EVIDENZE IGRA Tests: specificità
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- Pio Ladislao Di Giovanni
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1 IGRA Diagnosi immunologica di infezione acuta e latente Myco-09 corso di micobatteriologia avanzata DM Cirillo, HSR Milano Interferon Gamma Release Assay TEORIA: i linfociti T precedentemente sensibilizzati con antigeni tubercolari producono alte concentrazioni di IFN-gamma quando riesposti allo stesso antigene. IGRA Cellestis QuantiFERON-TB Gold In-Tube Oxford Immunotec T-SPOT.TB Antigeni specifici ESAT6 CFP10 Presenti in tutti gli organismi del MTB complex ASSENTI nel BCG (RD1) ASSENTI nella maggior parte dei micobatteri non-tubercolari EVIDENZE IGRA Tests: specificità Specificità TST alta in individui non vaccinati, bassa o variabile nei vaccinati IGRAs alta specificità (QFT>Tspot) Specificità >TST Non modificati da BCG Molto utili in settings in cui la vaccinazione viene ripetuta dopo la nascita Sensibilità degli IGRAs variabile rispetto a TST e popolazione dipendente: QFT=TST QFT> in popolazioni a bassa incidenza rispetto alle popolazioni ad alta incidenza Tspot > sensibilità rispetto a a QTF e TST In popolazionei a bassa incidenza correla meglio con i livelli di esposizione Pai M, Zwerling A, Menzies D. Ann Int Med 2008; 149: Review sistematica e aggiornata Eccellente specificità del QFT (meno dati disponibili sul T-spot commerciale) Alta specificità del TST in soggetti non-bcg vaccinati ma bassa e variabile in soggetti BCG vaccinati Sensibilità del TST e degli IGRA test non consistente tra test e tra popolazioni (differenti)?? T-spot più sensibile del QFT/TST
2 LTBI: specificità e sensibilità (Pai 2006) Sensibilità 75%-97% Specificità 92%-98% IGRA e TB attiva QFT sensibilita TB attiva 55-88% TST 33-90% elispot 83-95% IGRA e EP-TB T SPOT TB: peptidi utilizzati Song 2008 QFT-G 48 EP-TB casi confermati (110 totali) Sensibilità 69% Specificità 87% Non può essere utilizzato come unico criterio per la diagnosi di EP-TB 17 peptidi ESAT-6 18 peptidi CFP-10 QF-TB Gold: peptidi utilizzati T-SPOT.TB 6 peptidi CFP-10 1 peptide TB peptidi ESAT-6 Utilizza gli antigeni TBC-specifici ESAT-6 6 e CFP- 10 Cellule mononucleate vengono estratte da 8 cc di sangue (PBMC), isolate ed esposte agli antigeni TBC-specifici. Dopo incubazione overnight,, si contano i linfociti T che producono IFN-γ. I casi di indeterminati non sono frequenti; è un test definito laboratory intensive.
3 QuantiFERON-TB Gold In- Tube TST e IGRA 1ml di sangue intero viene esposto agli antigeni ESAT6, CFP10 and TB7.7, al controllo negativo (nulla) e positivo (mitogeno)) in tre diverse provette Dopo incubazione overnight il plasma viene estratto e la concentrazione di IFN-γ determinata mediante ELISA. Cut-off arbitrario per determinare i risultati positivi TEST TST IGRA IGRA - TST VANTAGGI Molto studiato Trials clinici basati sui risultati del TST Economico Alta specificità Simile sensibilità 1 visita SVANTAGGI 2 visite Specificità inferiore (BCG) Sensibilità inferiore in immunocompromessi operatore dipendente MOLTI DATI CONTRASTANTI Costi ($35-$120 $120 US) Risultati indeterminati Risposta CD4 specifica Se un individuo è esposto alla TBC Le cellule CD4 dovrebbero reagire a ESAT6 e CFP10 Queste producono IFN-γ Che può essere misurato - nel siero - oppure colorando le cellule reattive All Theories of memory cell development suggest memory T cell formation is a function of withdrawal of antigen (Kaech et al 2002) Effector cells are detected by IFN-γ tests Effector cells produce IFN-γ within a few hours of stimulation Memory cells must proliferate, and take >24 hours before significant IFN-γ production Most in vitro IFN- γ tests incubate for <24 hours The IFN-γ is from effector T cells
