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1 La parola microscopio è stata coniata dai membri dell Accademia dei Lincei di cui faceva parte anche Galileo Galilei La microscopia ottica è una tecnica di osservazione capace di produrre immagini ingrandite di oggetti troppo piccoli per essere osservati ad occhio nudo. Lo strumento utilizzato per eseguire tale tecnica è il MICROSCOPIO OTTICO 1

2 Per vedere un oggetto distintamente è necessario che sulla retina dell occhio umano si formi un immagine nitida. La cornea (1) è un tessuto specializzato nella rifrazione e trasmissione della luce. È la prima lente dell occhio e proietta l immagine sulla retina (2). La luminosità viene regolata dal diametro variabile della pupilla dell iride (3). Il cristallino ha le proprietà di una lente convergente in grado di modificare la sua forma e quindi la sua distanza focale (intervallo di spazio in cui è possibile la messa a fuoco); la sua elasticità consente all occhio normale di accomodarsi per una visione distinta per le distanze comprese tra d min = 250 mm (distanza della visione distinta più vicina all occhio o PUNTO PROSSIMO) e l infinito (PUNTO REMOTO). Quando si vuole esaminare un piccolo oggetto nei suoi dettagli, lo si avvicina il più possibile agli occhi, affinché l angolo di osservazione sia il più piccolo possibile e l immagine retinica la più grande possibile. A occhio nudo non possiamo individuare dettagli inferiori al decimo di millimetro (100µm). Poiché non possiamo avvicinarci più di 25 cm circa all oggetto (PUNTO PROSSIMO). Come conseguenza, l'angolo visivo si riduce enormemente e non possiamo piú riconoscere alcun dettaglio. 2

3 Osservazione al M.O. oculare Osservazione a occhio nudo La microscopia, come tecnica di indagine delle cellule, nasce all inizio del XVII secolo. lente intermedia obbiettivo oggetto A n t o n i v a n L e e u w e n h o e k e R o b e r t H o o k e sono stati i primi microscopisti e grazie alle loro indagin i hanno segnato l inizio della ModernaBiologia. Nonostante i circa 4 secoli di vita, la microscopia si può considerare una tecnica attuale. Infatti, ancora oggi numerosi approcci tecnologici si avvalgono della microscopia per poter analizzare le strutture e le funzioni cellulari. 3

4 Il MICROSCOPIO SEMPLICE Il microscopio semplice è una lente convergente posta tra l occhio e l oggetto da osservare in modo che quest ultimo si trovi in posizione intermedia tra il primo piano focale e la lente stessa. In tali condizioni la lente fornisce un immagine virtuale diritta e ingrandita dell oggetto, anche se questo si trova ad una distanza dall occhio inferiore al PUNTO PROSSIMO. Il massimo ingrandimento ottenibile con una singola lente è di 8-10 volte (8x-10x). IL MICROSCOPIO COMPOSTO Ingrandimenti maggiori si possono raggiungere invece grazie al microscopio composto, un sistema di due lenti convergenti dette, rispettivamente, OBIETTIVO e OCULARE. L oggetto da osservare viene posto davanti all obiettivo che ne fornisce un immagine reale, capovolta e ingrandita, Questa immagine arriva all oculare a distanza opportuna, che ne dà un altra, virtuale, ingrandita e orientata nello stesso verso. L angolo visivo δ 1 è > rispetto all angolo δ 2 Il microscopio composto è costituito essenzialmente da due lenti convesse allineate in serie: una lente vicino all oggetto (obiettivo) una lente vicino all occhio (oculare) Il microscopio composto determina un ingrandimento a due stadi 1 l obiettivo proietta un immagine ingrandita del campione nel tubo del microscopio 2 l oculare ingrandisce ulteriormente tale immagine La luce di una lampada attraversa il preparato La luce è raccolta dall obiettivo L obiettivo insieme alle lenti posti nel tubo, focalizzano l immagine a livello dell oculare L immagine è poi vista dall osservatore 4

5 Ingrandimento totale = Ingr. oculare X Ingr. obbiettivo EFFICIENZA DEL M.O. TRE parametri definiscono l efficienza di un microscopio ottico INGRANDIMENTO POTERE RISOLUTIVO o RISOLUZIONE DIFFRAZIONE 5

