La comunicazione intercellulare: gli ormoni ed i recettori. Copyright (c) by W. H. Freeman and Company

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1 La comunicazione intercellulare: gli ormoni ed i recettori

2 La trasduzione del segnale: processo che converte i segnali extracellulari in risposte cellulari.

3 La comunicazione mediante segnali extracellulari implica sei tappe (1) sintesi della molecola segnale da parte della cellula che trasmette il segnale (2) rilascio della molecola segnale da parte della cellula che trasmette il segnale (3) trasporto della molecola segnale verso la cellula bersaglio (4) riconoscimento della molecola segnale da parte di specifiche proteine recettrici (5) modificazione del metabolismo, della funzione o del differenziamento della cellula avviata dal complesso recettore-molecola segnale (6) rimozione della molecola segnale, che spesso determina la fine della risposta cellulare.

4 Negli animali le molecole segnale agiscono a distanze diverse Comunicazione endocrina: le molecole segnale, ormoni, agiscono su cellule bersaglio distanti dai loro siti di sintesi. Comunicazione paracrina: le molecole segnale rilasciate da una cellula agiscono soltanto su cellule bersaglio localizzate in stretta prossimità (es. neurotrasmettitori) Comunicazione autocrina: le cellule rispondono a sostanze rilasciate da loro stesse. Molti fattori di crescita agiscono in questo modo e le cellule in coltura spesso secernono fattori di crescita che stimolano la propria crescita. Questo tipo di trasmissione del segnale è molto comune tra le cellule tumorali.

5 Negli animali le molecole segnale agiscono a distanze diverse

6 Le proteine recettrici esibiscono specificità di legame per il ligando e specificità di effettore La risposta cellulare indotta da una determinata molecola segnale extracellulare dipende dal suo legame ad una specifica proteina recettrice situata sulla superficie, nel nucleo o nel citoplasma di una cellula bersaglio La molecola segnale (ormone, ferormone, neurotrasmettitore) agisce come ligando che si lega a un sito specifico del recettore. L associazione del ligando al recettore provoca un cambiamento conformazionale del recettore, che dà inizio ad una sequenza di reazioni che portano ad una particolare risposta cellulare. Una proteina recettrice è caratterizzata da una specificità di legame per un particolare ligando, ed il complesso ligando-recettore esibisce una specificità di effettore (cioè media una risposta cellulare specifica).

7 Le proteine recettrici esibiscono specificità di legame per il ligando e specificità di effettore La risposta di una cellula ad un ormone è determinata dal tipo di recettori che la cellula esprime, e dalle reazioni cellulari avviate dal legame dell ormone al recettore. a) Tipi diversi di cellule possono possedere gruppi differenti di recettori per uno stesso ligando, ognuno dei quali evoca una risposta diversa; b) lo stesso recettore può essere localizzato in tipi differenti di cellule, ed il legame di uno stesso ligando può provocare risposte diverse a seconda del tipo cellulare (cellule diverse rispondono in modi differenti ad uno stesso ligando) c) in alcuni tipi di cellule, differenti complessi recettore ligando (es. glucagone e adrenalina negli epatociti) possono indurre la stessa risposta cellulare (es.: degradazione del glicogeno e rilascio di glucosio)

8 La maggior parte degli ormoni appartengono a tre categorie: (1) piccole molecole lipofile che diffondono attraverso la membrana plasmatica ed interagiscono con recettori intracellulari; (2) molecole idrofile che si legano a recettori di superficie; (3) molecole lipofile che si legano a recettori di superficie;

9 Alcuni ormoni si legano a recettori intracellulari; altri a recettori di superficie.

10 Piccole molecole lipofile che si legano a recettori intracellulari Molti ormoni liposolubili diffondono attraverso la membrana plasmatica ed interagiscono con recettori localizzati nel citosol o nel nucleo. I complessi ormone-recettore si legano a sequenze di DNA che controllano la trascrizione, e quindi influenzano l espressione di geni specifici. Gli ormoni di questo tipo comprendono gli steroidi (es.: cortisolo, progesterone, estradiolo, testosterone), la tiroxina e l acido retinoico. Gli ormoni steroidei hanno effetto per ore o giorni.