4 QuantiFERON -Gold In Tube QuantiFERON -Gold In Tube Fase 1 Raccolta del sangue Fase 2 Interferone-γ ELISA Nil TBC Mitogeno 3x1mL campioni sangue Incubazione a 37ºC per16-24 ore Centrifugare per 5 min. Il plasma si conserva per massimo 8 settimane.a 2-8 C, per anni a -20 C Aggiunta di plasma e coniugato Incubazione per 120min. a temperatura ambiente Lavaggio e aggiunta di substrato Aggiunta della.stopsolution e lettura dell assorbanza Calcolo e stampa dei risultati Opzione 1: Trasporto dei campioni in laboratorio entro 16 ore dalla raccolta, prima dell incubazione. Opzione 2: Trasporto dei campioni in laboratorio entro 3 giorni dall incubazione. Standard ELISA User-friendly software fornito gratuitamente da Cellestis Non necessita di nuove apparecchiature Possibilità di raggruppare i campioni. Step 1 Preparazione delle cellule Step 2 Formazione degli spot Sangue raccolto in tubi Vacutainer CPT Centrifugazione dei tubi Rimozione dell anello linfocitario Lavaggio e conta cellule Cellule trasferite su piastra a 96 pozzetti Aggiunta degli antigeni nei pozzetti Incubazione overnight Lavaggio della piastra Aggiunta di soluzione coniugato per 60 minuti Lavaggio della piastra Aggiunta del substrato; formazione di spot dopo 7 minuti Lavaggio ed asciugatura della piastra Neg. Pos. Step 3 Conta degli spots Conta visiva degli spot utilizzando una lente di ingrandimento o un microscopio a dissezione Come alternativa, utilizzare un elispot reader automatizzato Piastra inserita nel reader per lettura automatica Il computer registra tutte le immagini, compila in maniera non modificabile un registro di controllo, e calcola il numero di spot in ogni pozzetto Fotocamera e criteri di analisi sono predisposti automaticamente Above: Automated T-SPOT plate reader
5 CDC Nelle Guidelines for the Investigation of Contacts of Persons with Infectious Tuberculosis (CDC Atlanta, 2005) si suggerisce che il QFT-G assay POTREBBE essere usato al posto del TST in tutti i casi (Dr.( Vernon) NICE National Institute for Health and Clinical Excellence TB guidelines (Regno Unito, 2006) si consiglia uno screening iniziale con TST seguito da un test IGRA (se disponibile) per i casi TST+, oppure (se il risultato del TST non è affidabile) per la conferma del TST Canadian Guidelines IGRAs are recommended for: 4. Contacts of active TB Close contacts (HIGH RISK) can get both TST and IGRA and if either is positive, be treated for LTBI Casual contacts (LOW RISK) can have IGRA confirmation if TST positive to verify infection vs BCG or MOTT 5. Immunocompromised TST first, if negative do IGRA and if IGRA positive treat as LTBI 6. Low risk people who are TST positive Do an IGRA, if positive consider as LTBI 2007 Canadian Guidelines IGRAs not recommended for: 1. Serial testing 2. Children 3. Immigrant screening 7. Diagnosing active TB 2007 Canadian Guidelines DIAGNOSIS OF ACTIVE TB DISEASE IGRA sensitivity in active TB has been found to be comparable to the sensitivity of TST (up to 30% negative). This reflects the diminished immune response in patients with active TB particularly in those with more advanced disease, malnutrition or older age. Therefore, IGRAs are NOT recommended for the diagnosis of active TB. Screening della popolazione NESSUNA strategia è costo efficace se l incidenza della LTBI < 10%. Con incidenza della LTBI del 10-40%, il test della tubercolina a 2-step, 2 seguito da un test IGRA sui pazienti positivi alla tubercolina, è cost-effective effective. L uso del solo IGRA test è costo efficace SOLO SE l incidenza l della LTBI è 40%.