6 INGRANDIMENTO Si definisce INGRANDIMENTO il rapporto tra le dimensioni dell'oggetto originale e quelle dell'immagine ottenuta È dato dal prodotto tra l ingrandimento dovuto all oculare (solitamente 10x) moltiplicato per l ingrandimento dovuto agli obiettivi (solitamente 4x, 25x, 40x, 100x) L ingrandimento totale del m.o. può raggiungere il fattore 1000x Ma un ingrandimento oltre 400x è inutile per il limite alla RISOLUZIONE del microscopio, limite imposto dalla DIFFRAZIONE L'ingrandimento, infatti, non è lo scopo principale di un m.o. poiché oltre un certo livello di ingrandimento non si possono distinguere ulteriori dettagli. Questo limite è superabile dal POTERE RISOLUTIVO o RISOLUZIONE del microscopio POTERE RISOLUTIVO o RISOLUZIONE Il POTERE RISOLUTIVO di un microscopio è la distanza minima tra due punti che lo strumento consente di osservare distinti. Il potere risolutivo è tanto maggiore quanto più piccoli sono i dettagli forniti, cioè quanto più vicini sono i punti che sono distinti nell immagine. In un microscopio composto, la risoluzione è determinata dall obbiettivo. Inoltre, al fine di rendere facilmente visibili i dettagli, l oculare ha la funzione di ingrandire ma non di aumentare la risoluzione. La capacità di risoluzione è limitata a sua volta dal fenomeno della DIFFRAZIONE. 6

7 DIFFRAZIONE Il fenomeno fisico della diffrazione si ha ogni volta che la luce incontra un ostacolo o un apertura di dimensioni paragonabili alla sua lunghezza d onda. L effetto della diffrazione è quello di allargare il fascio di luce originario dando origine a immagini non più risolvibili quindi non separate fra loro PARTI DEL MICROSCOPIO Il microscopio è costituito da: una parte meccanica o strutturale una parte ottica o funzionale Lenti (oculare/i * e obiettivi) Apparato di illuminazione * Nel caso di due oculari, per una maggiore ergonomia della visione, il percorso ottico, che altrimenti è singolo, viene sdoppiato. Il cervello elabora le due immagini e le unisce in una sola immagine non stereoscopica 7

8 LA PARTE MECCANICA DEVE NECESSARIAMENTE AVERE CARATTERISTICHE DI ROBUSTEZZA E STABILITÀ LO STATIVO - CORPO PRINCIPALE DEL MICROSCOPIO HA FUNZIONE DI SUPPORTO: AI MECCANISMI DI MOVIMENTO AI MECCANISMI DI MESSA A FUOCO ALLA PARTE OTTICA Lo stativo si compone: Base o piede Tavolino Supporto per oculare/i Supporto per obiettivi, torretta o revolver Vite macro/micrometrica La base deve essere robusta, conferire stabilità e non deve consentire vibrazioni Il tavolino portaoggetti, o piatto, sostiene il preparato durante l osservazione. Presenta al centro un foro per il passaggio della luce ed è collegato ad un traslatore per spostare il preparato durante l osservazione 8

9 PARTE OTTICA OCULARI Gli oculari (o più propriamente le lenti oculari) servono per esaminare direttamente l immagine prodotta dall obbiettivo ingrandendola ulteriormente senza però aumentare il potere di risoluzione OBBIETTIVI L obiettivoè la parte del microscopio che si trova più vicino all oggetto da esaminare La funzione di base dell obbiettivo è di acquisire la luce che passa attraverso il preparato e proiettare un immagine invertita nel corpo del microscopio Deve poter focalizzare ad una distanza il più vicina possibile al preparato e quindi proiettare un immagine ingrandita nel microscopio I fenomeni di diffrazione, aberrazioni, ecc., che limitano la qualità dell immagine finale, si verificano soprattutto nella formazione dell immagine intermedia, cioènell obbiettivo. Pertanto l obbiettivo è quella parte del microscopio che determina il limite superiore della risoluzione, della definizione, del contrasto, della planeità dell immagine. 9