11 Gli ormoni liposolubili controllano le attività dei recettori nucleari Gli ormoni liposolubili si legano, regolandoli, a specifici fattori di trascrizione che appartengono alla superfamiglia dei recettori nucleari.

12 Molecole segnale che si legano a recettori intracellulari

13 Struttura dei recettori nucleari Regione N-terminale= variabile con domini di attivazione; Dominio di interazione con il DNA = zinc finger C 4 ; Regione C-terminale= dominio che lega l ormone spesso associato a dominio di attivazione ormone-dipendente Talvolta il dominio ormone-dipendente, in assenza di ligando, funziona come dominio di repressione.

14 Interazione con il DNA del dominio a dita di zinco C 4 del recettore per i glucocorticoidi. I recettori nucleari presentano domini a dita di zinco del tipo C 4, generalmente contengono solo due unità (dita) e legano il DNA come omodimeri o eterodimeri.

15 Sequenze consenso dei siti di DNA, chiamate elementi di risposta (response elements) riconosciuti dai principali recettori nucleari. Recettori nucleri omodimerici Recettori nucleri eterodimerici. Uno dei monomeri è il recettore nucleare RXR.

16 Meccanismi di controllo ormonale dell attività del recettore nucleare Quando i recettori nucleari eterodimerici (RXR-VDR, RXR-TR, RXR- RAR) sono legati ai rispettivi siti sul DNA, essi agiscono come repressori o attivatori a seconda che l ormone sia o meno ad essi legato. In assenza dell ormone, determinano la deacetilazione degli istoni nei nucleosomi vicini. In presenza dell ormone il dominio che lega il ligando subisce una variazione conformazionale che fa sì che questi recettori possano dirigere l iperacetilazione degli istoni nei nucleosomi vicini. In queste condizioni il dominio di attivazione N-terminale interagisce con altri fattori e stmola la formazione del complesso di inizio della trascrizione.

17 Il legame del ligando altera la conformazione del dominio che lega il ligando dei recettori nucleari umani In assenza del ligando (acido retinoico 9-cis), il dominio di legame del ligando dell RARα umano ha una conformazione aperta (a). Quando è legato al ligando il dominio di legame del ligando del RARγ umano ha una conformazione compatta (b)

18 Meccanismi di controllo ormonale dell attività dei recettori nucleari omodimerici Al contrario dei recettori eterodimerici, che sono localizzati esclusivamente nel nucleo, I recettori nucleari omodimerici sono sia nel citoplasma che nel nucleo. L attività dei recettori nucleari omodimerici è regolata dal controllo del loro trasporto dal citoplasma al nucleo. Il trasporto all interno del nucleo è ormone-dipendente. In assenza dell ormone il recettore è ancorato al citoplasma in un grande aggregato proteico complessato con proteine inibitorie tra cui Hsp90.

19 Il legame dell ormone stacca il recettore per i glucocorticoidi dalla sua ancora citoplasmatica permettendogli di entrare nel nucleo.

20 Modello dell attivazione genica dipendente dagli ormoni mediata dal recettore per i glucocorticoidi (GR)

21 Ormoni solubili in acqua che si legano a recettori di superficie Le molecole segnale solubili in acqua non possono diffondere attraverso la membrana plasmatica e si legano a recettori di superficie. Questa ampia classe di molecole segnale è divisa in due gruppi 1) ormoni peptidici (es.: insulina, glucagone, fattori di crescita) 2) piccole molecole cariche che derivano dagli amminoacidi e che agiscono sia come ormoni che come neurotrasmettitori (es.: adrenalina, istamina) Gli effetti prodotti dal legame di questo tipo di ormoni ai recettori di superficie sono generalmente quasi immediati, ma durano solo un breve intervallo di tempo.

