Vaccini di origine vegetale contro i tumori associati al virus del papilloma umano (HPV)

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1 Workshop ENEA, 4 dicembre 2003 Molecular farming: produzione di cibi funzionali, di nutraceutici e biofarmaceutici Vaccini di origine vegetale contro i tumori associati al virus del papilloma umano (HPV) Rosella Franconi BIOTEC GEN

2 SOMMARIO Definizioni 2. Il problema: il virus del papilloma umano Caratteristiche Vaccini profilattico Vaccino terapeutico 3. Le piante per lo sviluppo di vaccini anti-hpv a) le piante come biofabbriche b) sequenze da virus vegetali per vaccini a DNA 4. Conclusioni e sviluppi

3 Definizioni ANTIGENI tutte le molecole in grado di indurre una risposta immunitaria VACCINI A SUBUNITA Viene usata solo una parte del patogeno capace di indurre una risposta immunitaria. ADIUVANTE sostanza in grado di aumentare l immunogenicità di un dato antigene Molti allo studio ma solo pochi approvati per uso umano (es. alcuni sali minerali: idrossido di alluminio, fosfato di calcio). Non sono noti i meccanismi di azione

4 Principali vantaggi: Svantaggi: Vaccini a subunità Sicurezza (utilizzata solo una parte del patogeno) Possono essere prodotti in forma ricombinante Le proprietà dell immunogeno possono essere migliorate (da fusioni geniche o mutagenesi) Poco immunogenici (richiedono adiuvanti e dosi multiple) Costosi e poco stabili

5 Esempi di vaccini a subunità (ricombinanti) Vaccini basati su singole proteine o peptidi Esempio vaccino anti-epatite B. Espressi in sistemi eterologhi come cellule di batterio, lievito, mammifero, insetto e pianta Vaccini a DNA (vaccini genetici) Viene inoculato direttamente il plasmide che contiene il gene di interesse

6 Principi di base della vaccinazione Quando si disegna un vaccino è necessario considerare il tipo di risposta immune desiderata IMMUNITA UMORALE (anticorpi: es. IgG, IgA) essenziale per l eliminazione di patogeni extracellulari IMMUNITA CELLULO-MEDIATA (citotossica, CTL) richiesta per l eliminazione di patogeni intracellulari (es. virus) o cellule tumorali

7 Il problema: il virus del papilloma umanohpv 55 nm

8 HPV e Cancro Più di 120 tipi di cui circa 30 tipi infettano le mucose genitali basso rischio (HPV 6, 11): condilomi alto rischio (HPV 16, 18, 31, 33, 45) agenti causali di più del 99.7% del cancro alla cervice (anche anogenitali e alcuni tumori testacollo) Più del 50% dei tumori al collo dell utero sono dovuti a HPV16

9 Proteine virali Le proteine di HPV Funzioni E6 oncoproteina E7 oncoproteina (17 KDa) E5 oncoproteina E2 fattore di trascrizione/replicazione E1 fattore di replicazione E4 facilita l escape virale (?) L1 proteina capsidica (55 KDa) L2 proteina capsidica

10 Integrazione virale nelle cellule cancerose

11 Integrazione virale nelle cellule cancerose

12 Prevenzione e diagnosi del cancro al collo dell utero PAP test (metodo di screening, 20% falsi negativi) Metodi molecolari per identificare il virus (S-blot( S-blot, ibridazione in situ PCR etc.) Vaccino profilattico In un futuro prossimo: Anticorpi per individuare le oncoproteine virali (E5, E6, E7) espresse nelle fasi cancerose

13 Vaccino profilattico anti-hpv 2002: anno del vaccino profilattico anti-hpv. Basato sulla proteina L1 prodotta in lievito che si auto-assembla in Virus Like Particles (VLPs) VLPs Induce anticorpi neutralizzanti contro il virus in grado di prevenire l infezione. Sicuro e ben tollerato. Disponibile commercialmente tra 3-4 anni Tuttavia gli alti costi di produzione e distribuzione non permetteranno una applicazione diffusa di questo vaccino

