CORSO DI PATOLOGIA MOLECOLARE. Prof. Andrea Cabibbo

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1 CORSO DI PATOLOGIA MOLECOLARE Prof. Andrea Cabibbo

2 Domanda Quali sono i 2 principali tipi di DNA Microarrays?

3 Domanda Per quale motivo la tecnologia Affymetrix si avvantagia dalla sequenza del genoma umano?

4 Il problema dell eterogeneita dei campioni di tessuto tumorale negli esperimenti di profiling Quale tecnica consente di ovviare in parte a questa difficolta, consentendo di isolare, da una singola biopsia, le diverse componenti tissutali?

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6 Il circuito regolatorio integrato nelle cellule Hanahan & Weinberg, Cell, 2000

7 P21 RAS

9 P53 è un oncogene? Domande

10 Domande P53 è un oncogene? Basta una copia difettosa o devono essere inattivati entrambe gli alleli?

11 Domande P53 è un oncogene? Basta una copia difettosa o devono essere inattivati entrambe gli alleli? In quale compartimento subcellulare è localizzata la proteina p53

12 p53 p53 has been described as: - The guardian of the genome - The guardian angel gene - Master watchman referring to its role in conserving stability by preventing genome mutation

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14 The central role of p53 in cellular and genetic stability p53 pathway: In a normal cell p53 is inactivated by its negative regulator, mdm2. Upon DNA damage or other stress, various pathways will lead to the dissociation of the p53 and mdm2 complex. Once activated, p53 will either induce a cell cycle arrest to allow repair and survival of the cell or apoptosis to discard the damage cell. How p53 makes this choice is currently unknown.

15 La struttura di p53 in forma tetramerica legata al DNA

16 NB: Le slides seguenti sulle mutazioni di p53 sono state modificate rispetto alla presentazione fatta a lezione. Rappresentano una versione piu precisa del meccanismo delle mutazioni dominanti negative di p53 che sono quelle nel dominio di dimerizzazione (homooligomerization domain, OD). Le mutazioni nel DNA-binding domain sono normali mutazioni loss of function.

17 The p53 protein domains 1. N-terminal transcription-activation domain (TAD), also known as activation domain 1 (AD1) which activates transcription factors: residues activation domain 2 (AD2) important for apoptotic activity: residues Proline rich domain important for the apoptotic activity of p53: residues central DNA-binding core domain (DBD). Contains one zinc atom and several arginine amino acids: residues nuclear localization signaling domain, residues homo-oligomerisation domain (OD): residues Tetramerization is essential for the activity of p53 in vivo. 7. C-terminal involved in downregulation of DNA binding of the central domain: residues [6]

18 Mutazioni nel DNA Binding domain Wild-Type (+) Mutant (-) Le mutazioni nel DNA-Binding domain sono normali mutazioni recessive loss of function e sono le mutazioni di p53 piu frequenti

19 Mutazioni nel dominio di oligomerizzazione Wild-Type (+) OD Mutant (-) Le mutazioni nel dominio di omooligomerizzazione (OD) hanno invece un effetto dominante negativo, in quanto le subunità mutate dimerizzano con quelle wild-type, inattivandole.

20 The dominantnegative effect of p53 mutations in the oligomerization domain (OD) Wild-Type (+) OD Mutant (-) +/- Che succede negli eterozigoti in cui uno degli alleli è mutato nel dominio di oligomerizzazione (OD)?

21 The dominantnegative effect of p53 mutations in the oligomerization domain (OD) Wild-Type (+) OD Mutant (-) +/- Abbiamo il 50% di subunità wild-type e il 50% di subunità mutate nell OD

22 The dominantnegative effect of p53 mutations in the oligomerization domain Wild-Type (+) OD Mutant (-) +/- Le subunità mutate nel dominio di oligomerizzazione (OD) eterodimerizzano con le subunità wild-type inattivandole, presumibilmente interferendo con la corretta formazione dei tetrameri. Il risultato e un effetto dominante negativo. La probabilita che si formi un tetramero corretto e di 1/2x1/2x1/2x1/2= 1/16

23 The dominantnegative effect of p53 mutations in the oligomerization domain Wild-Type (+) OD Mutant (-) L eterozigosi per una mutazione nell oligomerization domain di p53 può avere un effetto molto maggiore dell atteso 50% sull attività globale di p53 nella cellula, per via dell effetto dominante-negativo. Per questo motivo, in associazione ad altre mutazioni, una singola mutazione (in eterozigosi) di p53 puo essere un importante contributo allo sviluppo di un clone tumorale.

