Ibridazione degli acidi nucleici
|
|
- Giordano Pisani
- 8 anni fa
- Visualizzazioni
Transcript
1 Ibridazione degli acidi nucleici L ibridazione consiste nel porre a contatto acidi nucleici a singolo filamento provenienti da fonti diverse: Sonda di solito una popolazione omogenea di molecole note. Bersaglio di solito una miscela complessa ed eterogenea di acidi nucleici. Se sonda e bersaglio sono molecole a doppio filamento è necessario provvedere alla loro denaturazione mediante trattamento termico o alcalino. I parametri che determinano la temperatura di fusione (Melting) della doppia elica, cioè il passaggio da una struttura a doppia elica a quella a singolo filamento sono: Lunghezza del filamento. Composizione di basi (%GC). Ambiente chimico cationi ionici monovalenti (Na + ) stabilizzano la doppia elica mentre denaturanti chimici (formammide, urea) la destabilizzano. Il DNA genomico di mammifero (GC circa 40%) si denatura a T m 87 C.
2
3 Come favorire la formazione di heteroduplex sonda-bersaglio La cinetica di riassociazione descrive la velocità con cui una sequenza a singolo filamento è capace di trovare il filamento complementare. Concentrazione di partenza della specifica sequenza (C o ). Durata della reazione in secondi (T). C o T è un unità che utilmente descrive la reazione d ibridazione I parametri che entrano i gioco sono: Temperatura (in genere T m della sonda 20 C) Forza ionica del mezzo (concentrazione salina) Presenza di agenti chimici denaturanti Variando opportunamente i diversi parametri è possibile modificare la stringenza delle condizioni d ibridazione. Normalmente l acido nucleico bersaglio è presente in largo eccesso rispetto alla sonda.
4
5 Saggi d ibridazione degli acidi nucleici Standard assays Labeled probe in solution Unlabeled target bound to solid support Dot-blot (Figure 5.11) Southern blot (Figures 5.12, 5.16) Northern blot (Figure 5.13) Chromosome in situ hybridization (Section 5.3.4; Figure 10.5) Tissue in situ hybridization (Figure 5.17) Colony blot (Figure 5.18) Plaque lift (Section 5.4.1) Gridded clone hybridization assay (Figure 5.19) Any labeled DNA or RNA but often an oligonucleotide Any Any Usually a labeled genomic clone Usually a labeled antisense riboprobe or oligonucleotide Any Any Any Complex DNA or RNA population; not size-fractionated, but spotted directly onto membrane Often complex genomic DNA (but may be individual DNA clones); digested with restriction nuclease and size fractionated, then transferred to membrane Complex RNA population (e.g. total cellular RNA or poly A+ RNA) which has been size-fractionated, then transferred to membrane DNA within chromosomes (often metaphase) of lysed cells on a microscope slide RNA within cells of fixed tissue sections on a microscope slide Cell colonies separated after plating out on agar then transferred to membrane Phage-infected bacterial colonies separated after plating out on agar and transferred to membrane Clones robotically spotted onto membrane in geometric arrays Reverse assays Labeled target in solution Unlabeled probes bound to solid support Reverse dot-blot Complex DNA Oligonucleotides spotted onto membrane DNA microarray (Figures 5.20A and 20.6A) Complex DNA DNA clones robotically spotted onto microscope slide Oligonucleotide microarray (Figures 5.20B and 20.6B) Complex DNA Oligonucleotides synthesized on glass
6 Dot Blot con sonde ASO (Allele Specific Oligonucleotide)
7 Southern Blot
8
9 Southern blot per identificare mutazioni che modificano un sito per un enzima di restrizione
10 ZOO Blot
11 Northern Blot
12 Ibridazione in situ dei cromosomi (FISH) Una sonda opportunamente marcata, in genere con un fluoroforo, può essere utilizzata per ibridare direttamente i cromosomi. Si utilizzano linee cellulari linfoblastoidi ottenute da sangue periferico o altri tipi cellulari (amniociti in diagnosi prenatale). Le cellule sono bloccate in metafase mediante trattamento con colchicina. Il trattamento con RNasi e proteinchinasi K consente di ottenere DNA cromosomico parzialmente purificato, denaturato poi con formammide. Il vetrino è poi ibridato con la sonda specifica, lavato nelle opportune condizioni di stringenza e analizzato al microscopio.
13
14 Parziale trisomia del Chr 2 A. Cariotipo con tecnica classica B. M-FISH C. Rx-FISH
15 Ibridazione in situ dei tessuti Una sonda opportunamente marcata, in genere una sonda a RNA (ribosonda), può essere utilizzata per ibridare direttamente sezioni di tessuti od organi al fine di valutare l espressione di un determinato gene. La sonda deve essere complementare all mrna, si utilizza quindi una sonda antisenso. In genere la sonda senso viene comunque utilizzata come controllo negativo (non dà segnale d ibridazione). Le sezioni di tessuto sono opportunamente trattate per stabilizzare l mrna e denaturarlo. Il vetrino è poi ibridato con la sonda specifica, lavato nelle opportune condizioni di stringenza e analizzato al microscopio.
