Il controllo analitico degli OGM

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2 Il controllo analitico degli OGM

3 Problematiche analitico metodologiche nella tracciabilità degli OGM INDIVIDUAZIONE: l obiettivo è di determinare se un prodotto contiene OGM o no (non da notizie sul tipo di OGM); IDENTIFICAZIONE: lo scopo è di identificare i diversi OGM presenti nel campione e verificare se essi siano autorizzati o no; QUANTIFICAZIONE DI OGM: lo scopo è di determinare la quantità dell OGM presente e valutarne la conformità con la normativa attuale.

4 Metodologie per il rilevamento di OGM Metodi fenotipici per il rilevamento di OGM Reazione immunologica con anticorpi specifici (saggio ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Metodi di rilevamento basati sul DNA: Amplificazione del DNA mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) convenzionale Amplificazione del DNA mediante PCR real time Tecnologie Micro-array

5 Metodi fenotipici per il rilevamento di OGM contenenti i geni marcatori bar e pmi;

6 Metodi fenotipici per il rilevamento di OGM contenenti il gene marcatore bar

7 Metodi fenotipici per il rilevamento di OGM contenenti il gene marcatore pmi PIANTE WILD-TYPE (prive di PMI) Mannosio Mannosio-6P Blocco Glicolisi PIANTE TRANSGENICHE (contenenti il PMI) pmi Fruttosio-6P Mannosio-6P Mannosio Inibizione Crescita Glicolisi Il gene pmi può essere utilizzato come marcatore per la selezione di piante transgeniche perché ne permette la sopravvivenza in presenza di mannosio

8 Metodi fenotipici per il rilevamento di OGM contenenti il gene marcatore pmi Saggio d espressione con il Clorofenolo Rosso (CPR) CPR = indicatore di ph; a ph 6 colore rosso PMI (Terreno selettivo + 50 mg/ L CPR) NON TRASFORMATI: inibizione crescita TRASFORMATI: rilascio metaboliti acidi

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11 Metodi per il rilevamento di OGM: test ELISA

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13 DIAGNOSTICA degli OGM negli ALIMENTI TEST sulle PROTEINE TEST sul DNA Rilevazione immunologica della proteina codificata dal transgene (ELISA) Ricerca del transgene e di sequenze ad esso correlate (Real-time PCR) - Quali- / quantitativo - Rapido -Test da campo - Richiede materie prime non lavorate - L espressione delle proteine è spesso tessuto-specifica e sviluppo-dipendente - Quali- / quantitativo - Rapido - Sensibile (limite = %) - Degradazione del DNA - Presenza di inibitori della polimerasi - - Possibili contaminazioni con DNA estraneo Non tutti i derivati alimentari contengono DNA (es. olio di semi di mais)

14 GENI BERSAGLIO nell analisi qualitativa degli alimenti Elementi caratteristici dei costrutti ricombinanti Promotore CaMV 35S Transgene tnos Gene marcatore Promotore CaMV 35S Amplificazione di una delle seguenti sequenze: tnos PCR QUALITATIVA Individuazione del transgene Gene marcatore Amplificazione di geni sicuramente presenti nel campione (es. lectina della soia, zeina del mais) (è disponibile una banca dati che contiene tutte le sequenze di DNA depositate nei brevetti a livello mondiale) PCR QUANTITATIVA

15 ITER per il RILEVAMENTO di OGM negli alimenti mediante TEST sul DNA I STEP Analisi qualitativa (screening) Rivela la presenza/assenza dell OGM nel campione Si ricerca la presenza di sequenze regolatrici comuni alla maggior parte degli OGM risultato positivo risultato negativo Si identifica il transgene presente, verificando se è uno di quelli autorizzati in commercio L analisi si arresta Nessun transgene autorizzato Alimento illegale Transgene autorizzato II STEP Analisi quantitativa Se i singoli ingredienti superano la percentuale dell 1% scatta l obbligo di riportarne la presenza in etichetta

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17 Metodi di rilevamento basati sul DNA: Amplificazione del DNA mediante PCR convenzionale

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19 Metodi di rilevamento basati sul DNA: Amplificazione del DNA mediante PCR convenzionale 2,7 Kbp bar 2,0 Kbp pmi Digestione enzimatica