22 Struttura di piccole molecole che agiscono da neurotrasmettitori

23 Ormoni lipofili che si legano a recettori di superficie. I principali ormoni liposolubili che si legano a recettori di superficie sono le prostaglandine. Le prostaglandine fanno parte di una famiglia di ormoni a venti atomi di C, chiamati ormoni eicosanoidi, che vengono sintetizzati a partire d un precursore comune, l acido arachidonico. L acido arachidonico è prodotto a partire da fosfolipidi e diacilglicerolo.

24 Eicosanoidi

25 I recettori di superficie possono essere suddivisi in quattro classi principali Recettori accoppiati a proteine G Recettori canali ionici Recettori accoppiati alla tirosina chinasi Recettori con attività enzimatica intrinseca

26 Recettori accoppiati a proteine G Recettori accoppiati a proteine G (G protein-coupled receptors, GPCR): il legame del ligando attiva una proteina G, che a sua volta stimola o inibisce un enzima che produce uno specifico secondo messaggero o modula un canale ionico. Es. Recettori per l adrenalina, la serotonina, il glucagone.

27 Recettori canali ionici Recettori canali ionici: il legame del ligando modifica la conformazione del recettore in modo tale che specifici ioni possano fluire attraverso esso. In tal modo viene alterato il potenziale elettrico della membrana. Es.: recettori per l acetilcolina nelle giunzioni neuromuscolari.

28 Recettori accoppiati alla tirosina chinasi Recettori accoppiati alla tirosina chinasi: questi recettori sono privi di attività catalitica intrinseca, ma il legame del ligando induce la formazione di un recettore dimerico che interagisce con ed attiva una o più tirosina chinasi citosoliche. Es.: recettori per molte citochine, per gli interferoni e per alcuni fattori di crescita.

29 Recettori con attività enzimatica intrinseca Recettori con attività enzimatica intrinseca: recettori con attività catalitica intrinseca che viene stimolata dal legame del ligando. Alcuni catalizzano la conversione del GTP in cgmp; altri hanno attività fosfatasica. I recettori per l insulina e molti fattori di crescita possiedono attività di proteina chinasi. Generalmente il ligando si lega sotto forma di dimero, induce la dimerizzazione del recettore e ne stimola l attività tirosina chinasica. Recettori tirosina chinasi (receptor tyrosine kinase, RTK)

30 Gli effetti di molti ormoni sono mediati da secondi messaggeri Il legame di ligandi a molti recettori di superficie porta ad un aumento (o ad una diminuzione) di breve durata della concentrazione di molecole segnale intracellulari, chiamate secondi messaggeri.

31 AMP ciclico

32 I secondi messaggeri L aumento della concentrazione intracellulare di uno o più secondi messaggeri, causato dal legame dell ormone, avvia una modificazione dell attività di uno o più enzimi o proteine non enzimatiche. La degradazione (o rimozione) del ligando del secondo messaggero, o l inattivazione del complesso ligando-recettore, determina la conclusione della risposta cellulare.

33 Altre proteine conservate da un punto di vista evolutivo agiscono nella trasduzione del segnale Proteine interruttore (switch protein) con attività GTPasica Proteine chinasi Proteine di raccordo

34 Proteine interruttore (switch protein) con attività GTPasica Un ampio gruppo di proteine che legano il GTP agiscono come interruttori molecolari. Segnale Queste proteine sono accese quando sono legate al GTP e spente quando sono associate al GDP. Due classi di switch protein con attività GTPasica: a) le proteine G trimeriche b) le proteine monomeriche Ras o..ras-simili Le switch protein presentano regioni che promuovono l attività di specifiche proteine per interazione diretta proteina-proteina. Le proteine G trimeriche sono associate direttamente ai recettori attivati, mentre Ras solo indirettamente