16 Embrione di topo (13d) Sonda b-miosina Forte espressione nei ventricoli cardiaci
17 Screening di librerie e Colony Lift Assay
18 DNA microarray I DNA microarray (DNA chip) rappresentano l ultima innovazione nell ambito delle tecniche d ibridazione. Microarray di cloni di DNA, in cui cloni di DNA noti sono micropipettati sulla superficie del vetrino. Microarray di oligonucleotidi, in cui specifiche sequenze oligonucleotidiche vengono fissate o sintetizzate (Affimetrix) sulla superficie del vetrino In questo caso si tratta di tecniche d ibridazione inversa in cui la sonda, non marcata, è legata al supporto ed è la mistura complessa di molecole di DNA ad essere marcata ed ibridata al supporto. I campi applicativi sono molteplici ed aumentano in funzione della sempre maggiore miniaturizzazione (Chip di 1.28X1.28 cm possono contenere fino a oligonucleotidi). Analisi d espressione Analisi genomica (array-cgh) SNPs genotyping
19
20
21
22 Array-based Comparative Genomic Hybridization (array- CGH) Delezioni e duplicazioni submicroscopiche (~100 Kb -10 Mb) costituiscono più del 15% delle mutazioni osservate per malattie monogeniche. L array-cgh consente di analizzare efficientemente questo tipo di alterazioni cromosomiche. Rispetto al CGH convenzionale su cromosomi metafasici, i principali vantaggi sono: Più alta risoluzione (~100 Kb) La possibilità di ricondurre immediatamente l alterazione osservata ad una precisa regione/sequenza del cromosoma.
23
24
25
26 Polymerase chain reaction (PCR) La reazione a catena della polimerasi (PCR) ha di fatto rivoluzionato la genetica molecolare, con la possibilità di analizzare e clonare velocemente il DNA. E un metodo in vitro molto versatile per amplificare determinate sequenze bersaglio presenti in campioni di DNA. Sono necessarie informazioni sulla sequenza del DNA bersaglio, almeno per consentire il disegno della coppia di primers specifica da utilizzare nella reazione di amplificazione. Kary B. Mullis (USA) Nobel Prize in 1993 for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method
27
28 Cosa ha reso la PCR così facilmente accessibile? La disponibilità di DNA polimerasi termostabili. Taq DNA polimerasi (estratta da Thermus aquaticus). L ingegnerizzazione di termociclatori capaci gestire velocemente e con elevata precisione i cambi di temperatura che caratterizzano il processo di amplificazione.
29 Scelta dei primers Il disegno della coppia di primers è molto importante per la buona riuscita della PCR. Sono disponibili supporti bioinformatici che aiutano nella selezione. On-line PRIMER3: cgi
30 Specificità della reazione di PCR Nested PCR - l utilizzo di primers interni a quelli utilizzati in una precedente amplificazione può garantire la specificità del prodotto Hot-Start PCR si creano le condizioni per una partenza a caldo della reazione limitando la formazione di prodotti aspecifici Touch-down PCR il termociclatore gestisce la temperatura di annealing, decrementandola ad ogni ciclo in un range definito. E possibile così selezionare il prodotto specifico. Gradient PCR il termociclatore può gestire contemporaneamente diverse temperature di annealing, consentendo una precisa ottimizzazione delle condizioni di amplificazione.
31 Vantaggi e Svantaggi della PCR Velocità e semplicità. Sensibilità Duttilità Necessità di informazioni sulla sequenza bersaglio Dimensioni ridotte del prodotto di PCR Imprecisione della replicazione del DNA
32
33 Genotyping mediante PCR (1)
34 Genotyping mediante PCR (2)
35 STR polimorfici
36 Analisi di Linkage
37 Test genetico d identità personale
38 Esempio di referto RISULTATO (in grassetto si evidenziano i marcatori paterni condivisi dal figlio) Marcatore - cromosoma Padre Figlio Madre D8S1179 crom. 8(q24.13) 13/13 13/14 14/15 D21S11 crom 21( q21.1) 29.2/ / /32 D7S820- crom 7(q21.11) 8/10 8/11 11/11 CSF1PO crom. 5(q32) 11/12 11/12 10/12 D3S1358 crom. 3(p21.31) 15/17 15/ /16.2 TH01- crom 11(p15.5) 5.3/ / /9.3 D16S539 crom. 16(q24.1) 8/10 10/10 10/11 D2S1338 crom. 2(q35) 17/17 17/23 17/23 D19S433 crom. 19 (q12) 12/ / /13.2 vwa- crom. 12(p13.31) 15.2/ /16 16/17 TPOX- crom. 2(p25.3) 9/11 7/11 7/9 D5S818- crom. 5(q23.2) 7/11 7/13 13/13 FGA crom. 4(q31.3) 20.2/ / /25.2 CONCLUSIONI:. Dall analisi del DNA emerge una ATTRIBUZIONE della paternità di con una probabilità di paternità maggiore del 99,99%. Questo indica una paternità praticamente provata.
Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici
Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici 1. L Analisi di restrizione di frammenti o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) di DNA comporta lo studio delle dimensioni dei frammenti di DNA
DettagliLa reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino
La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino La Polymerase Chain Reaction (PCR) o reazione di amplificazione a catena è una tecnica che permette di amplificare una specifica
DettagliIsolamento e purificazione di DNA e RNA. -Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari (lipidi e proteine)
Isolamento e purificazione di DNA e RNA -Rompere la membrana cellulare -Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari (lipidi e proteine) -Separare gli acidi nucleici tra loro -Rompere la membrana
DettagliPCR. PCR o reazione di polimerizzazione a catena. Amplificazione esponenziale di DNA. Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte
PCR Prof.ssa Flavia Frabetti PCR o reazione di polimerizzazione a catena Fine anni 80 Amplificazione esponenziale di DNA. Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte Permette di estrarre
Dettaglidi Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro
di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro Polymerase Chain Reaction Inventata a metà degli anni 80 da Kary Mullis, è a tutt oggi uno strumento
DettagliLa possibilita di conoscere i geni deriva dalla capacita di manipolarli:
La possibilita di conoscere i geni deriva dalla capacita di manipolarli: -isolare un gene (enzimi di restrizione) -clonaggio (amplificazione) vettori -sequenziamento -funzione Il gene o la sequenza
DettagliDiagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni
Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni Preparazione dei campioni: (Estrazione del DNA o dell RNA dal tessuto di interesse) Analisi delle mutazioni: SSCP DHPLC Dot blot - Southern - PCR (ARMS
DettagliAMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) PCR: reazione polimerasica a catena Inventata da Kary Mullis negli anni 80 (premio Nobel 1993) Serve per ottenere una grande quantita
DettagliTECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE. LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici
TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 1955 A. Kronembreg e coll. (Stanford University) scoprono la DNA-polimerasi
DettagliCome identificare i Cromosomi
Come identificare i Cromosomi Fino al 1970, i cromosomi sono stati classificati in base alle dimensioni ed alla posizione del centromero. A I più grandi (metacentrici) B Grandi (submetacentrici) C Medi
DettagliLEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR. Dott. Paolo Cascio
LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR Dott. Paolo Cascio Tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction) 1) Introdotta da Kary Mullis alla metà degli anni
DettagliAnalisi molecolare dei geni
Analisi molecolare dei geni Denaturazione e rinaturazione di una molecola di DNA Si rompono i legami idrogeno 100 C Denaturazione del DNA Rinaturazione per riassociazione delle sequenze complementari Ogni
DettagliPRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b)
PRINCIPALI TIPI DI PCR a) RT-PCR: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mrna da esso trascritto PCR COMPETITIVA: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o RNA
DettagliANALISI POST-GENOMICHE TRASCRITTOMA: CONTENUTO DI RNA DI UNA CELLULA.
TECNICHE PER L ANALISI DELL ESPRESSIONE GENICA RT-PCR REAL TIME PCR NORTHERN BLOTTING ANALISI POST-GENOMICHE Conoscere la sequenza genomica di un organismo non è che l inizio di una serie di esperimenti
DettagliMetodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica)
DNA Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica) Principali tecniche di base Enzimi di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction) Sequenziamento
DettagliREAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI. ( PCR =Polymerase Chain Reaction)
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI ( PCR =Polymerase Chain Reaction) Verso la metà degli anni 80, il biochimico Kary Mullis mise a punto un metodo estremamente rapido e semplice per produrre una quantità
DettagliI marcatori molecolari. Dipartimento di Scienze Agronomiche e Genetica Vegetale Agraria Corso di Genetica Agraria Giovanna Attene
I marcatori molecolari Dipartimento di Scienze Agronomiche e Genetica Vegetale Agraria Corso di Genetica Agraria Giovanna Attene Marcatori molecolari del DNA I marcatori molecolari sono sequenze di DNA
DettagliSEQUENZIAMENTO DEL DNA
SEQUENZIAMENTO DEL DNA Il metodo di Sanger per determinare la sequenza del DNA Il metodo manuale La reazione enzimatica Elettroforesi in gel denaturante di poliacrilammide Autoradiografia Il metodo automatico
DettagliCome si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo. alla realtà di ogni giorno
Editoriale n.10 Newsletter aprile 2013 Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo alla realtà di ogni giorno Identificare la specie, un obiettivo fondamentale quando
DettagliSi può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E
Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E possibile scegliere selettivamente cosa amplificare (specificità)
DettagliPCR - Polymerase Chain Reaction. ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993).