20 PCR detection of pmi gene utilizzando primer che amplificano nella sequenza promotrice e nella sequenza terminatrice

21 regione codificante M PCR detection of pmi gene utilizzando primer che amplificano nella sequenza codificante. M

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27 QUANTIFICAZIONE del PRODOTTO di PCR Identificando il primo ciclo della PCR in corrispondenza del quale inizia l amplificazione esponenziale del prodotto è possibile quantificare la concentrazione iniziale del DNA bersaglio. Curva di fluorescenza di campioni a concentrazione nota Fluorescenza copie Estrapolazione della curva standard copie linea di base Numero cicli La linea di base identifica il ciclo in corrispondenza del quale inizia l aumento esponenziale della fluorescenza per ciascun campione. N. cicli Log concentrazione Riportando in grafico il valore di intersezione con la linea di base in funzione del Log della concentrazione iniziale di ciascun campione si ottiene la curva standard da cui si può estrapolare il valore della concentrazione di campioni a titolo ignoto.

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32 Identificazione di specifici costrutti genici.

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38 2 ESEMPI di QUANTIFICAZIONE... Mais Bt Il mais-bt è stato reso resistente alla piralide mediante l inserimento di un gene che codifica per una tossina insetticida derivata dal batterio Bacillus turingiensis la cui ingestione provoca la morte delle larve paralizzandone l intestino. Soia Roundup Ready La soia Roundup Ready (Monsanto) è stata modoficata geneticamente per resistere alla somministrazione del glifosato, un diserbante ad ampio spettro. Per quantificare mais e soia transgenici negli alimenti sono state opportunamente disegnate combinazioni di Sonde di Ibridazione che riconoscono tanto il transgene quanto un gene endogeno, rendendo possibile quantificare simultaneamente sia il contenuto di mais/soia GM che di mais/soia totale nel campione in analisi. Sonda 1 specifica per il transgene cryia(b), codificante per la tossina Sonda 2 specifica per il gene endogeno codificante per l enzima invertasi Sonda 1 specifica per il transgene CP4-EPSPS Sonda 2 specifica per il gene endogeno codificante per la lectina

39 OGM non autorizzati nell Unione Europa Si possono presentare due casi: Sono disponibili le informazioni sulle sequenze eimaterialidiriferimento:inquestocasosi possono sviluppare protocolli analitici specifici qualitativi o quantitativi. Mancano le informazioni sulle sequenze e i materiali di riferimento: in questo caso si possono adottare due strategie: Metodo diretto Metodo indiretto

40 Fig. 2 - Tecnica di analisi A FLP Estrazione del DNA Marcatori AFLP DOPPIA DIGESTIONE Endonucleasi EcoRI e MseI 5 AA TTC T 3 3 G A A T 5 LIGAZIONE DEGLI adattatore (ds) EcoRI TTAA 5 ADATTATORI adattatore (ds) MseI 5 TA 5 AA TTCN N TTA 3 3 TTAAGN NAAT 5 PREAMPLIFICAZIONE primer EcoRI +1 -A SELETTIVA DNA polimerasi: primer MseI +1 -C Primer che amplifica nel promotore o terminatore A 5 AATTCN NTTA 3 3 TTAAGN NAAT 5 C Cicli term ici 5 AATTCA GTTA 3 3 TTAAGT C AAT 5 AM PLIFICAZIONE primer EcoRI +3 AAC SELETTIVA DNA polimerasi primer MseI +3 CAA AAC 5 AATTCNNN NNNTTA 3 3 TTAAGNNN NNNAAT 5 AAC Cicli term ici 5 AATTCAAC TTGTTA 3 3 TTAAGTTG AACAAT 5

41 Tecnologia micro-array

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44 Analisi sementi L individuazione di sementi transgeniche è già ora problematica e lo diventerà ancor più in futuro poiché non si tratta di rintracciare un numero limitato di prodotti transgenici autorizzati, ma tutti i prodotti transgenici che sono stati o saranno sviluppati a livello mondiale.

45 Analisi sementi L analisi dei lotti di semente convenzionale può essere mirata a determinare : a) La presenza di seme GM (analisi qualitativa). b) La percentuale di semi GM (analisi quantitativa).

