I MICRORNA E LA REGOLAZIONE DELLA SINTESI PROTEICA

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1 Marco Marino I MICRORNA E LA REGOLAZIONE DELLA SINTESI PROTEICA INTRODUZIONE Sebbene le tecniche per analizzare i livelli di espressione degli RNA siano conosciute da almeno un paio di decine di anni i MicroRNA sono sempre stati poco considerati dagli studiosi per via della comune idea che l unico destino dei filamenti di RNA fosse quello di dare origine a proteine. In base a tale dogma tutti gli RNA di corte dimensioni venivano scartati, a volte venendo etichettati come miseri prodotti di degradazione di RNA più lunghi. Tale dogma è stato messo in crisi nel 1993 da Lee, il quale scoprì in C.Elegans le funzioni del gene Lin-4. Questo gene, essenziale regolatore della divisione cellulare allo stadio larvale, dava origine ad un RNA di 61 nucleotidi che veniva processato in un secondo tempo in un RNA più corto di 22 nucleotidi di lunghezza. Tale prodotto è risultato essere perfettamente complementare ad un tratto della regione 3 UTR del gene Lin-14 e, cosa strana, quando Lin-4 veniva espresso si assisteva alla scomparsa sia della proteina Lin-14 sia del messaggero dal quale veniva tradotta. Questa scoperta ha destato forte scalpore ma non è stata presa in debita considerazione poiché non esistono ortologhi di Lin-4 all interno delle altre specie (si è poi scoperto in seguito che ciò è dovuto alla divergenza tra le specie). Tale permanenza nell ombra è però bruscamente terminata nel 2000, quando, sempre in C.Elegans, il gruppo di Reinhart ha scoperto il gene Lin-7, gene con funzione analoga a quella di Lin-4 ma con un bersaglio tuttora sconosciuto. Tale gene presenta però ortologhi sia in Drosophila che nell uomo e tale scoperta ha di fatto iniziato la caccia ai MicroRNA, rivelando che anche gli RNA possono giocare un ruolo nella regolazione della sintesi proteica. Tuttora si conoscono circa 150 MicroRNA nell uomo, ma tale numero (secondo alcuni) è probabilmente destinato a crescere. TERMINOLOGIA Prima di iniziare a descrivere i meccanismi di biogenesi e di azione dei MicroRNA è opportuno fare una breve panoramica terminologica-funzionale sull argomento. Innanzitutto il termine più corretto per indicare IN GENERALE l insieme degli RNA di piccole dimensioni è smallrna (Rna piccoli). Tale famiglia si divide in quattro sottofamiglie, suddivisione che rispecchia le differenze qualitative e funzionali dei vari smallrna. Tali sottofamiglie sono: 1) sirna (Short Interfering RNAs): piccoli RNA a doppio filamento di nucleotidi generati da RNA a doppio filamento molto più lunghi (di solito un singolo RNA ripiegato ad hairpin). Tali RNAs mediano il silenziamento genico portando alla degradazione dell RNA messaggero cui sono PERFETTAMENTE complementari, oppure provocano il silenziamento della trascrizione andando a rimodellare la cromatina a livello delle sequenze codificanti i geni cui sono complementari. 2) MiRNA (MicroRNA): piccoli RNA lunghi nucleotidi codificati nel genoma di molti organismi. Tali RNA non sono però perfettamente complementari alla sequenza dell RNA bersaglio (uno o due mismatch) e di fatto ne provocano solo un blocco della traduzione senza causarne la degradazione 3) TncRNAs (Tiny Non Coding RNA): sono stati scoperti di recente in C.elegans e sono lunghi nucleotidi. Non possiedono una forte complementarietà di sequenza e sembrano non essere generati da hairpin sebbene molti di essi sembrano essere processati da Dicer. I tncrna non sono conservati nelle specie e non si conosce la loro funzione