End point PCR vs quantitative Real-Time PCR PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando
DettagliReal Time PCR. La PCR Real Time è in grado di misurare in tempo reale la concentrazione iniziale di una sequenza target in un campione biologico.
eal Time PC La PC eal Time è in grado di misurare in tempo reale la concentrazione iniziale di una sequenza target in un campione biologico. Gli strumenti per PC eal Time, oltre a fungere da termociclatori,
DettagliMetodologie citogenetiche. Metodologie molecolari. Formulare la domanda Utilizzare la metodica appropriata
In base al potere di risoluzione della tecnica Metodologie citogenetiche Metodologie molecolari Formulare la domanda Utilizzare la metodica appropriata 1 DNA RNA PROTEINE DNA Cromosomi (cariotipo, FISH,
DettagliTecniche molecolari per lo studio degli acidi nucleici
Tecniche molecolari per lo studio degli acidi nucleici Prof.ssa Flavia Frabetti aa. 2010-11 Estrazione acidi nucleici (DNA o RNA) Verifica tramite elettroforesi su gel di agarosio Amplificazione o clonaggio
DettagliSAGE: Serial Analysis of Gene Expression
SAGE: Serial Analysis of Gene Expression L insieme di tutti gli mrna presenti in una cellula si definisce trascrittoma. Ogni trascrittoma ha una composizione complessa, con migliaia di mrna diversi, ciascuno
DettagliAnalisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di. DNA umano. 22-26 giugno 2009
Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di 22-26 giugno 2009 DNA umano 1 GENETICA FORENSE La genetica forense applica tecniche di biologia molecolare al fine
DettagliMetodiche Molecolari
Metodiche Molecolari La rivelazione degli acidi nucleici virali è un altro saggio che può essere utilizzato sia per verificare la presenza di un virus in un determinato campione biologico, sia per studiare
DettagliPCR. (Reazione a catena della polimerasi) ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO. Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof. Renato Fani,
PCR (Reazione a catena della polimerasi) & ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof. Renato Fani, ESERCITAZIONE DI LAB. N.2 La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica
DettagliPCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR (Polymerase Chain Reaction) Metodo enzimatico estremamente rapido e semplice per produrre una quantità illimitata di copie della sequenza di un singolo gene Sometime a good idea comes to yow when you
DettagliIl primer utilizzato può essere specifico per il gene che si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dt) oppure random esameri).
Retrotrascrizione l mrna viene convertito in cdna per mezzo dell enzima trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNAdipendenti ricavate dai virus della mieloblastosi aviaria AMV o della leucemia murina di
DettagliI marcatori genetici e loro applicazioni nelle produzioni animali. Dott.ssa Chiara Targhetta
I marcatori genetici e loro applicazioni nelle produzioni animali Dott.ssa Chiara Targhetta LOCUS localizzazione genomica unica all interno di un cromosoma; permette di definire la posizione di un gene
DettagliAnalisi dei marcatori molecolari della pluripotenza e del differenziamento delle cellule embrionali staminali (ES) murine
Training Course 2010 Stem Cell Differentiation Napoli, 9-12 Novembre Analisi dei marcatori molecolari della pluripotenza e del differenziamento delle cellule embrionali staminali (ES) murine Cristina D
DettagliSELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo
C.R.A. Consiglio per la Ricerca in Agricoltura Centro di ricerca per la genomica Fiorenzuola d Arda (Piacenza) SELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo Tutor: Dott. Gianni TACCONI Studente:
DettagliLezione XLI-XLII martedì 17-1-2012
Lezione XLI-XLII martedì 17-1-2012 corso di genomica aula 8 orario : Martedì ore 14.00-16.00 Giovedì ore 13.00-15.00 Esami 31- gennaio 2012 7- febbraio 2012 28 - febbraio 2012 D. Frezza Esercitazione II
DettagliELETTROFORESI SU GEL
ELETTROFORESI SU GEL Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA da una miscela complessa E una tecnica fondamentale per: l analisi (elettroforesi analitica) la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi
DettagliPolimorfismi LEZIONE 6. By NA 1
Polimorfismi LEZIONE 6 By NA 1 * Polimorfismo Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% Variazioni nell aspetto By NA 2 Polimorfismo proteico Variazione presente nella popolazione
DettagliMetodi di analisi mutazionale
Metodi di analisi mutazionale I metodi impiegati per l analisi di mutazioni o polimorfismi nel DNA genomico possono essere suddivise in due principali categorie: (1) metodi per individuare mutazioni note,
DettagliCOME VIENE REALIZZATA UNA RICERCA SPERIMENTALE IN BIOLOGIA MOLECOLARE?