24 Some additional information on p53 Human p53 is 393 amino acids long and has seven domains: 1. N-terminal transcription-activation domain (TAD), also known as activation domain 1 (AD1) which activates transcription factors: residues activation domain 2 (AD2) important for apoptotic activity: residues Proline rich domain important for the apoptotic activity of p53: residues central DNA-binding core domain (DBD). Contains one zinc atom and several arginine amino acids: residues nuclear localization signaling domain, residues homo-oligomerisation domain (OD): residues Tetramerization is essential for the activity of p53 in vivo. 7. C-terminal involved in downregulation of DNA binding of the central domain: residues [6] Mutations that deactivate p53 in cancer usually occur in the DBD. Most of these mutations destroy the ability of the protein to bind to its target DNA sequences, and thus prevents transcriptional activation of these genes. As such, mutations in the DBD are recessive loss-of-function mutations. Molecules of p53 with mutations in the OD dimerise with wild-type p53, and prevent them from activating transcription. Therefore OD mutations have a dominant negative effect on the function of p53.

25 P53 e proliferazione cellulare P53 Attivo: - Il gene di p21 viene trascritto (il fattore di trascrizione che stimola la trascrizione di questo gene viene direttamente attivato da p53) - Viene prodotta la proteina p21 - P21 lega la ciclina CDK2 che si inattiva, bloccando la progressione nel ciclo cellulare (arresto proliferativo P53 Inattivo: - Il gene di p21 viene non viene trascritto - la proteina p21 non è presente - CDK2 è attiva e stimola la progressione nel ciclo cellulare

27 Mass Spec e Proteomica, seguito

28 2D Gel electrophoresis Con quale tecnica e possibile identificare uno spot su un gel bidimensionale di proteine?

29 Domanda M A L D I T O F?

30 Domanda M A L D I T O F? A S A E O I F L

31 Domanda M A L D I T O F? A S A E O I F L T S S S N M I

32 Domanda M A L D I T O F? A S A E O I F L T S S S N M I R I E O I E G

33 Domanda M A L D I T O F? A S A E O I F L T S S S N M I R I E O I E G I S R R Z X T P A E T T D I I O O N N

34 Spettrometria di massa MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization combinata con uno spettrometro Time Of Flight) ESI Tandem Mass Spectrometry (Electron Spray Ionization) SELDI-TOF: Surface Enhanced Laser Desorption- Ionization La sensibilita di queste tecniche e dell ordine delle femtomoli

35 Sicurezza aereoportuale

36 Spettrometro portatile (detto il naso )

37 Spettrometro portatile

38 Scentinel e IonScan

39 MALDI-TOF

40 Peptide mass fingerprinting Agenti riducenti + SDS Maldi-TOF Elenco masse molecolari peptidi (fingerprint)

41 Peptide mass fingerprinting

42 Peptide fingerprinting Elenco masse molecolari peptidi (fingerprint/profilo) In genere un profilo corrisponde in maniera univoca ad una particolare proteina, consentendone dunque l identificazione attraverso strumenti bioinformatici. Tipicamente il profilo viene comparato con i profili virtuali di tutte le proteine presenti nelle banche dati disponibili quali genbank, swissprot etc... Negli strumenti moderni tale comparazione puo avvenire in tempo reale e fa parte dell output della macchina. I softwares sono sempre piu sofisticati ed in grado di risolvere anche misture di notevole complessita.

