I METODI DI ONTRASTO A MICROSCOPIA IN CAMPO OSCURO A MICROSCOPIA IN CONTRASTO DI FASE A MICROSCOPIA IN CONTRASTO DI INTERFERENZA

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Gina Lombardi
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1 I METODI DI ONTRASTO A MICROSCOPIA IN CAMPO OSCURO A MICROSCOPIA IN CONTRASTO DI FASE A MICROSCOPIA IN CONTRASTO DI INTERFERENZA Radiolario, Lychnocanium

2 LA MICROSCOPIA IN CAMPO OSCURO a microscopia in campo scuro rivela la presenza, a non la struttura, di ampioni non visibili in ampo chiaro, sia perché rasparenti, sia perché al i sotto del potere di riso- zione del microscopio. Nosto

non visibili in ampo chiaro, sia perché rasparenti, sia

3 ale metodo conserva un certo teresse soprattutto per lo stu- io dei microrganismi e delle olveri, ma può dare immagini stremamente piacevoli anche on campioni dai particolari mol- fini come le diatomee, i radio- ri ecc., soprattutto se si usano ltri colorati. ol campo oscuro si osservano immagini di diffrazione delle uperfici dei campioni, che ap- aiono fortemente luminosi ontro un fondo nero. Diatomea, Triceratium secedens Polline germinante di Giglio

, soprattutto se si usano ltri colorati.

4 E lo stesso principio ch ci permette di vedere l luna e le stelle di notte. le particelle di polvere ntro un raggio di luce he filtra in un ambiente uio.

5 e particelle sono visibili in quanto flettono e deviano la luce che le olpisce, e in quanto l ambiente cir- ostante è scuro. er la microscopia in campo oscuro si utilizzano conden atori a specchio che inviano la luce sul campione con rte obliquità.

6 tal modo la luce diretta, ioè i raggi di ordine zero, on entrano nell obiettivo. OBIETTIVO RAGGI DI ORDINE 0 (luce diretta) CONDENSATORE a i raggi di ordine zero sono responsabili della luminosità el campo (oltre che dell im- agine principale del cam- ione): poichè mancano, il ampo sarà totalmente buio.

OBIETTIVO RAGGI DI ORDINE 0 (luce diretta) CONDENSATORE a i raggi di ordine

7 ato che la luce incide sul ampione con forte obliquità, olo i raggi diffratti entrano ell obiettivo per formare la magine. a i raggi diffratti corrispon- no a massimi di ordine su- riore e quindi solo questi ncorreranno a formare l im- agine stessa... e non potrà essere fedele quanto mancano i raggi di dine zero. OBIETTIVO RAGGI DI ORDINE SUPERIOR (raggi diffratti) CONDENSATORE Foraminifer

a i raggi diffratti corrispon- no a massimi di ordine su- riore e quindi solo questi ncorreranno

8 i osserveranno solo i con- orni luminosi del campione, entre le sue strutture in- erne saranno distorte. a formazione dei massimi i diffrazione è influenzata allo spessore dei vetrini e al mezzo di montaggio quanto riflessioni totali o arziali dei raggi di I, II o I ordine possono ridurre annullare anche le imma- ini secondarie.

a formazione dei massimi i diffrazione è influenzata allo spessore dei vetrini e

9 eve essere inoltre curata la massima pulizia, perché gni minima particella è rivelata come un punto brillant

10 LA MICROSCOPIA IN CONTRASTO DI FASEParamecium a

11 biologo ha sempre avuto necessità di osservare al icroscopio oggetti viventi, ellule o tessuti, ma questi, ssendo molto sottili e traparenti, non sono general- ente visibili. onostante ciò, la luce che erge dal preparato con- ene anche la loro immagi- e, pur se nascosta.

e traparenti, non sono general- ente visibili.