COME VIENE REALIZZATA UNA RICERCA SPERIMENTALE IN BIOLOGIA MOLECOLARE? A Flusso di attività B - INPUT C Descrizione dell attività D RISULTATO E - SISTEMA PROFESSIONALE 0. RICHIESTA DI STUDIARE E/O INDIVIDUARE
Dettagli8-06-2010. BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING. BLOTTING delle proteine: NORTHERN BLOTTING SOUTHERN BLOTTING
8-06-2010 TECNICHE PER L ANALISI DELL ESPRESSIONE GENICA BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR REAL TIME PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING BLOTTING delle proteine: MICROARRAYS MACROARRAYS
DettagliArray-CGH(Comparative Genomic Hybridisation) e diagnosi prenatale. Dalla citogenetica convenzionale alla citogenetica molecolare!
Array-CGH(Comparative Genomic Hybridisation) e diagnosi prenatale Dalla citogenetica convenzionale alla citogenetica molecolare! CARIOTIPO STANDARD Identifica anomalie strutturali bilanciate e sbilanciate
Dettagliimmagine Biologia applicata alla ricerca bio-medica Materiale Didattico Docente: Di Bernardo
Esperto in processi innovativi di sintesi biomolecolare applicata a tecniche di epigenetica Materiale Didattico Biologia applicata alla ricerca bio-medica immagine Docente: Di Bernardo TECNICHE PER L ANALISI
DettagliPCR Polymerase Chain Reaction = Reazione a catena della polimerasi
PR Polymerase hain Reaction = Reazione a catena della polimerasi mplifica un frammento di D di cui si conosce almeno in parte la sequenza Utilizza un enzima, la D Polimerasi, per copiare una molecola di
DettagliDomande relative alla specializzazione in: Biochimica clinica
Domande relative alla specializzazione in: Biochimica clinica Domanda #1 (codice domanda: n.403) : Nell'ibridazione fluorescente in situ (Fluorescent in situ hybridization "FISH"), che tipo di sonde fluorescenti
DettagliPCR - Polymerase Chain Reaction
PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA,
DettagliMaria Antonietta Lepore. Principali tecniche di biologia molecolare clinica
Maria Antonietta Lepore Principali tecniche di biologia molecolare clinica Copyright MMIX ARACNE editrice S.r.l. www.aracneeditrice.it info@aracneeditrice.it via Raffaele Garofalo, 133 a/b 00173 Roma (06)
DettagliMETODI DI MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI
METODI DI MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI Marcatura di acidi nucleici Una sonda per ibridazione è una molecola di DNA marcata, con una sequenza complementare al DNA bersaglio da individuare. Poiché la sonda
DettagliFINALITA : evidenziare la. cromosomiche fetali.
Il Cariotipo Fetale Molecolare l (array-cgh) Il Cariotipo Fetale e TRADIZIONALE FINALITA : evidenziare la presenza di eventuali anomalie cromosomiche fetali. TECNICA: comporta la coltura delle cellule
DettagliPolymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR) La reazione a catena della polimerasi (PCR) ha di fatto rivoluzionato la genetica molecolare, con la possibilità di analizzare e clonare velocemente il DNA. E un metodo
DettagliAmplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico
Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico Dottoressa Camerin Consuelo Laboratorio Oncoematologia Pediatrica
DettagliSequenziamento del DNA: strutture dei nucleotidi
Sequenziamento del DNA: strutture dei nucleotidi il metodo di Sanger 2-3 DIDEOSSINUCLEOTIDI Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide * Indica
DettagliGENOMA. c varia da pochi kb nei virus a milioni di kb in piante e animali
GENOMA Insieme del materiale genetico presente in una cellula (DNA nucleare, plastidiale e mitocondriale) Contiene tutte le informazioni necessarie per consentire la vita alla cellula e all individuo Nei
DettagliPROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale. Esercizio. Tipizzazione del gene PV92
PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale Esercizio Tipizzazione del gene PV92 Elementi trasponibili Che cosa sono gli elementi trasponibili? Sono segmenti di DNA che sono in grado di trasferirsi in
DettagliIl termine deriva dal greco antico κλών(klōn, ramo", "ramoscello"), e perclonazione, inbiologia, si intende lariproduzione asessuata, naturale o
Il termine deriva dal greco antico κλών(klōn, ramo", "ramoscello"), e perclonazione, inbiologia, si intende lariproduzione asessuata, naturale o artificiale, di un intero organismo vivente o anche di una
DettagliIdentificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3. Criteri di identificazione
Identificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3 Criteri di identificazione Tradizionale (fenotipo) Tecniche di biologia molecolare Il livello di risoluzione
DettagliNote Tecniche al LightCycler Selezione di sonde di ibridazione per LightCycler. Olfert Landt e Andreas Nitsche, TIB MOLBIOL, Berlino
