ACTAFARMA SLL - MADRID REVIDOX

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1 In collaborazione con: UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PAVIA Prof. FULVIO MARZATICO LABORATORIO di FARMACOBIOCHIMICA Sezione di SCIENZE FARMACOLOGICHE e TOSSICOLOGICHE Studio clinico-strumentale, in doppio cieco, randomizzato e controllato con placebo dell efficacia di un integratore alimentare Double-blind, randomized, placebo-controlled clinicalinstrumental assessment of the efficacy of a dietary supplement ACTAFARMA SLL - MADRID REVIDOX

2 KEY PERSONNEL Cliente Customer GMC Pharma Via Melloni, Milano (MI) Italy Per To: ACTAFARMA SLL - MADRID Supervisore Scientifico Scientific supervisor Prof. Fulvio MARZATICO Docente presso l Università di Pavia. Professor at the University of Pavia. Laboratorio di Farmacobiochimica Laboratory of Pharmacobiochemistry Sezione di Farmacologia e Tossicologia Section of Pharmacology and Toxicology Piazza Botta, Pavia. Italy Tel. (0382) Fax (0382) Sperimentatore Investigator Dr. Enza CESTONE Medico chirurgo specialista in Dermatologia e Venereologia Degree in Medicine and Surgery, Specialist in Dermatology and Venereology Consulente FarcoDerm s.r.l. Consultant to FarcoDerm s.r.l. Direttore dello studio e Controllo Qualità Study director and Quality control Dr Vincenzo NOBILE Research and Development Specialist (Biologo) (Biologist) Farcoderm s.r.l. Via Angelini, San Martino Siccomario (PV) Direttore tecnico: Technical Director: Dr. Angela MICHELOTTI (Biologo) (Biologist) Pagina 2 di 42 Page 2 out of 42

3 DISEGNO DELLO STUDIO STUDY DESIGN 1.1. Titolo Title Studio clinico-strumentale, in doppio cieco, randomizzato e controllato con placebo dell efficacia di un integratore alimentare. Double-blind, randomized, placebo-controlled clinical-instrumental assessment of the efficacy of a dietary supplement 1.2. Scopo dello studio Aim of the study Lo studio è destinato a valutare gli effetti cutanei e sistemici dell assunzione di un integratore alimentare a base di Resveratrolo. È in particolar modo valutata l efficacia del prodotto: a) nel coadiuvare il miglioramento del quadro clinico cutaneo di soggetti che presentano gli inestetismi e/o le alterazioni tipiche indotte dall invecchiamento, b) nell aumentare il pool di antiossidanti cutanei, c) nel ridurre lo stress ossidativo a livello sistemico e d) nello stimolare l espressione della proteina nucleare SIRT-1. Allo scopo viene effettuato uno studio clinico-strumentale su un gruppo omogeneo di 50 soggetti (25 soggetti per braccio di trattamento) che presentano un quadro clinico-cutaneo caratterizzato dai segni dall invecchiamento cutaneo cronologico o fotoindotto. L efficacia del prodotto viene valutata a distanza di 60 giorni di trattamento e prevede le seguenti valutazioni: a) valutazione in vivo ed in situ degli effetti cutanei del prodotto mediante tecniche non invasive di bioingegneria cutanea e b) valutazione degli effetti sistemici del prodotto mediante tecniche biochimiche. Lo studio è completato dall analisi clinica del dermatologo e dall autovalutazione dei soggetti partecipanti allo studio. The study is aimed at evaluating the cutaneous and systemic effects of a dietary supplement containing Resveratrol. In particular it is evaluated the efficacy of the product in: a) coadjuvate the improvement of the clinical features of subjects having skin imperfections/alterations due to ageing, b) improving the pool of skin antioxidants, c) reducing the systemic oxidative stress, and d) stimulating the expression of the nuclear protein SIRT-1. In order to reach this goal, a clinical-instrumental study is carried out on 50 subjects (25 subjects per treatment arm) showing the clinical features induced by the chrono- or photoageing. Product efficacy is evaluated after 60 days of treatment and foresee for: a) the in vivo and in situ evaluation of the skin effects by means of non-invasive bioengineering technique, and b) the evaluation of the systemic effects by means of biochemical techniques. The instrumental analysis is followed by both clinical evaluation by dermatologist and self-assessment by volunteers Natura dello studio Study design Lo studio viene condotto come segue: in doppio cieco, né il soggetto sperimentate né il soggetto sperimentatore sono a conoscenza dell allocazione dei trattamenti attivo e placebo; controllato con placebo, lo studio viene condotto a confronto con i risultati ottenuti in un gruppo di soggetti che utilizza il prodotto placebo; randomizzato, i due bracci di trattamento attivo e placebo sono randomizzati secondo una appropriata procedura statistica (Efron s biased coins). La randomizzazione viene effettuata dal Responsabile dello studio. Allo scopo di evitare le fonti di variabilità dovuti alle diverse abitudini cosmetologiche, ai soggetti è consegnata una crema (giorno/notte) ed un detergente senza nessuna efficacia vantata. Al momento dell arruolamento e durante tutto il periodo dello studio, sono indagate le abitudini alimentari dei soggetti in modo da poter valutare la frequenza di assunzione di cibi (frutta e verdura) a noto potenziale antiossidante. The study is carried out as follows: in double-blind conditions, neither the subject nor the investigator are aware about the allocation of both active and placebo products; placebo-controlled, The study is carried out in comparison with the results obtained in a group of subjects who use the placebo product; randomized, both active and placebo treatment are randomized according to an appropriate statistical procedure (Efron's biased coins) performed by the study director. Pagina 3 di 42 Page 3 out of 42