6 Test nei bambini Test nei bambini QuickTime and a decompressor are needed to see this picture. A total of 243 children (median age: 18 months) were recruited,88% had interpretable T-SPOT.TB results. Children >12 months of age were more likely than younger children to have positive T-SPOT.TB resuts TSTs were unaffected by age. CONCLUSIONS. For young children presenting in a community setting after exposure to tuberculosis or with symptoms suggesting tuberculosis, T-SPOT.TB cannot be used to exclude active disease. The sensitivity of this assay may be impaired for very young children. Data for 207 children with valid tuberculin skin test and QuantiFERON-TB Gold In-Tube test results: excellent correlation between negative tuberculin skin test results and negative QuantiFERON-TB Gold In-Tube only 23% of children with positive tuberculin skin test results had positive QuantiFERON-TB Gold In-Tube Positive QuantiFERON-TB Gold In-Tube test results were associated with increased likelihood of M tuberculosis exposure. Younger children produced lower interferon levels Performance characteristics were similar across all age groups. CONCLUSION The QuantiFERON-TB Gold In-Tube test is a specific test for M tuberculosis exposure in children performance characteristics similar to those for adultsin regions with low levels of endemic disease. Concerns about test sensitivity, especially for young children will require additional prospective long-term evaluation. Pediatrics 2009;123:30 37 IGRA e HIV Stephan et al AIDS 2008 Scopo del lavoro: valutazione incidenza e fattori di rischio in HIV+ e pragone tra i test 286 pazienti in paese a bassa prevalenza Entrambi IGRA più sensibili di TST ma meno sensibili che in non HIV Bassa concordanza tre i test Tspot indipendente dalla conta di CD4 Alcune questioni fondamentali ancora poco chiare Qual è il valore predittivo degli IGRA nello sviluppo di una TBC attiva? Qual è l interpretazione delle conversioni e delle reversioni del test IGRA? Qual è la prognosi di una conversione IGRA? Possiamo utilizzare i livelli di IFN-gamma per diagnosticare la malattia? Può un TST boosterare successive risposte IGRA? IGRA Tests PPV? Menzies et al. Meta-analysis analysis: : New test for the diagnosis of LTBI: areas of uncertainty and recommendations for research. Ann Int Med 2007:146: I nuovi test IGRA si rivelano un importante promessa e posseggono un eccellente specificità.. Ulteriori studi sono necessari per una più accurata valutazione delle performance in popolazioni ad alto rischio e nel testing seriale. Studi longitudinali sono necessari per definire il valore predittivo degli IGRA test. NPV Il Valore Predittivo Negativo di un test negativo non è ancora stato definito nén in setting ad alta prevalenza nén in quelli a bassa prevalenza
7 IGRA e anti TNF alfa Raccomandazioni per lo screening della TBC prima di una terapia anti-tnf TNF-alfa,, in Svizzera: Swiss Med Wkly 2007; 137: (November( 3, 2007) (Official( journal of the Swiss ID, GIM and Resp. Societies) Screening raccomandato utilizzando la storia del paziente, e IGRA test invece del TST. Indeterminato significa utilizzare solo la storia del paziente e la RX torace, con approccio conservativo.? Ruolo degli IGRA pre-tnf Dati solo da alcune coorti Pratt A et al. Rheumatology pazienti AR, 99% bianchi Età media 55; 78.5% BCG vaccinati 7 QFT+ ; 84 QTF- ; 11 indeterminati 6-30 mesi di FU (media 18.3) No TBC (ma..) IGRA Testing pre TNF Incidenza TBC, bianchi, 50 anni = 5/ Incidenza LTBI, bianchi, 50 anni = 50/ Perciò: veri positivi = 1/2.000 Numero di test IGRA per veri +vi = QFT (a 35) = T-Spot (a 100) = IGRA testing pre TNF In gruppi ad alto rischio (Asia meridionale /neri-africani, nati all estero) Circa 200/ malati 2.000/ LTBI 50 test per individuare 1 vero positivo QFT, oppure T-spot Ma il NPV di un test negativo NON È ANCORA NOTO Effetto della vaccinazione con BCG sul TST Analisi di 24 studi con N = 240,243 soggetti Quando il BCG è somministrato nell infanzia, 6% falsi-positivi nei risultati del TST a causa del BCG Quando il BCG è somministrato dopo l infanzia, 40% falsi-positivi a causa del BCG Vantaggi degli IGRA s nei test seriali I test IGRA offrono alcuni vantaggi nei test seriali : una più alta specificità mancanza di effetti dovuti al BCG numero inferiore di visite richieste non necessita di un protocollo a 2-step il boosting non rappresenta un problema
