, Zhao AL, Li ZW, Li JY. Phenotypic classification of gastric signet ring cell carcinoma and its relationship with clinicopathologic parameters and prognosis. World J Gastroenterol. 2007;13(23): a b c Figura 3. Espressione di MUC5AC [Ab NCL-MUC-5AC] nelle cellule goblet bronchiolari (a), nell iperplasia a cellule goblet in un bronchiolo (b) e nel BAC mucinoso (c)

8 a b c Figura 4. Espressione di MUC1 [Ab NCL-MUC-1] (a), MUC2 [Ab NCL-MUC-2] (b) e MUC5AC [Ab NCL-MUC-5AC] (c) in un caso di carcinoma mucinoso papillare intraduttale del pancreas