35 Proteine chinasi L attivazione di tutti i recettori di superficie provoca variazioni del grado di fosforilazione di alcune proteine attraverso l attivazione di proteine chinasi. Due tipi di proteine chinasi: a) quelle che fosforilano la tirosina b) quelle che agiscono sulla serina o sulla treonina

36 Proteine di raccordo (adattatori) Molte vie di trasduzione del segnale contengono grandi complessi multiproteici che sono mantenuti insieme da proteine di raccordo. Domini SH2 e PTB si legano a residui di fosfotirosina Domini SH3 legano sequenze ricche in prolina Le proteine di raccordo non sono dotate di attività catalitica nè attivano direttamente le proteine effettrici, ma possiedono domini che funzionano come siti di aggancio per altre proteine

37 Le medesime vie di trasmissione del segnale possono essere attivate da recettori diversi

38 La sintesi, il rilascio e la degradazione degli ormoni vengono finemente regolati

39 Recettori accoppiati a proteine G e loro effettori Nei mammiferi, molti differenti recettori di superficie sono accoppiati a proteine G trimeriche che trasducono il segnale. Il legame dei ligandi ai recettori attiva le proteine G ad essi associate, che a loro volta stimolano un enzima effettore che catalizza la sintesi di un secondo messaggero. L ampia famiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCRs) comprende i recettori attivati dalla luce (rodopsine) presenti nell occhio, i recettori olfattivi localizzati nel naso e numerosi recettori per vari ormoni. Benchè questi recettori siano attivati da ligandi diversi, stimolano vie simili di trasmissione del segnale.

40 Tutti i recettori GPCR contengono sette regioni transmembrana ed hanno il segmento N-terminale sulla superficie esoplasmatica e quello C-terminale sulla superficie citosolica della membrana

41 Recettori per le catecolammine un esempio di recettori accoppiati a proteine G I recettori per le catecolammine legano l adrenalina e la noradrenalina, prodotti della medulla del surrene. Proteine G trimeriche sono associati a questi recettori e trasducono il segnale L adeninato ciclasi sintetizza il secondo messaggero

42 Recettori per le catecolammine un esempio di recettori accoppiati a proteine G L adrenalina, che media la risposta dell organismo alle situazioni di stress, si lega a 2 tipi di GPCR: i recettori β-adrenergici (β 1 e β 2 ) ed i recettori α-adrenergici (α 1 e α 2 ). Il legame dell adrenalina ai recettori β-adrenergici delle cellule epatiche ed adipose induce la liberazione del glucosio e degli acidi grassi; Il legame dell adrenalina ai recettori β-adrenergici delle cellule muscolari cardiache aumenta la frequenza cardiaca; Il legame dell adrenalina ai recettori β-adrenergici delle cellule muscolari lisce dell intestino porta alla loro distensione; Il legame dell adrenalina ai recettori α-adrenergici delle cellule che rivestono i vasi sanguigni del tratto intestinale, della pelle e dei reni causa vasocostrizione; Adrenalina = rifornimento di energia necessaria per i movimenti rapidi dei principali muscoli scheletrici in risposta a condizioni di stress.

43 Recettori per le catecolammine, un esempio di recettori accoppiati a proteine G i recettori β- ed α-adrenergici sono accoppiati a proteine G diverse. Sia i recettori β 1 che i β 2 sono associati a proteine G (G s ) che attivano l adenilato ciclasi I recettori α 1 e α 2 -adrenergici sono invece accoppiati rispettivamente a G q e G i G i inibisce l adenilato ciclasi, G q stimola la fosfolipasi C in modo da produrre IP3 e DAG

44 L attivazione dei recettori β-adrenergici porta ad un aumento del livello di camp IP = Isoproterenolo La K D per il legame dell adrenalina e di altre catecolamine ai recettori β- adrenergici è molto simile alla concentrazione del ligando che induce una attivazione semi-massimalecopyright dell adenilato (c) by W. H. Freeman and cilcasi Company