Note Tecniche al LightCycler Selezione di sonde di ibridazione per LightCycler Olfert Landt e Andreas Nitsche, TIB MOLBIOL, Berlino 1. Introduzione Scopo di questa nota La detezione di amplicon specifici
DettagliRELAZIONE TECNICA. Indagini Biologico-Molecolari per Accertamento di Paternità
RELAZIONE TECNICA Indagini Biologico-Molecolari per Accertamento di Paternità PROSPETTO RIASSUNTIVO DELL'ANALISI ANALISI INDAGINE DI PATERNITA' PERSONE SOTTOPOSTE AL TEST QUESITO Campione Biologico Tampone
DettagliDott.ssa Quintarelli Concetta
Dott.ssa Quintarelli Concetta Estrazione e quantizzazione degli acidi nucleici Pre-PCR Accetazione Post-PCR Refertazione Area PCR GUANTI MONOUSO PUNTALI CON FILTRO CESTELLO PER GHIACCIO TUBINI PCR Materiale
DettagliDNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE
DNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE Il doppio strand della molecola di DNA può denaturarsi dando due singoli strand ad alte temperature (>90 C). Due strand di DNA complementari possono accoppiarsi dando
DettagliSAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A. 2014-2015 Corso di Laboratorio di Biofotonica
SAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A. 2014-2015 Corso di Laboratorio di Biofotonica Prof. Francesco Michelotti SAPIENZA Università di Roma Facoltà di Ingegneria
DettagliREPLICAZIONE DEL DNA
REPLICAZIONE DEL DNA La replicazione (o anche duplicazione) è il meccanismo molecolare attraverso cui il DNA produce una copia di sé stesso. Ogni volta che una cellula si divide, infatti, l'intero genoma
DettagliDiagnosi genetiche molecolari
Diagnosi genetiche molecolari INDICAZIONI per la diagnosi genetica Ricorrenza nella famiglia di una malattia genetica - identificazione dei portatori - confermare la diagnosi basata sul quadro clinico
DettagliDOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? SI AUMENTA O SI DIMINUISCE L ESPRESSIONE DELLA PROTEINA
DOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? OVERESPRESSIONE DELLA PROTEINA ESPRESSIONE ECTOPICA CON UN VETTORE DI ESPRESSIONE ABOLIZIONE DELLA ESPRESSIONE DELLA PROTEINA INTERFERENZA
DettagliLezione IX-X martedì 25-X-2011
Lezione IX-X martedì 25-X-2011 corso di genomica laurea magistrale Biotecnologia Industriale aula 8 orario : Martedì ore 14.00-16.00 Giovedì ore 13.00-15.00 non ci sarà lezione martedì 1 e giovedì 3 Novembre
DettagliMarcatori molecolari
Marcatori molecolari Caratteristiche e applicazioni Luca Gianfranceschi e Rosanna Marino 1 I marcatori molecolari Strumento per l analisi genetica Strumento Molecolari Analisi genetica Marcatori non oggetto
DettagliZytoLight SPEC ERG Dual Color Break Apart Probe
ZytoLight SPEC ERG Dual Color Break Apart Probe IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro Produttore: ZytoVision GmbH Codice: Z-2138-200 (0.2ml).. Per l identificazione della traslocazione che coinvolge
DettagliINFORMATIVA ALLA DIAGNOSI CITOGENETICA PRENATALE MOLECOLARE (ARRAY-CGH) SU CELLULE DEL LIQUIDO AMNIOTICO O VILLI CORIALI
INFORMATIVA ALLA DIAGNOSI CITOGENETICA PRENATALE MOLECOLARE (ARRAY-CGH) SU CELLULE DEL LIQUIDO AMNIOTICO O VILLI CORIALI A. Finalità L indagine citogenetica fetale (o cariotipo) viene eseguita su cellule
DettagliApplicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: Real Time PCR per la determinazione dei virus enterici
"Focus su sicurezza d'uso e nutrizionale degli alimenti" 21-22 Novembre 2005 Applicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: Real Time PCR per la determinazione dei virus enterici Simona
DettagliIbridizzazione in situ
ANALISI DELL RNA Northen blot E un metodo simile a quello di traferimento e di ibridizzazione del DNA (Southern blot) e si usa per sondare molecole di RNA. Gli mrna sono molecole brevi, in genere meno
DettagliCenni storici. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di ricerca biologica:
DNA Microarray: griglia di DNA costruita artificialmente, in cui ogni elemento della griglia riconosce una specifica sequenza target di RNA o cdna. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di
Dettagli-riesce a identificare riarrangiamenti cromosomici sbilanciati, ovvero delezioni o duplicazioni
L array-cgh: -riesce a identificare riarrangiamenti cromosomici sbilanciati, ovvero delezioni o duplicazioni -ha un potere si risoluzione 100 volte superiore al cariotipo (100 Kb versus 10 Mb) Microarray-based
DettagliDifferenti tipi di PCR
Differenti tipi di PCR Colony PCR Nested PCR Multiplex PCR AFLP PCR Hot start PCR In situ PCR Inverse PCR Asymmetric PCR Long PCR Long accurate PCR Reverse transcriptase PCR Allele Specific PCR Real time
DettagliProtocollo Crime Scene Investigation
Protocollo Crime Scene Investigation Precauzioni da adottare in laboratorio: - non mangiare o bere - indossare sempre i guanti quando si maneggiano i tubini, i gel, le micropipette - nel dubbio, chiedere!
DettagliPRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR. PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a)
EAZIONE A CATENA DELLA POLIMEASI (PC) PINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PC UPPE primer LOWE primer GENE X 1. Identificazione di agenti patogeni nell uomo, negli animali o negli alimenti (batteri e virus) 2.
DettagliCAPITOLATO TECNICO PER DIAGNOSTICI PER TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DA DESTINARSI AL LABORATORIO DI GENETICA MOLECOLARE-MEDICINA LEGALE P.O.
ALLEGATO A CAPITOLATO TECNICO PER DIAGNOSTICI PER TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DA DESTINARSI AL LABORATORIO DI GENETICA MOLECOLARE-MEDICINA LEGALE P.O. MONSERRATO Durata della fornitura: 1 anno + 1 rinnovabile
DettagliLo studio prenatale dei cromosomi fetali:
Laboratorio di Genetica Medica Lo studio prenatale dei cromosomi fetali: esame citogenetico standard vs array Bologna, 06 Giugno 2014 Giorgio Lucci La citogenetica classica Inizio della citogenetica umana
DettagliBiosensori 3: Biosensori a DNA e Bio- Gene Chip
Biosensori 3: Biosensori a DNA e Bio- Gene Chip mazzei@di.unipi.it (materiale parzialmente tratto da: http://nestor.med.unibo.it/shared_files/seminari/sartini_21-10-2004.ppt) Biosensori ad affinità basati
DettagliLa rete dei centri di genetica e il futuro della medicina
La rete dei centri di genetica e il futuro della medicina Rosario Casalone,, MD, PhD SSD Genetica Dipartimento Materno Infantile Azienda Ospedaliera-Polo Universitario Ospedale di Circolo e Fondazione
DettagliBiotecnologie ed OGM. Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati.
Biotecnologie ed OGM Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati. COSA SONO LE BIOTECNOLOGIE? Si dicono Biotecnologie i metodi tecnici che permettono lo sfruttamento di sistemi
DettagliLa mutazione è una modificazione della sequenza delle basi del DNA
La mutazione è una modificazione della sequenza delle basi del DNA Le mutazioni sono eventi rari e importanti in quanto sono alla base dell evoluzione biologica Le mutazioni possono essere spontanee (dovute
DettagliDopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di
Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di reazione Inizialmente i 20 µl dell amplificato vengono
DettagliNUCLEOTIDI e ACIDI NUCLEICI
NUCLEOTIDI e ACIDI NUCLEICI Struttura dei nucleotidi Il gruppo fosfato conferisce carica negativa e proprietà acide FUNZIONI DEI NUCLEOTIDI MOLECOLE DI RISERVA DI ENERGIA L idrolisi dei nucleosidi trifosfato
DettagliLa Diagnosi Genetica Preimpianto
CRA Centro Riproduzione Assistita - Catania www.cragroup.it 19-20-21 Giugno 2012 La Diagnosi Genetica Preimpianto Dott.ssa Raffaella Cavallaro Cos è la PGD? È una procedura ormai collaudata utilizzata
DettagliBiologia molecolare clinica. Organizzazione del laboratorio di biologia molecolare clinica
Biologia molecolare clinica Organizzazione del laboratorio di biologia molecolare clinica Le tecniche di biologia molecolare negli ultimi anni si sono diffuse nei laboratori di diagnostica clinica dove
DettagliTecniche molecolari per la diagnosi di funghi fitopatogeni
Tecniche molecolari per la diagnosi di funghi fitopatogeni Tecniche che consentono l identificazione, la diagnosi, la quantificazione di un organismo mediante l analisi degli acidi nucleici: DNA RNA Diagnosi
DettagliZytoLight SPEC ALK Dual Color Break Apart Probe
ZytoLight SPEC ALK Dual Color Break Apart Probe Z-2124-200 20 (0.2 ml) Z-2124-50 5 (0.05 ml) Per la rilevazione della traslocazione che coinvolge il gene ALK a 2p23 mediante ibridazione in situ fluorescente
DettagliFigura 1. Rappresentazione della doppia elica di DNA e struttura delle differenti basi.
