SAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A Corso di Laboratorio di Biofotonica

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1 SAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A Corso di Laboratorio di Biofotonica Prof. Francesco Michelotti SAPIENZA Università di Roma Facoltà di Ingegneria Civile e Industriale francesco.michelotti@uniroma1.it

2 LABORATORIO 6 DNA-Arrays e DNA-Chips SAPIENZA Università di Roma Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo Prof. Negri

3 A partire dall inizio degli anni 90 si sono sviluppati una gran varietà di dispositivi integrati per l analisi genomica raggruppati sotto la denominazione di biochip. Allo stato attuale i biochip si classificano in due sottoclassi (dai confini sfumati): DNA Array Dispositivi utilizzati per l analisi genomica che necessitano di un apparecchiatura di lettura esterna (array scanner) DNA Chip Dispositivi che comprendono anche l apparato di lettura, anche indicati con il nome di Lab on Chip. Data la grandissima varietà non entriamo nella descrizione dettagliata di ognuno di essi. Ci limitiamo a descrivere il principio di funzionamento di base, mettendo in evidenza i contributi di ottica e fotonica.

4 Principio di funzionamento I DNA Array sono costituiti da un substrato, di solito di vetro con bassissima resa quantica di fluorescenza intrinseca, sul quale è presente una matrice bidimensionale di elementi bioattivi. Su ogni elemento sono state depositati un gran numero di oligomeri identici costituita da una sequenza di basi (.GTACTA.) nota. La lunghezza delle sequenza dipende dal tipo di array e dalle sue applicazioni. Ogni elemento è caratterizzato da una sequenza differente dagli altri.

5 Principio di funzionamento Si estrae da cellule l RNA che si vuole analizzare. Frammenti di RNA vengono marcati con fluorofori. Tipicamente si utilizzano delle cianine (Cy3 o Cy5). I frammenti di RNA in soluzione vengono spottati su tutto il DNA array. Durante un tempo d incubazione i frammenti si legano per base pairing alle sequenze complementari.in seguito l array viene risciacquato per eliminare tutti i frammenti di RNA che non si sono legati.

6 Principio di funzionamento L array viene inserito in un fluorimetro che eccita mediante laser ogni elemento separatamente, leggendo l intensità del segnale di fluorescenza (array scanner). Lo scanner solitamente usa due laser che emettono a due lunghezze d onda di eccitazione (He-Ne 632.8nm e SHG Nd:YAG 532nm) La rivelazione è effettuata mediante sistemi di filtri analoghi a quelli della fluorescenza wide-field e tubi fotomoltiplicatori. Solamente gli elementi in cui si è avuto base pairing fluorescono confermando la presenza di una particolare sequenza nell RNA estratto.

7 Ricordiamo le proprietà di assorbimento ed emissione delle cianine Nel corso dello scanning occorre normalizzare i dati per tenere conto della diversa efficienza delle due cianine e di possibili sovrapposizioni spettrali SHG Nd:YAG 532nm He-Ne 632.8nm

8 Applicazioni tipiche Applicazioni in più campi, quali diagnostica, ricerca, farmacogenomica, etc. Utilizzate differenti tipi di sonde: BAC ( Kb), cloni di cdna ( Kb), prodotti di PCR (100 bp- 1.5 Kb), oligonucleotidi (25-80 nt), SNPs (25 nt) La risoluzione dipende dalla lunghezza delle sequenze e dal numero degli spot Vantaggio: analisi di più geni o dell intero genoma in un singolo esperimento.

9 Esempio Possiamo comprendere il funzionamento mediante la seguente animazione.

10 Fabbricazione dei DNA array Esistono sostanzialmente due metodologie per preparare i DNA array: 1. Array spottati roboticamente: probe di cdna a singolo filamento presintetizzati sono fissati su vetrini mediante apparecchiature automatizzate (Tecnologia Ink-Jet Printing) 2. Array di oligonucleotidi ad alta densità: set di oligonucleotidi sono sintetizzati in situ su un supporto di vetro mediante un processo di fotolitografia associata alla sintesi chimica degli oligonucleotidi (Tecnologia Affymetrix).