45 I recettori β-adrenergici mediano l attivazione della sintesi di camp avviata dall adrenalina

46 Sono state identificate le caratteristiche fondamentali delle catecolammine e dei loro recettori. La catena laterale che contiene il gruppo NH determina l affinità del ligando per il recettore

47 Sono state identificate le caratteristiche fondamentali delle catecolammine e dei loro recettori. L anello catecolico è necessario perché il ligando possa indurre l aumento l di camp X X X

48 Sono state identificate le caratteristiche fondamentali delle catecolammine e dei loro recettori. La catena laterale che contiene il gruppo NH determina l affinità del ligando per il recettore L anello catecolico è necessario perché il ligando possa indurre l aumento di camp

49 I recettori β 1 -e β 2 - adrenergici, importanti target farmacologici Nell uomo i recettori β 1 -e β 2 - adrenergici sono localizzati su tipi cellulari diversi e differiscono per la loro affinità relativa nei confronti di varie catecolamine. β 1 - adrenergici - affinità isoproterenolo > noradrenalina > adrenalina - fibre muscolari cardiache - promuovono l aumento della frequenza e della forza di contrazione cardiaca. Farmaci antagonisti selettivi dei recettori β 1 - adrenergici (es.: practololo, β bloccanti) sono utilizzati nelle aritmie cardiache e nell angina per diminuire la forza di contrazione cardiaca. β 2 - adrenergici - affinità isoproterenolo >> noradrenalina = adrenalina - fibre muscolari lisce dei dotti bronchiali; - promuovono la distensione delle fibre muscolari Farmaci agonisti selettivi dei recettori β 2 - adrenergici sono utilizzati nel trattamento dell asma.

50 Modello del complesso formato dall isoprotenerolo con il recettore β 2 -adrenergico. Studi effettuati con forme mutanti dei recettori β-adrenergici hanno identificato 4 residui amminoacidici, localizzati nelle eliche transmembrana 3, 5 e 6 che intervengono nel legame con l agonista isoproterenolo.

51 Il legame del ligando al recettore porta all attivazione della proteina G Modello: in seguito al legame del ligando, con il recettore alcune eliche si spostano (eliche 5 e 6), portando ad una modificazione conformazionale dell ansa che le unisce. L ansa si può quindi legare ed attivare la proteina G

52 Identificazione dei domini funzionali dei recettori accoppiati a proteine G Esperimenti condotti in ovociti di Xenopus

53 L aumento del livello intracellulare di camp è il risultato dell attivazione dell enzima adenilato ciclasi

54 La struttura dell adenilato ciclasi

55 Le proteine G s trimeriche sono accoppiate ai recettori β- adrenergici e all adenilato ciclasi Il collegamento tra il legame dell ormone ad un dominio extracellulare del recettore β -adrenergico e l attivazione dell adenilato ciclasi è fornito dalla proteina G s, che funziona da trasduttore del segnale. Le proteine G s sono costituite da 3 subunità chiamate α, β e γ.

56 Le proteine G s trimeriche mettono in comunicazione i recettori β-adrenergici e l adenilato ciclasi

57 Amplificazione del segnale ormonale L amplificazione del segnale ormonale è possibile perchè sia i recettori che le proteine G s possono diffondere rapidamente nella membrana plasmatica. 1 complesso ormone-recettore attiva 100 molecole G s. Ogni G sα.gtp attiva 1 molecola di adenilato ciclasi 1 molecola di adenilato ciclasi sintetizza molte molecole di camp durante tutto il tempo in cui il complesso G sα. GTP è legato all enzima

58 Terminazione della risposta cellulare La risposta della cellula bersaglio si conclude rapidamente non appena la concentrazione dell ormone diminuisce. La terminazione della risposta è favorita dalla diminuzione dell affinità del recettore per il ligando quando G s viene convertita nella forma attiva. Il GTP legato a G sα viene rapidamente idrolizzato interrompendo l attivazione dell adenilato ciclasi. La risposta termina a meno chè la concentrazione dell ormone non rimanga alta per formare nuovi complessi ormone-recettore. E necessario che l ormone sia sempre presente per mantenere attiva l adenilato ciclasi.