Sommario La molecola di DNA è deputata a conservare le informazioni genetiche necessarie per lo sviluppo ed il funzionamento degli organismi viventi. Poiché contiene le istruzioni per la costruzione delle
DettagliRNA polimerasi operone. L operatore è il tratto
La regolazione genica nei procarioti Alcune proteine vengono prodotte dalla cellula ad un ritmo relativamente costante e l attività dei geni che codificano queste proteine non è regolata in modo sofisticato.
DettagliTEST BIOLOGIA 1 ANNO ABEI Da inviare a connesso@alice.it entro e non oltre il 6 novembre 2015
1) I batteri sono organismi: a- bicellulari b- monocellulari c- pluricellulari 2) I virus: a- possono riprodursi solo nell acqua b- possono riprodursi solo sulla superficie di una cellula c- possono riprodursi
DettagliIndice dell'opera. Prefazione. Capitolo 1 Introduzione alla genetica Genetica classica e moderna Genetisti e ricerca genetica Sommario
Indice dell'opera Prefazione Capitolo 1 Introduzione alla genetica Genetica classica e moderna Genetisti e ricerca genetica Capitolo 2 DNA: il materiale genetico La ricerca del materiale genetico La composizione
DettagliGenoma umano: illusioni, realtà, prospettive
Genoma umano: illusioni, realtà, prospettive Giovedì 15 Marzo 2007 - ore 17.30 Istituto Veneto di Scienze, Lettere ed Arti - Venezia Giuseppe Borsani e Gerolamo Lanfranchi, coordina Fabio Pagan Il flusso
DettagliLA GENETICA: DNA e RNA LA GENETICA. DNA e RNA. Prof. Daniele Verri
LA GENETICA DNA e RNA Prof. Daniele Verri L'acido desossiribonucleico o deossiribonucleico (DNA) è un acido nucleico che contiene le informazioni necessarie per la formazione di RNA e proteine. LA GENETICA:
DettagliPROGETTO DNA chiavi in mano. Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi
PROGETTO DNA chiavi in mano Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi PROGETTO DNA chiavi in mano PROGETTO DNA chiavi in mano IFOM PROGETTO DNA
DettagliIdentificazione e quantificazione degli acidi nucleici DNA RNA
BIOLOGIA MOLECOLARE Identificazione e quantificazione degli acidi nucleici DNA RNA ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI DNA genomico RNA totale messaggero 1) OMOGENIZZAZIONE LISI Soluzione alcalina concentrata
DettagliGENETICA seconda parte
GENETICA seconda parte I cromosomi sono lunghe molecole di una sostanza l acido desossiribonucleico. DNA Il DNA è una lunga catena fatta da due lunghi fili avvolti su se stessi a doppia elica. Sembra una
DettagliMicroarray. (in parte da Wikipedia)
Microarray (in parte da Wikipedia) Un DNA microarray (comunemente conosciuto come gene chip, DNA chip, o biochip) è costituito da una collezione di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie
DettagliCaratterizzazione dei geni coinvolti nelle nuove traslocazioni riguardanti la banda 14q32
2 Workshop SIES di Ematologia traslazionale Verona, 21-22 Maggio 2009 Caratterizzazione dei geni coinvolti nelle nuove traslocazioni riguardanti la banda 14q32 Identificazione di una correlazione tra l'espressione
DettagliPRODA Istituto di Diagnostica Clinica
Caratterizzazione molecolare delle Distrofie Muscolari di Duchenne (DMD) e di Becker (BMD): diagnosi di malattia e studi familari L Proda esegue le indagini molecolari per le Distrofie muscolari di Duchenne
DettagliAggiornamenti in ambito genetico
10 Congresso Nazionale sulla Sindrome di Cornelia de Lange 1-4 novembre 2012 - Gabicce Aggiornamenti in ambito genetico Cristina Gervasini Genetica Medica Dip. Scienze della Salute Università degli Studi
DettagliLa PCR e le sue applicazioni. La PCR di base L RT-PCR Applicazioni mediche e forensi
La PCR e le sue applicazioni La PCR di base L RT-PCR Applicazioni mediche e forensi Polymerase Chain Reaction e sue applicazioni La polymerase chain reaction o PCR è una tecnica relativamente recente che
DettagliESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN FORMALINA E INCLUSI IN PARAFFINA (FFPE)
ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN FORMALINA E INCLUSI IN PARAFFINA (FFPE) SALVATORE GIRLANDO LABORATORIO PATOLOGIA MOLECOLARE ANATOMIA PATOLOGICA
Dettagli