2 4) SmRNA Small Regulatory RNA): Sono gli ultimi ad essere stati scoperti e sono RNA a doppio filamento di 20 nucleotidi. Sono stati isolati da cellule staminali neuronali dell ippocampo di topi adulti. Questi RNA sono complementari a sequenze genomiche dette silencer neurone-specifici e sembrano essere utili per evitare che geni neuronali si esprimano in cellule che non neuronali. Nei neuroni invece funzionano al contrario reclutando proteine in grado di aumentare l espressione di geni neuroni-specifici. Tali smallrnas vengono trascritti dal genoma e possono essere organizzati in tre modi diversi: 1) Possono trovarsi clusterizzati in regione genomiche discrete ed essere regolati da un promotore proprio. Questi smallrna vengono trascritti in forma policistronica e clivati nelle forme attive in un secondo tempo. (Geni Hox e cluster del cromosoma 13 nell uomo) 2) Possono essere generati dagli introni di geni attivamente trascritti. In seguito allo splicing di mrna immaturi gli introni possono essere riciclati e usati come repressori dell mrna da cui derivano con un meccanismo di feedback negativo. In questo caso sono regolati dal promotore del gene da cui derivano 3) Possono anche trovarsi singolarmente sparsi nel genoma regolati da un promotore proprio e non essere parte di un cluster. BIOGENESI DEI MicroRNA La prima fase della biogenesi dei MicroRNA (e dei sirna) consiste nella trascrizione di una breve sequenza genomica da parte di una RNA polimerasi non ancora identificata. Tale trascrizione porta alla formazione dei cosiddetti primary MicroRNA (pri-mirna) la cui lunghezza può variare da qualche centinaia a qualche migliaia di basi. Tali pri-mirna, che contengo i mirna in forma policistronica, si ripiegano fino ad assumere una struttura terziaria presentanti diversi loop dai quali deriveranno successivamente i vari mirna. I pri-mirna vengono poi successivamente riconosciuti da Drosha (una delle RNAsi III presenti a livello nucleare) a livello dei loop e clivati nei pre-mirna (mirna immaturi) di lunghezza pari a circa 70 nucleotidi e caratterizzati da una peculiare estremità protruding al 3 di due nucleotidi. Tale struttura è importante per gli step di maturazione successivi in quanto il riconoscimento dei mirna da parte delle proteine coinvolte in tale processo avviene a livello di questa regione, caratteristica del clivaggio da parte delle RNAsi III. Drosha è presente solo in Drosofila e negli organismi superiori, indice che si tratta di una aggiunta recente in termini evolutivi, sebbene meccanismi come l RNA interference sia già presenti in lievito. Successivamente il pre-mirna viene riconosciuto dalla proteina esportina-5 a livello dell estremità protruding al 3 la quale ne premette la traslocazione nel citoplasma con un meccanismo Ran-GTP mediato. Il pre-mirna traslocato nel citoplasma viene riconosciuto da Dicer a livello della protrusione al 3. Il riconoscimento è mediato da un dominio di Dicer detto PAZ, molto specifico per le suddette protrusioni. Tale dominio è però un aggiunta recente alla struttura di Dicer poiché il Dicer di lievito non lo possiede suggerendo la presenza di altri metodi di riconoscimento del substrato. Il clivaggio da parte di Dicer completa la maturazione dei mirna e dei sirna nella forma finale di filamenti double-stranded di 22 nucleotidi.

3 A questo punto i destini dei mirna e dei sirna si dividono: i mirna reclutano la proteina ago-1 (la quale possiede anch essa un dominio PAZ) che successivamente recluta le proteine Gemin3 e Gemin4 generando un complesso in grado di bloccare la traslazione dei ribosomi sull RNA messaggero bloccandone di fatto la traduzione ma non causandone la degradazione. I sirna invece reclutano lo stesso la proteina ago-1 (sempre perché possiede il dominio PAZ) ma quest ultima in questo caso recluta tutti gli elementi del complesso RISC portando alla fine alla degradazione del messaggero. Sebbene la proteina chiave coinvolta sia sempre la stessa (ago-1), come si può notare gli effetti sono profondamente diversi: ciò può essere causato dal fatto che il mirna, non essendo perfettamente complementare all mrna bersaglio, causi una distorsione della doppia elica RNA- RNA quando si lega al messaggero. Tale distorsione si riflette sulla struttura terziaria della proteina Ago-1 che finisce col reclutare cofattori diversi rispetto a quelli che recluta quando si trova a legare un sirna (RISC), il quale, essendo perfettamente complementare all mrna bersaglio, non genera di fatto distorsioni sulla doppia elica RNA-RNA e fa assumere alla proteina ago-1 una conformazione diversa.

4 Concludendo: Il destino del mrna dipende dai fattori reclutati da Ago-1. Il reclutamento differenziale può essere spiegato con una diversa conformazione della proteina Ago-1a seconda della presenza o dell assenza di distorsioni nella doppia elica di RNA causata Da eventuali mismatch tra il messaggero e lo smallrna.