59 L adenilato ciclasi viene stimolata ed inibita da diversi complessi recettore-ligando. Il complesso G sα. GTP stimola l adenilato ciclasi Il complesso G iα. GTP inibisce l adenilato ciclasi

60 Alcune tossine batteriche modificano in modo irreversibile le proteine G La subunità α della tossina colerica, addiziona l ADPribosio del NAD + alla subunità α di G s. Questa modificazione irreversibile impedisce l idrolisi del GTP, bloccando la G sα nello stato attivo. La tossina della pertosse, prodotta dal batterio Bordetella pertussis, addiziona ADP-ribosio alla subunità α di G i. Questa modificazione irreversibile impedisce il rilascio del GDP, bloccando la G iα nello stato inattivo.

61 Le modificazioni indotte in G sα favoriscono la sua dissociazione da G βγ e la sua associazione all adenilato ciclasi Recenti studi di cristallografia ai raggi X hanno mostrato il modo in cui le subunità dalla proteina G trimerica interagiscono tra loro, con un recettore attivato e con l adenilato ciclasi. Questo ha contribuito a comprendere: a) il modo in cui il legame del GTP provoca la dissociazione di G α da G βγ ; b) come G α si associa con l adenilato ciclasi; c) le differenze strutturali tra G sα e G iα che fanno in modo che l una attivi e l altra inibisca l adenilato ciclasi.

62 Struttura di una proteina G trimerica legata al GDP Nella forma associata al GDP, la subunità α (verde) e la subunità β (giallo) interagiscono l una con l altra, così come le subunità β e γ. La regione N-terminale e 2 regioni dette interruttore 1 e 2 di Gα interagiscono con Gβ. La subunità γ (rosso) non è in contatto con la subunità α. Le subunità α e γ sono ancorate alla membrana da code lipidiche I domini N- e C-terminale di G α interagiscono con il recettore attivato, determinando una modificazione conformazionale che induce il rilascio del GDP ed il legame del GTP. L associazione del GTP induce un estesa modificazione conformazionale delle regioni interruttore di G α che provoca la dissociazione da G βγ.

63 Struttura di G sα GTP complessato con due frammenti che contengono il dominio catalitico dell adenilato ciclasi. Adenilato ciclasi Forskolina = agonista dell adenilato ciclasi che stabilizza i frammenti catalitici nelle conformazioni attive.

64 L adenilato ciclasi

65 Struttura di G sα GTP complessato con due frammenti che contengono il dominio catalitico dell adenilato ciclasi. L ansa amminoacidica α3-β5 e l elica dell interruttore II di Gs α -GTP interagiscono con l adenilato ciclasi attivandola. La conformazione di Gs α indotta dal GTP che favorisce la dissociazione da G βγ, è anche necessaria per il legame all adenilato ciclasi. L idrolisi del GTP catalizzata dall attività GTPasica intrinseca di Gs α induce una nuova variazione conformazionale che porta alla dissociazione dall adenilato ciclasi e la riassociazione con G βγ. L attività GTPasica agisce come un timer che controlla la durata dell interazione con l effettore. La forskolina blocca i frammenti dell adenilato ciclasi nella conformazione attiva G iα si lega a regioni diverse dell adenilato ciclasi e ciò spiega i diversi effetti che provoca sull effettore.