11 Array spottati roboticamente Prima dello spottaggio, i substrati devono essere trattati in modo che espongano sulla superficie molecole con cariche positive (polilisina). Le molecole di cdna che vengono depositate sul vetrino durante lo spottaggio, vengono successivamente UV-crosslinkate alle cariche positive del vetrino. Le sequenze possono essere prelevate da librerie di cdna dnaarray.exe La tecnica è di dominio pubblico e array di questo tipo vengono commercializzati da numerosi enti e ditte

12 Array spottati roboticamente Vantaggio Svantaggio Costi relativamente bassi I frammenti di libreria non si attaccano al substrato necessariamente per un estremo. Più facilmente si attaccano mediante un segmento centrale. Di conseguenza non tutta la sequenza è disponibile per il riconoscimento per base pairing limitando l efficienza. La densità di sequenze è inoltre medio/bassa.

13 Array di oligonucleotidi Le sequenze di basi vengono fabbricate direttamente sui substrati con tecniche di litografia convenzionali (epitassia genetica?). Si ottengono elementi contenenti un altissima densità di sequenze uguali di 25 basi. È un brevetto Affimetrix distribuito in esclusiva con il nome di Gene-Chip TM. dnachip.exe Svantaggio Vantaggio Costi elevati I frammenti di libreria crescono epitassialmente a partire dal substrato e rimangono attaccati per un estremo. Di conseguenza tutta la sequenza è disponibile per il riconoscimento per base pairing massimizzando l efficienza. Inoltre la densità è elevatissima.

14 Array di oligonucleotidi Il processo di litografia utilizza linker sintetici modificati con gruppi protettivi, rimuovibili mediante la luce, attaccati alla superficie del vetrino. La luce viene diretta attraverso una maschera per deproteggere e attivare i gruppi selezionati. Nucleotidi protetti possono così accoppiarsi ai siti attivati. E possibile avere 500,000 probe in uno spazio di 1.28 cm 2. Ogni singolo probe è costituito da milioni di oligonucleotidi identici Per ogni oligo che presenta un match perfetto (PM) ne è presente uno identico con mismatch per una sola base in posizione centrale (MM). La presenza di un MM consente di stimare legami aspecifici e background locale.

15 DNA Array e DNA - Chip Array scanner Gli array scanner sono basati sostanzialmente su dei fluorimetri Operano a 1, 2 o 3 lunghezze d onda fisse (2 per la misura, 1 riservata per calibrazione e misura del fondo) Utilizzano un sistema di scansione per leggere tutti gli elementi del DNA array Producono grosse quantità di dati (0.1-1Gb) che devono essere immagazzinati e trattati per estrarre l informazione voluta. Il trattamento dei dati è condotto nell ambito di studi di Bioinformatica.

16 DNA Array e DNA - Chip Array scanner I DNA array scanner hanno mutuato accorgimenti nella lettura tipici dei dispositivi di immagazzinamento dati di massa (CD, DVD-ROM)

17 DNA Array e DNA - Chip Array scanner I DNA array scanner hanno mutuato accorgimenti nella lettura tipici dei dispositivi di immagazzinamento dati di massa (CD, DVD-ROM) Array letto senza autofocus Array letto con autofocus E un caso il fatto che la tecnologia dei CD-R è basata sull utilizzo di cianine come colorante organico da bruciare durante le scrittura? NO

18 DNA Array e DNA - Chip Schema dell esercitazione Descrizione dei DNA arrays utilizzati in biologia molecolare Dimostrazione dell utilizzo di DNA array del tipo microspottato Dimostrazione dell utilizzo di un array scanner Carrellata di immagini ottenute mediante lettura degli arrays Cenni di bioinformatica