5 Come può la cellula interrompere il meccanismo di silenziamento? Tuttora il meccanismo esatto non si conosce, tuttavia si ipotizza il reclutamento di una RNAasi T che cliva l estremità protruding al 3 generando un estremità blunt non più riconosciuta dai domini PAZ e portando allo smembramento dei complessi attivi (o rendendo i mirna e i sirna invisibili agli effettori). DROSHA E IL COMPLESSO MICROPROCESSOR Contrariamente a quanto spiegato sopra, Drosha non è enzimaticamente attivo se non viene reclutato in un complesso proteico ben preciso. In particolare Drosha può essere reclutato all interno di due complessi proteici distinti: uno definito grande (large) e uno piccolo (small). Il complesso grande comprende 19 polipeptidi tra cui RNA-associated proteins (elicasi, ribonucleasi, proteine con domini di legame all RNA) e la famiglia delle proteine coinvolte nel sarcome di Ewing, mentre il complesso piccolo comprende solo Drosha e la proteina DGCR8, che deleto provoca la sindrome di DeGeorge. Tale scoperta è stata fatta mediante trasfezione in cellule Hek293T con il costrutto Flag-Drosha ed eseguendo successivamente una IP con anticorpo α-flag. È il complesso più piccolo ad essere stato definito Microprocessor in quanto si è dimostrato essere sufficiente per processare i pri-mirna in pre-mirna. Tale osservazione è supportata da tre risultati sperimentali: 1) Microprocessor purificato mediante IP α-flag mostra una forte attività catalità in vitro.

6 2) Coimmunoprecipitazione con α-flag dei costrutti flag-dgcr8 mostrano la presenza di Drosha e la purificazione di Microprocessor usando i costrutti Flag-DGCR8 mostra la medesima attività enzimatica in vitro. 3) L attività catalitica può essere ricostituita in vitro con Drosha e DGCR8 ricombinanti.

7 DGCR8 è una proteina evolutivamente conservata che contiene un dominio di legame ad RNA a doppio filamento e un dominio WW in grado di legare una regione ricca in proline di Drosha. La sua delezione provoca la sindrome di DeGeorge. Riguardo al complesso grande non si sa molto: è grossomodo della stesse dimensioni del complesso SWI-SNF ma poco si sa dire sulla sua funzione. Non si può escludere una sua attività nella processazione dei mirna in quanto se ne rivela una debole attività in vitro e inattivazione di alcuni suoi componenti in vivo mostra solo un lieve calo dei livello di MiRNA maturi, non però paragonabili agli effetti dell inibizione di DGCR8. E probabile che il coinvolgimento del complesso grande nella maturazione dei mirna sia solo marginale e che tale complesso venga usato solo nel processamento dei RNA pre-ribosomiali (come già dimostrato). In ogni caso l enzima Drosha rappresenta un chiaro esempio di come l attività di un enzima sia dovuta al pool di cofattori che vengono reclutati con esso. PREDIZIONE DEI mirna A LIVELLO GENOMICO La capacità dei mirna di essere attivi anche senza una perfetta complementarietà di sequenza ha profonde implicazioni sia nella determinazione dello spettro dei geni bersaglio sia nel loro uso tecnico nel silenziamento genico. Tuttora esistono molti approcci bioinformatici per predire la struttura dei mirna, soprattutto per determinare se una sequenza gnomica può dare origine o meno ad un mirna.

8 Uno dei server più usati è MFOLD: esso, immettendo una sequenza genomica come imput, è in grado di predire con un piccolo margine di errore se essa può dare origine ad un pri-mirna. I criteri usati nell analisi sono: - dimensioni della finestra di nucleotidi da considerare - lunghezza del loop - match tra le basi (numero ed estensione) - numero ed estensione dei mismatch - variazioni alle estremità 3 o 5 (le quali, fornendo regioni di riconoscimento per le proteine effettrici sono soggette a constrain strutturali maggiori) Ogni parametro viene valutato con uno score e tanto più alto è lo score finale tanto è probabile che quella sequenza gnomica dia origine effettivamente ad un pri-mirna. Un approccio più rapido può consistere nell usare BLASTN per cercare la sequenza di un mirna all interno di un genomi di specie diverse, al fine di identificarlo direttamente dall intero genoma. Tale approccio può rivelarsi estremamente impreciso data la divergenza di sequenze tra le specie. TECNICHE DI ANALISI DELL ESPRESSIONE DEI mirna Ci sono tre motodologie per analizzare i livelli di espressione dei mirna: il primo consiste nell eseguire un classico northern blot con una sonda contro il mirna di interesse, il secondo prevede l uso dei microarray e il terzo consiste nell applicare una metodologia abbastanza recente chiamata MIRmasa. ANALISI MEDIANTE MICROARRAY Recentemente è stata messa a punto una variante del microarray classico per poterlo ottimizzare nei confronti dei mirna, in particolare per garantire che tale approccio possa identificare un mirna direttamente dal suo precursore. Per ottenere ciò sono stati disegnati due chips di DNA contenenti le sequenze MIR (microrna) attualmente conosciute introducendole in frammenti di 60-mer in varie condizioni. Il primo chips è stato usato per vedere se i MIR venivano riconosciuti all interno dei loro precursori: per ogni MIR sono state scelte le loro regioni upstream e downstream presenti nel genoma e come controllo sono stati usati frammenti con mutazioni all interno e al di fuori delle sequenze dei MIR e/o fiancheggiati da sequenze non umane (per discriminare i MIR in condizione di precursori o MIR singoli). Tale chip di controllo è stato ibridizzato con lcrna (labeled crna) di HeLA cells come controllo e si è visto dare un segnale proporzionale all abbondanza dei mirna in tali cellule. Il secondo chip è stato usato per discriminare la sensibilità della tecnica di fronte ad alcune variabili tra cui la disposizione dei MIR, la loro localizzazione all interno della sonda (NB: le sonde sono di 60 nt mentre i mirna sono lunghi 20 nt) e la presenza di mismacht. Sono state usate anche sonde contenenti MIR in singola, doppia e tripla copia. Il chip includeva un totale di 150 MIR umani presentati in varie situazioni e/o fiancheggiati da sequenze non umane. Risultati: la comparazione tra sonde contenenti il precursore+mir e sonde MIR+sequenze non umane davano segnali simili mentre precursori senza MIR o con forme di essi troncate davano segnali sensibilmente minori o addirittura nessun segnale. Mismatch nelle regioni esterne ai MIR non causavano perdita di segnale mentre mismatch all interno dei MIR provocavano un forte calo del segnale. Controlli con solo sequenze esterne non davano segnale. Il secondo chip includeva MIR in tre posizioni diverse all interno delle sonde per valutare se la posizione dei MIR aveva importanza: MIR localizzati al 5 della sonda davano segnali forti mentre MIR al 3 davano segnali più modesti (a parità di sequenza). Ciò può essere spiegato con il fatto che le sonde venivano legate al supporto del chip a livello delle regioni 3 per cui tanto più il MIR si trovava al 3 della sonda (e quindi alla base del chip) tanto più il segnale risultava smorzato dal supporto. MIR in duplex o triplex (doppia o tripla copia) davano ancora segnali più bassi, probabilmente a causa di autoquenching dei fluorofori usati. L introduzione di mismatch al 5 causavo un forte calo del