66 Il livello intracellulare di camp è regolato anche dall idrolisi a 5 -AMP da parte della camp fosfodiesterasi

67 Recettori tirosina chinasi e proteine Ras

68 Recettori tirosina chinasi e proteine Ras I recettori tirosina chinasi (RTK) riconoscono ormoni peptidici/proteici solubili o legati alla membrana che agiscono come fattori di crescita (es.: NGF, PDGF, FGF, EGF, insulina). Il legame di un ligando stimola l intrinseca attività proteina-tirosina chinasi del recettore, che successivamente attiva una cascata di reazioni per la trasduzione del segnale che porta a modificazioni della fisiologia cellulare e/o dell espressione genica. Le vie di trasmissione del segnale attivate dagli RTK sono coinvolte nella regolazione della moltiplicazione e del differenziamento cellulari, la promozione della sopravvivenza delle cellule e la modulazione del metabolismo cellulare. Gli RTKs trasmettono il segnale ormonale a Ras, una switch protein con attività GTPasica che trasmette il segnale ai componenti a valle della via di trasduzione del segnale.

69 Il legame del ligando provoca l autofosforilazione degli RTK

70 Il legame del ligando provoca l autofosforilazione degli RTK Alcuni RTK (es. Recettore per l insulina) esistono sotto forma di dimeri anche in assenza del ligando; il legame del ligando induce una variazione conformazionale che attiva la chinasi; L attività chinasica di ogni subunità del recettore dimerico fosforila dapprima residui di tirosina localizzati in prossimità del sito catalitico Successivamente vengono autofosforilati i residui di tirosina di altre regioni del dominio citosolico; Le fosfotirosine servono come Copyright siti (c) by di W. aggancio H. Freeman and Company per proteine di raccordo contenenti domini SH2 e PTB;

71 Alternanza ciclica della proteina Ras tra la forma inattiva, legata al GDP, e la forma attiva, legata al GTP. Ras èunaswitch protein che lega il GTP come la subunità Gα delle proteine G. Ras si alterna tra uno stato attivo acceso, in cui è legataal GTP, ed uno stato inattivo spento, in cui è legata al GDP L attivazione di Ras è accellerata da una proteina chiamata fattore di scambio dei nucleotidi guaninici (guanine nucleotideexchange factor, GEF), che si lega al complesso Ras-GDP e provoca la dissociazione del GDP. L inattivazione di Ras richiede l intervento di una proteina che attiva la GTPasi (GTPase-activating protein, GAP), che si lega al complesso Ras-GTP ed aumenta la sua intrinseca attività GTPasica di un centinaio di volte.

72 Ras e Gα appartengono alla superfamiglia di switch protein intacellulari con attività GTPasica Regione ras simile Dominio ad elica La proteina Ras (circa 170 aa) è più piccola delle proteine Gα (circa 300 aa) ma la sua struttura tridimensionale è simile a quella del dominio GTPasico di Gα. Gα contiene anche un dominio ad elica che sembra funzionare come la GAP nell aumentare la velocità di idrolisi del GTP. L interazione diretta tra un recettore GPCR attivato e Gα promuove il rilascio del GDP ed il legame del GTP, rendendo non necessario l intervento di un fattore di scambio.

73 Indicazioni sperimentali che Ras agisce a valle degli RTK in una comune via di trasduzione del segnale. Microiniezioni di anticorpi anti-ras inibiscono la moltiplicazione di fibroblasti in coltura indotta dal trattamento con il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) ed il fattore di crescita dell epidermide (EGF). In assenza di fattori di crescita, iniezioni di proteine Ras mutanti costitutivamente attive (prive di attività GTPasica, Ras D ) inducono la moltiplicazione cellulare. L addizione del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) a cellule in coltura provoca un aumento della proporzione di proteine Ras presenti nella forma attiva legata al GTP

74 Una proteina di raccordo ed il GEF accoppiano la maggior parte degli RTK attivati alle proteine Ras Due proteine citosoliche, GRB2 e Sos, forniscono i collegamenti tra il recettore per l EGF attivato e Ras. Un dominio SH2 di GRB2 si lega ad uno specifico residuo di fosfotirosina del recettore attivato. GRB2 contiene anche 2 domini SH3 che si legano ed attivano Sos. GRB2 funziona quindi come proteina di raccordo per il recettore per l EGF Sos è una proteina di scambio dei nucleotidi guaninici (GEF) che contribuisce alla conversione della proteina Ras inattiva, legata al GDP, nella forma attiva, legata al GTP.