10 Descrizione delle caratteristiche sull obiettivo L obbiettivo è rappresentato da un doppio sistema di lenti convergenti che proietta l immagine ingrandita ed invertita del preparato nel piano focale dell oculare in modo che questo possa ingrandirla ulteriormente. La distanza di lavoro di un obbiettivo, cioè la distanza della lente frontale dal campione, è piccola (da 30 mm a 0,1 mm) a seconda del potere di ingrandimento, in modo inversamente proporzionale: maggiore è il potere di ingrandimento minore è la distanza di lavoro dell obbiettivo. Ogni obbiettivo porta sulla sua montatura alcune sigle ed alcune parole che descrivono le potenzialità, i limiti e le istruzioni d uso. In generale ogni obbiettivo riporta sempre le stesse indicazioni. 1. Ingrandimento (10X, 20X, 40X, ecc.) 2. Il segno la correzione per l infinito 3. lo spessore del copri vetrino (0.17 mm) 4. Il tipo di obiettivo 5. Se l obiettivo è costruito per operare in immersione 6. apertura numerica 7. Banda colorata per distinguere l ingrandimento 10

11 Il segno la correzione per l infinito Esistono ormai microscopi I cui obiettivi proiettano l'immagine ad una distanza infinita, perciò I raggi che escono dall'obiettivo corrono quasi paralleli lungo il tubo microscopico. Tale immagine viene ripresa da una lente intermedia e proiettata in un ben preciso piano focale del tubo microscopico (a 165 mm circa). L'immagine intermedia è infine ripresa dall'oculare e ulteriormente ingrandita. Gli obiettivi con queste caratteristiche vengono denominati obiettivi all'infinito e rappresentano il futuro della microscopia ottica in quanto presentano meno aberrazioni (i raggi luminosi decorrono quasi paralleli e le anomalie dovute a fenomeni di convergenza sono ridotte o assenti. Il tipo di obiettivo Obiettivi a secco Obiettivi a immersione (permettono di inserire sostanze* tra lente frontale e vetrino coprioggetto) olio di legno di cedro Altre tipologie basate su correzioni cromatiche o di curvatura: Acromatici corretti per l aberrazione cromatica nel campo delle lunghezze d onda entro il giallo e verde. Semiapocromatici - corretti per l aberrazione cromatica nel campo delle lunghezze d onda entro il il blu e il rosso. Apocromatici - corretti per l aberrazione cromatica e sferica in tutto lo spettro del visibile. Planapocromatici apocromatici corretti per la curvatura di campo. ->immagine piana) 11

12 Se l obiettivo è costruito per operare in immersione Nel campo della microscopia gli obiettivi ad immersione ad olio consentono fattori di ingrandimento e risoluzione decisamente superiori rispetto agli obiettivi a secco l apertura numerica È l indice di qualità dell obbiettivo: risoluzione, luminosità, ecc. La capacità di un obiettivo di comprendere i vari raggi della luce provenienti da ciascuna parte illuminata del campione, è direttamente relativa all apertura angolare angolare dell obiettivo Apertura numerica = n * sin m n= indice di rifrazione del materiale presente nello spazio tra il campione e la lente frontale m = grado di apertura angolare dell obiettivo 12

13 Per distanza frontale di un obiettivo si intende la distanza che intercorre, quando il preparato è a fuoco, fra la lente frontale e la superficie inferiore del vetrino coprioggetto (spessore 0,16 mm) La distanza frontale è tanto minore quanto più forte è l obiettivo Alla estremità dall obiettivo si trova la lente frontale (l obiettivo tanto più ingrandisce quanto più piccolo è il diametro della lente frontale) Lente frontale La distanza di lavoro di un obbiettivo, ovvero la distanza della lente frontale dal campione, è piuttosto piccola variando da 30 mm a 0,1 mm a seconda del suo potere di ingrandimento, in maniera inversamente proporzionale: maggiore è il potere di ingrandimento minore è la distanza di lavoro dell obbiettivo. 13