9 segnale mentre l introduzione di mismatch al 3 causavano un decremento più modesto (ovviamente a parità di mismatch). E stato eseguito anche un test di ibridazione a 60. L aumento di temperatura aumenta le condizioni di stringenza nell ibridazione e si è osservato che in tale condizione l introduzione anche di un solo mismacht all interno della sequenza dei MIR abbatteva il livello del segnale. Con tre mismacht il segnale praticamente si azzervava. Ciò può avere due importanti applicazioni: innanzitutto è possibile discriminare i mirna dai sirna e inoltre è possibile analizzare la diversa espressione tissutale dei vari mirna in quanto mirna con anche solo una base di differenza hanno espressioni tissutali diverse (è quindi una analisi molto più sensibile del northern).

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11 ANALISI MEDIANTE MIRMASA Questa semplice tecnica è stata inserita da un paio d anni nello studio dell espressione dei mirna (o dei sirna). L estratto totale di RNA viene incubato contemporaneamente con due sonde: una complementare ad una metà del mirna di interesse marcata con un fluoroforo (capture oligo), l altra complementare all altra metà del mirna e marcata con biotina (detection oligo). Dopo l incubazione di esegue una purificazione con sfere ricoperte di streptavidina e si catturano i detection oligo. Se nell estratto non sono presenti i mirna di interesse si purificano solo i detection oligo e non i capture oligo per cui la frazione purificata non emette luce se stimolata con le lunghezze d onda dei fluorofori usati, se invece i mirna sono presenti essi ibrideranno contemporaneamente le due sonde e la purificazione con le biglie selezionerà sia i detection oligo, sia i mirna che i capture per cui il purificato sarà fluorescente (indice di presenza del mirna di interesse). Inoltre è una tecnica quantitativa: l intensità del segnale è direttamente proporzionale alla quantità di mirna presenti nell estratto totale.

12 BIBLIOGRAFIA: MicroRNA expression detected by oligonucleotide microarrays: System establishment and expression profiling in human tissues Omer Barad,1,3 Eti Meiri,1,3 Amir Avniel,1,3 Ranit Aharonov,1 Adi Barzilai,1 Isaac Bentwich,1 Uri Einav,1 Shlomit Gilad,1 Patrick Hurban,2 Yael Karov,1 Edward K. Lobenhofer,2 Eilon Sharon,1 Yoel M. Shiboleth,1 Marat Shtutman,1 Zvi Bentwich,1 and Paz Einat1,4 mirnas on the move: mirna biogenesis and the RNAi machinery Elizabeth P Murchison and Gregory J Hannon1 The Microprocessor complex mediates the genesis of micrornas Richard I. Gregory*, Kai-ping Yan*, Govindasamy Amuthan, Thimmaiah Chendrimada, Behzad Doratotaj, Neil Cooch & Ramin Shiekhattar The RNAi revolution Carl D. Novina and Phillip A. Sharp

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