43 La spettrometria di massa consente di identificare le modificazioni posttraduzionali

44 Alcune modificazioni post-traduzionali comuni Fosforilazione (su serina, treonina o tirosina) receptor activation, trasduzione del segnale, regolazione dell attivita proteica Glicosilazione (N-linked, su asparagina / O-linked, su serina o treonina) stabilita, folding, riconoscimento tra cellule Ubiquitinazione degradazione

45 Esempio di ruolo della fosforilazione nell attivazione recettoriale

46 Identificazione di modificazioni post-traduzionali con la spettrometria di massa Kinasi P P P

47 HPLC + Mass Spectrometry E possibile assemblare una linea di analisi in cui l output di una colonna cromatografica viene collegata direttamente all input di uno spettrometro, condentendo quindi l analisi di frazioni anche complesse. I risultati consistono in elenchi di masse di peptidi che possono essere tradotti in liste di proteine, con relative modificazioni post-traduzionali

48 SELDI-TOF: Surface Enhanced Laser Desorption-Ionization Una caratteristica particolarmente interessante di SELDI-TOF e di poter essere applicata alla risoluzione di misture complesse. A seconda del tipo di matrice utilizzata si vedono particolari gruppi di proteine con determinate proprietà fisicochimiche E.F. Petricoin & L.A. Liotta, Trends in Biotechnol. 2002

49 La strategia ICAT (Isotope Coded Affinity Tag) In maniera analoga all ibridazione competitiva di due campioni biologici in un esperimento di microarray, che fornisce informazioni sull abbondanza relativa di un set di mrna, la strategia ICAT consente di comparare l abbondanza di un set di proteine in due campioni, attraverso marcatura differenziale e spettrometria di massa Da B. Martin & P.S. Nelson, Trends in Cell. Biol. 200

50 Una nuova biologia con ricadute cliniche Gli approcci finora descritti, sia per i microarrays che, in particolare, per la proteomica, non sarebbero possibili senza la sequenza completa del genoma relativa all organismo studiato. microarrays affymetrix peptide mass profiling. Giocano un ruolo essenziale anche le tecniche per il trattamento automatizzato dei dati fornite dallo sviluppo della bioinformatica. La disponibilita di questi nuovi strumenti hanno di fatto rivoluzionato l approccio ad una serie di problematiche biologiche consentendo un livello di approfondimento impensabile fino a qualche anno fa. Questi risultati trovano un riscontro non solo nella ricerca di base ma anche nella clinica, dove possono portare nuovi farmaci grazie all identificazione di nuovi pathways e targets molecolari e nuovi metodi diagnostici basati sull identificazione di markers o signatures con un elevata sensibilita e affidabilita

51 Break?

52 Cos e un vaccino?

53 Vaccine definition A preparation of a weakened or killed pathogen, such as a bacterium or virus, or of a portion of the pathogen's structure that upon administration stimulates antibody production or cellular immunity against the pathogen but is incapable of causing severe infection.

54 Quali sono le strategie tradizionali per identificare / produrre un vaccino?

55 Scoperta di vaccini nel secondo millennio. In che modo gli avanzamenti nel campo della genomica e della Biologia Molecolare possono aiutarci a scoprire nuovi vaccini in maniera piu rapida ed efficace?

56 Quanto e grande il genoma di un batterio patogeno?

57 Quanto e grande il genoma di un virus?

58 Quanto e grande il genoma umano?

59 Genome sizes

60 Di quanti microorganismi e nota la sequenza genomica completa?

61 Sequenced Genomes

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64 genomesonline.org

65 Quanto tempo ci vuole per sequenziare interamente il genoma di un nuovo microorganismo patogeno?

66 Vaccini da microorganismi interi attenuati o uccisi Vaccini a subunità Attraverso queste strategie sono stati ottenuti vaccini contro (per citarne solo alcuni): - vaiolo - rabbia - difterite - tetano - febbre gialla - epatite B - influenza - pneumococco - meningococco C - Varie altre patologie e microorganismi

67 Vaccini che funzionano attraverso la stimolazione di una risposta umorale. In questi casi e possibile misurare la risposta al vaccino titolando nel sangue gli anticorpi prodotti contro quel microorganismo o sue componenti (es: epatite B o influenza) Non tutti i trattamenti che stimolano una risposta umorale sono adeguati a combattere alcune infezioni Per alcune patologie o microorganismi e invece necessario stimolare una risposta di tipo cellulare (alcuni esempi: HIV, Malaria, Tubercolosi)

68 Cos e l immunoma?

69 Immunoma