8 Prima che gli IGRA possano essere usati efficacemente nel test seriale vi sono alcune domande a cui è necessario rispondere 1. Qual è la riproducibilità della risposta dei linfociti T nel tempo 2. Cos è una reversione IGRA e qual è il valore soglia per definire una reversione? 3. Cos è una conversione IGRA e qual è il valore soglia per definire una conversione? 4. Qual è l associazione tra una conversione IGRA e il rischio di progressione a malattia? 5. Il trattamento dei casi di conversione IGRA riduce il rischio di progressione a malattia? Cosa sappiamo della riproducibilità della risposta dei linfociti T nel tempo? I dati sono limitati Se ulteriori studi confermeranno queste scoperte: Se i risultati IGRA intorno al cut-off mostrano una maggiore oscillazione allora ciò ha implicazioni sulla reversione e conversione Gli IGRAs sono troppo dinamici da compromettere la stabilità nei test seriali? Può la natura dinamica spiegare gli alti tassi di reversione? Il fatto che i casi IGRA-positivi in pratica non sono ritestati, può essere rilevante? Nella pratica clinica, i casi TST-/IGRA+ dovrebbero essere ritestati? Riproducibilità del QTBgoldIT Cosa sappiamo della reversione IGRA? Le reversioni sono ben documentate Le reversioni sono meno probabili quando i risultati baseline sono doppi-positivi (TST+/IGRA+) Nei doppi-positivi si attende una marcata risposta IFN-gamma Le reversioni sono più probabili quando i i livelli basali sono discordanti (TST-/IGRA+) I risultati discordanti sono in genere risposte deboli Bassi livelli di IFN- gamma are sono vicini al cut-off variazioni non-specifiche intorno al cut-off possono portare a reversione Quindi, perché le reversioni avvengono? 1. Alcune reversioni potrebbero riflettere la scomparsa dell infezione 2. Alcune reversioni potrebbero semplicemente essere dovute a variazioni biologiche ( oscillazione ) negli IGRA-positivi, e noi selezioniamo pazienti che si trovano nella fase di diminuzione della risposta all infezione 3. Alcune reversioni potrebbero essere dovute a variazioni nelle procedure di laboratorio (manipolazione del campione, lavaggio nell ELISA, etc.) Conversioni Domande chiave: Quale aumento nella concentrazione di IFN-gamma è biologicamente indicativo di una nuova infezione, e quanto è dovuto al solo test o è oscillazione biologica? Dovremmo usare il cut-off diagnostico anche per le conversioni? Qual è il miglior modo per stabilire i cutoff?
9 Cosa sappiamo delle conversioni IGRA? Le reversioni sono ben documentate A seconda del cut-off usato per la conversione, i livelli variano molto! Se per definire le conversioni si usa un semplice cutoff negativo-positivo, allora le conversioni saranno maggiori con IGRA che con TST (Pai et al, 2006; Pai et al, 2009 & Corbett et al, 2006) Ciò può indicare una maggiore sensibilità per le conversioni (non necessariamente per diagnosi ) Ad ogni modo, parte dei maggiori livelli di conversioni è probabilmente dovuta a variazioni minori non-specifiche introno al cut-off (Pai et al, AJRCCM 2006; Pai et al. IJTLD 2009) Un cut-off più stringente per la conversione potrebbe aiutare ad evitare di interpretare variazioni minori come conversioni Associazione tra i livelli di IFNgamma e il rischio di progressione a malattia Evidenza diretta limitata nell uomo La correlazione con la carica batterica e la patologia può essere solo dedotta Però, è stato suggerito che il forte incremento nella risposta linfocitaria T agli antigeni RD1 potrebbe essere predittivo di TBC attiva Questo dev essere ancora confermato sebbene siano disponibili dati verosimili e supportati da alcuni dati indiretti Effetto Booster del TST su IGRA s Il prelievo va effettuato entro tre giorni dal TST Riflessioni conclusive NON approvato per la diagnosi o alla gestione di casi di malattia attiva NON differenzia i casi di malattia da quelli di infezione. Falsi Neg.. nei casi di malattia attiva Utilità NON dimostrata nel monitoraggio della terapia Altri studi su coorti di pazienti sono necessari per definire PPV e NPV Mancano dati sui bambini inferiori a 2 anni Riflessioni conclusive I test basati su linfociti T sono dinamici e inclini a conversioni e reversioni Dovremo definire una soglia per la conversione, basata su dati empirici e studi di riproducibilità La prognosi delle conversioni e reversioni IGRA dovrà essere determinata Soggetti con marcato aumento in risposte IFN-gamma hanno maggiore probabilità di progredire verso la malattia (questo potrebbe non essere vero per la riattivazione della TBC) Nei soggetti immonodepressi sensibilità maggiore rispetto al TST con Tspot meno influenzato dal numero di linfociti Studi di coorte sono necessari per rispondere a questioni fondamentali e fornire dati che aiutino a interpretare i risultati degli IGRA test seriali
10 Giustificato economicamente il test a 2 step,, come indicato nel NICE per lo screening dei contatti e generale Esclude i falsi positivi dovuti a BCG and MNT Economicamente non giustificato l uso l di pre-tnf Rx in popolazioni ad incidenza molto bassa
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