12 uando la luce di illuminazione incontra un oggetto di piezza,, come un comune preparato istologico, questo ssorbe in parte, riducendo appunto l ampiezza delle nde luminose. AMPIEZZA AMPIEZZA OGGETTO DI AMPIEZZA

questo ssorbe in parte, riducendo appunto l ampiezza

13 all oggetto di fase, colpito al cono cavo di luce, par- ono onde dirette e onde iffratte sfasate tra loro di /4 λ. ONDE SFASATE DI 1/4 l OGGETTO DI FASE OBIETTIVO DIAFRAMM ANULARE CONO CAVO DI LUCE CONDENSATORE

14 e onde dirette verranno ulte- iormente sfasate di 1/4 λ dal- anello di fase dell obiettivo, entre le onde diffratte pas- eranno inalterate. ONDE SFASATE DI 1/4 l + 1/4 l ANELLO DI FASE questo modo si determina na differenza di fase di mezza nghezza d onda tra onde di- ette e onde diffratte,, che è la tessa di un oggetto di ampieza. OBIETTIVO CONDENSATORE OGGETT DI FAS

ONDE SFASATE DI 1/4 l + 1/4 l ANELLO DI FASE questo modo si determina na differenza di fase

15 Spermatozoi di tartaruga L oggetto di fase risulta a questo punto visibile.

16 gni obiettivo per contrasto di se ha un anello di fase di ifferente diametro, er cui il condensatore sarà rovvisto di più diaframmi nulari, ciascuno abbinato ad n obiettivo (PH 1, PH2 ecc.).

17 e l anello di fase anticipa l onda diretta di 1/4 λ si parl i contrasto di fase positivo. ANTICIPO e invece la ritarda di 1/4 λ si parla di contrasto di fas egativo. RITARDO

18 el primo caso oggetti con dice di rifrazione più alto l mezzo che li circonda pariranno scuri contro fondo chiaro. Coltura di cellule renali Pollini di Althea Se invece hanno indice di rifrazione più basso appa- riranno chiari su un fondo scuro. el contrasto di fase negativo i rapporti sono opposti.

Coltura di cellule renali Pollini di Althea Se invece hanno indice di

19 LA MICROSCOPIA IN CONTRASTO DI INTERFERENZA Larva di Riccio di mare Micromanipolazione

20 quanti di un raggio di luce ibrano con moto ondulato- io perpendicolarmente alla irezione di propagazione el raggio. gni raggio di un fascio di ce si propaga oscillando un suo piano, per cui in n fascio di luce esisteran- o tutti i possibili piani di scillazione. PIANO DI VIBRAZIONE DIREZIONE DI PROPAGAZIONE PIANI DI OSCILLAZIONE

gni raggio di un fascio di ce si propaga oscillando un suo piano, per cui in n

21 uando i quanti di tutti i raggi luminosi del fascio di luc scillano in piani paralleli tra loro, il fascio di luce si dice olarizzato. RAGGIO POLARIZZATO FILTRO POLARIZZATORE n fascio di luce può venire polarizzato facendolo passa e attraverso un particolare filtro, detto appunto polari atore.

22 sando due filtri polarizzatori (detti rispettivamente po rizzatore e analizzatore), la luce polarizzata dal primo otrà passare attraverso il secondo solo se i piani di po rizzazione di ambedue i filtri saranno paralleli. RAGGIO POLARIZZATO LUCE! Piani paralleli FILTRO POLARIZZATORE FILTRO ANALIZZATORE

23 e invece i piani di polarizzazione saranno perpendicola, il secondo filtro fermerà il passaggio dei raggi lumino i. Tale situazione è detta a polarizzatori incrociati. BUIO! Piani perpendicolari FILTRO POLARIZZATORE FILTRO ANALIZZATORE

24 microscopio a contrasto di interferenza differerenzial IC) di Nomarski,, si basa sull interferenza di due raggi olarizzati con piani perpendicolari tra loro. Anch esso permette di aumentare il contrasto degli oggetti di fase rendendoli visibili.

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