14 Apertura numerica: funzione che esprime la massima quantità di luce che un obiettivo è capace di accettare e condurre alla formazione dell immagine A.N. = n.senα n = indice di rifrazione del mezzo interposto tra lente frontale e coprioggetto (aria 1, acqua 1,33, olio imm. 1,53) = metà dell angolo (di apertura) del cono dei raggi che emanano da un punto qualsiasi dell oggetto esaminato e che sono utilmente accettati dalla lente frontale supponendo che l angolo sia 180, il seno della metà angolo è = 1 cosicché il valore dell A.N. coinciderà con n (aria 1, acqua 1,33 olio imm. 1,53) A.N. Risoluzione (µm) 4x x x Maggiore è l angolo con cui l obiettivo è in grado di raccogliere la luce maggiore è il potere di risoluzione Maggiore è A.N. minore è la distanza di lavoro 40x x x

15 Ma la risoluzione dipende anche dalla lunghezza d onda della luce utilizzata R = 0,61 λ/a.n. Obiettivi Potere di risoluzione: proprietà di un obiettivo di mettere in risaltomaggiorio minoridettagli in rapporto all apertura numerica Potere di risoluzione = l 2 A.N = lunghezza d onda della luce In luce bianca è di circa 0,2 mm 15

16 Apparato di illuminazione Sorgente luminosa Diaframma di campo Condensatore: sistema di lenti che convoglia sul piano del preparato i raggi luminosi Diaframmadi apertura, serve a regolare la luce proiettata sul preparato Funzione dei diaframmi di campo e di apertura. DIAFRAMMA DI APERTURA DIAFRAMMA DI CAMPO 16

17 Il condensatore Il condensatore è posto sotto al tavolino del microscopio. Il diaframma di apertura, invia nell obiettivo un cono di luce più o meno ampio a seconda dell N.A. dell obiettivo. Permette quindi di sfruttare al massimo il potere di risoluzione del microscopio. È un sistema di lenti che converge la luce all obiettivo È fornito di un diaframma: il diaframma di apertura 17

18 IL CONDENSATORE DEVE ESSERE CENTRATO E REGOLATO IN ALTEZZA La distribuzione uniforme della luce su tutto il campo Il massimo sfruttamento dell A.N dell obiettivo L eliminazione di raggi marginali e di luce diffusa che possono ridurre la qualità dell immagine La riproducibilità delle condizioni di osservazione Regolazione del diaframma di campo Regolazione del diaframma di apertura Queste regolazioni vanno effettuate ad ogni cambio di obbiettivo DIAFRAMMA DI APERTURA DIAFRAMMA DI CAMPO 18

19 Il diaframma di campo varia la sezione del fascio ottico, illuminando superfici più o meno ampie del campo microscopico. 3 : REGOLAZIONE DEL DIAFRAMMA DI APERTURA. La sua regolazione, in funzione dell obiettivo usato, permette di inviare sul campione solo la luce necessaria ad illuminare il campo visto da quell obiettivo. NO 19

20 Tipi di microscopio Stereomicroscopio Microscopio in campo chiaro Microscopio in campo scuro Microscopio rovesciato Microscopio a contrasto di fase Microscopio interferenziale Microscopio a luce polarizzata Microscopio a fluorescenza Microscopio a luce ultravioletta Fotomicrografia di pessima qualità a causa del diaframma di apertura troppo chiuso, che determina una forte riduzione del potere di risoluzione. Microscopio elettronico a trasmissione Microscopio elettronico a scansione Microscopio elettronico ad alto voltaggio Microscopio a forza atomica Microscopio confocale Laser 20

21 La microscopia ottica comprende diversi tipi di microscopia: Microscopia ottica in campo chiaro (il classico MO) Microscopio a luce polarizzata Microscopia ottica a contrasto di fase Microscopia a contrasto di fase Microscopia a interferenza Microscopia a interferenza differenziale (di Nomarski) Microscopia ottica in campo scuro Esistono diversi tipi di microscopia che utilizzano diversi tipi di radiazioni per lo studio del campione: Microscopia ottica Microscopia elettronica Microscopia a fluorescenza Microscopia a luce ultravioletta 21

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