46 Campionamento delle sementi Lotto: quantità di seme fisicamente identificabile e uniforme, di peso non superiore a quello stabilito dalle norme (Allegato IA del DM Metodi ufficiali per l analisi delle sementi, e Allegato II del DPR 8 ottobre 1973, n. 1065), a cui si riferisce un certificato di analisi. Campione: la quantità di seme prelevata da un lotto per rappresentare il lotto stesso. Un campione rappresentativo contiene nella stessa proporzione tutti i costituenti del lotto. Campione elementare: la quantità di seme che proviene da ogni singolo prelievo. Campione globale: la quantità di seme che si ottiene unendo e mescolando tutti i campioni elementari. Campione medio finale di prelevamento: la quantità di seme prelevata con opportuni metodi dal campione globale, che viene inviata al laboratorio. Dal campione globale si possono prelevare più campioni medi finali a seconda delle finalità del campionamento.

47 Analisi sementi Affinché i risultati delle analisi siano affidabili e ripetibili, è necessario che: il lotto di sementi sia sufficientemente omogeneo. il campione di sementi sia rappresentativo del lotto. la percentuale di falsi positivi e falsi negativi del saggio analitico impiegato sia prossima a zero. il laboratorio è tenuto a dimostrare l effettiva buona performance del metodo attraverso la partecipazione a programmi di controllo di qualità ( referee test ) e l utilizzo di materiali di riferimento appropriati.

48 LINEE GUIDA PER IL CAMPIONAMENTO E L ANALISI DELLE COLTURE Può essere necessario procedere a campionamento e analisi di colture in atto allo scopo di verificare la presenza di piante transgeniche provenienti da lotti di semente certificati. Analisi di materiale vegetale proveniente da colture in atto possono rendersi necessarie od essere richieste dalle autorità di controllo anche in caso di utilizzo di materiale commercializzato per scopi diversi (ad esempio granella per uso zootecnico) o di seme riprodotto in azienda.

49 Espressione dei risultati e certificato di analisi I risultati sono riferiti alla soglia sulla quale è basato il piano di lavoro utilizzato; il valore della soglia deve essere indicato sul certificato di analisi. Sul certificato di analisi devono essere riportati: ilnumerodisemianalizzatie,informasintetica,ilpianodi analisi adottato con i risultati relativi alle varie fasi (dati grezzi) la tipologia analitica ed il metodo utilizzato (ad esempio PCR qualitativa, promotore 35S )

50 Espressione dei risultati e certificato di analisi Come previsto dai metodi ufficiali nazionali e internazionali il certificato di analisi deve riportare anche le seguenti informazioni: identificazione del laboratorio che ha effettuato le analisi. identificazione del responsabile del campionamento. identificazione del campione attraverso il numero o codice univoco assegnato dal laboratorio. Identificazione del lotto di semente da cui il campione è stato prelevato, riportando specie, varietà, numero di partita e di lotto, peso del lotto e nome del produttore (inteso come il responsabile della lavorazione del seme e del confezionamento del lotto). Devono essere inoltre rispettate le seguenti norme di ordine generale: il certificato originale è unico e tutte le eventuali copie stampate o prodotte devono essere contrassegnate come tali. il certificato deve essere firmato dal responsabile del laboratorio o da un suo delegato.

51 Dal 1996 la UE ha autorizzato l immissione in commercio di 13 varietà transgeniche In ITALIA non è possibile coltivare nessuna delle piante autorizzate in Europa.

52 LEGGE 28 gennaio 2005, n.5 Conversione in legge, con modificazioni, del decreto-legge 22 novembre 2004, n.279, recante disposizioni urgenti per assicurare la coesistenza tra le forme di agricoltura transgenica, convenzionale e biologica Coesistenza La coesistenza tra le colture transgeniche, convenzionali e biologiche è realizzata in modo da tutelarne le peculiarità e le specificità produttive e, per quanto riguarda le caratteristiche delle relative tipologie di sementi, in modo da evitare ogni forma di commistione tra le sementi transgeniche e quelle convenzionali e biologiche.

53 Conclusioni La tracciabilità e l individuazione di OGM in sementi, prodotti alimentari e mangimi può essere effettuata mediante protocolli analitici basati su Metodi fenotipici PCR e Real Time PCR ELISA la tecnologia micro-array

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