75 Attivazione della proteina Ras in seguito al legame di un ormone ad un RTK Ancora farnesilica

76 L analisi genetica di mutanti dello sviluppo dell occhio della Drosophila ha fornito informazioni sulle vie di trasmissione del segnale attivate dagli RTK L occhio della Drosophila è formata da oltre 800 unità ottiche dette ommatidi. Ogni ommatidio è formato da 22 cellule, 8 delle quali sono neuroni sensibili alla luce (fotorecettori R1-R8)

77 L RTK Sevenless Wild-type 8 fotorecettori mutante sevenless 7 fotorecettori (-R7) L RTK Sevenless (Sev) regola in modo specifico il differenziamento della cellula R7. Nei moscerini con il gene mutante sevenless (sev), la cellula R7 di ogni ommatidio non si differenzia. Il fotorecettore R7 è necessario per la percezione della luce ultravioletta - I mutanti privi di R7 possono essere facilmente individuati

78 L RTK Sevenless Durante lo sviluppo larvale delle Drosophila wild type, le cellule R8 esprimono una proteina di membrana, chiamata Boss (Bride of sevenless), che si lega al RTK Sev localizzato sulla superficie della cellula adiacente. Questa interazione induce modificazioni dell espressione genica che provocano il differenziamento del precursore in una cellula R7 funzionale

79 Analisi genetica dell induzione del fotorecettore R7 nell occhio di Drosophila (a)

80 Analisi genetica dell induzione del fotorecettore R7 nell occhio di Drosophila (b) L analisi di mutanti Ts del gene sevenless ha permesso di isolare i geni che codificano per tre importanti proteine della via attivata da RTK Sev: Una proteina Ras (80% omologia con proteina dei mammiferi) Un GEF chiamato Sos (Son of sevenless) (45% omologia con il GEF di topo) Una proteina di raccordo che contiene un dominio SH2 (64% omologia con le GRB2 dell uomo) Ipotesi di lavoro: Ad una temperatura intermedia tra quella tollerata e quella non tollerata dalla proteina Sev, i moscerini che portano, oltre alla mutazione sev ts una mutazione recessiva in un altro gene coinvolto nella stessa via di trasduzione del segnale saranno privi di cellule R7.

81 Analisi genetica dell induzione del fotorecettore R7 nell occhio di Drosophila (c)

82 Il cdna umano codificante per la proteina GRB2 è stato identificato utilizzando la strategia della clonazione in librerie di espressione Vettore λgt11 modificato per esprimere alti livelli della proteina β-galattosidasi Come sonda è stato utilizzato un frammento fosforilato dell EGFR umano Il gene identificato codificava per una proteina (GRB2) omologa alla proteina di raccordo contenente il dominio SH2 identificata nella via attivata da RTK Sev indrosophila

83 GRB2, una proteina di raccordo

84 Il dominio SH2 di GRB2 si lega ad uno specifico residuo di fosfotirosina di un RTK attivato GRB2 e le proteine di raccordo simili si legano a diversi residui di fosfotirosina degli RTK per mezzo del dominio SH2 (dominio 2 omologo a Src, Src omology 2). I domini SH2 hanno struttura molto simile ma ognuno si lega ad una distinta sequenza amminoacidica adiacente ad un residuo di fosfotirosina. La sequenza di ogni dominio SH2 individua gli specifici residui di fosfotirosina a cui il dominio si lega. La fosfotirosina (P-Tyr) e l isoleucina (Ile) si inseriscono in due solchi sulla superficie del dominio SH2