14 Terapia del tumore del collo dell utero Chirurgia, radio-terapia, chemio-radio-terapia Circa il 35% delle pazienti sviluppa malattia persistente o metastasi, per le quali non esiste adeguata terapia In futuro: vaccini terapeutici

15 Vaccino Terapeutico Deve stimolare una risposta immunitaria di tipo citotossica (CTL) contro proteine non-strutturali in modo di promuovere la regressione del tumore. Candidati: proteine E6 e E7 (Antigeni specifici del Tumore). Poco immunogeniche. Molti trial clinici in corso basati su E7, come DNA o come proteina

16 Espressione di proteine eterologhe in pianta > SISTEMI DI ESPRESSIONE TRANSGENICA (nucleare-il gene eterologo è trasmesso alla progenie. Es. trasformazione mediata da Agrobatterio) > SISTEMI DI ESPRESSIONE TRANSIENTE BASATI SU VIRUS VEGETALI (il gene eterologo non è ereditato dalla progenie. Es. infezione con virus X della patata, PVX)

17 Attività 1: Vaccino profilattico basato sulla proteina L1 espressa in modo stabile Risultati: molte linee transgeniche di pomodoro che esprimono il gene L1 L eventuale assemblaggio di L1 in VLPs verrà valutato (anche mediante TEM)??????

18 Attività 2: Vaccino terapeutico basato sulla proteina E7 espressa in modo transiente tramite PVX E7 RISULTATI: a) L oncoproteina E7 è espressa in piante di N. benthamiana

19 b) Gli estratti di pianta contenenti E7 inducono una risposta immunitaria nel topo OD450nm 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Nb-PVXwt Nb-PVXE7 His-E7+Quil A IgGtot IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 + IFN-gamma ELISPOT Numbers/2x10 5 Splenocytes none With E7 peptide (aa ) Without E7 peptide Nb-PVXwt Nb-PVXE7 His-E7+Quil A His-E7+Nb-PVXwt Umorale (anticorpi) Cellulo-mediata (ELISPOT su splenociti di topi vaccinati che producono Interferon-γ)

20 c) I topi vaccinati con gli estratti di pianta sono protetti dal tumore % Tumour free animals Nb-PVXE His-E7 + Quil A Nb-PVXw t 60 none Days after C3 challenge d) I topi vaccinati con gli estratti di pianta presentano ridotta massa tumorale Tumour volume (cm 3 ) Nb-PVXE7 His-E7 + Quil A Nb-PVXw t none Days after C3 challenge Il volume del tumore è il 15% di quello dei topi non vaccinati

21 Brevetto ENEA/ISS/IRE FRANCONI R. et al. (2001) Vaccini a subunità e procedimenti per la loro produzione PCT/IT02/00354.

22 Conclusioni Stabilita una procedura economica ed efficace per produrre un vaccino antitumorale da pianta basato sulla proteina E7 Lavoro futuro Comprendere la natura dei macroaggregati e l effetto adiuvante dell estratto di pianta Aumento dei livelli di espressione e purificazione della proteina E7 per sua caratterizzazione biochimica

23 S. Massa E. Illiano E. Benvenuto O. Bitti R. Franconi ENEA, BIOTEC GEN Prof. S. Duprè Dip. Biochimica Università La Sapienza,, Roma A. Cirilli A. Muller P. Simeone A. Venuti Lab. di Virologia, Istituto Regina Elena, Roma L. Accardi P. Di Bonito M. G. Donà C. Giorgi Lab. di Virologia Istituto Superiore di Sanità, Roma Finanziamenti PNR AIDS Associazione italiana Ricerca sul Cancro (AIRC) Ricerca Finalizzata Ministero della Salute 2000, 2002

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