4 In order to avoid the sources of variability due to different habits regarding cosmetic products, subjects are given a cleansing lotion and a base cream (day / night) with no efficacy claimed. At enrolment and during the study period, the eating habits of the subjects are investigated in order to assess the frequency of intake of foods (fruits and vegetables) having known antioxidant potential Prodotto sottoposto a studio Tested product Informazioni fornite dal Cliente Information provided by the Customer Nome del prodotto: Product name: Revidox L 0019 (Active) Revidox F 0019 (Placebo) Ingredienti: Ingredients: Ingrediente Ingredient Uva (Vitis vinifera) frutto estratto secco Grapes (Vitis vinifera) fruit dry extract trans-resveratrolo trans-resveratrol Procianidine Procyanidins Antocianosidi Anthocyanosides Flavonoidi Flavonoids Altri stilbeni Other Stilbenes Melograno (Punica granatum) frutto estratto secco Pomegranate (Punica Granatum) fruit dry extract Procianidine Procyanidins Punicalagine-ac. Ellagico Punicalagins-Ellagic acid Selenio Selenium Diossido di silicio Silicon dioxide Stearato di magnesio Magnesium stearate per capsula per capsule 133 mg 8 mg 14,63 mg 0,67 mg 0,4 mg 1,3 mg 125 mg 3,75 mg 8,75 mg 50 mcg 26 mg 16 mg Maltodestrina Maltodextrin 45 mg Capsula 0 (Gelatina E-171) Capsule O (Gelatin E-171) 1 Modalità d uso: How to use: 1 capsula al giorno, il mattino preferibilmente a digiuno. 1 capsule per day, preferably on the morning preferably on an empty stomach. Altre informazioni: Other information: - Indicazioni: Indications: REVIDOX è il complemento alimentare che agisce dall interno per combattere l invecchiamento cellulare, determinando risultati visibili anche a livello cutaneo. Revidox is the dietary supplement that acting from inside helps to counteract the cellular ageing, determining also visible cutaneous effects. - Avvertenze: Precautions: Non superare la dose giornaliera consigliata. Tenere fuori dalla portata dei bambini al di sotto dei 3 anni. Do not exceed the recommended daily dose. Keep out of reach of children under 3 years. - Speciali precauzioni per la conservazione: Special precautions for storage: Conservare in luogo fresco ed al riparo dalla luce e dall umidità. Store in a cool place away from light and moisture. - Notifica ministeriale: accettata dal Ministero del Lavoro, della Salute e delle Politiche Sociali - Settore Salute in data 01 dicembre Ministerial notification: accepted by the Ministry of Labour, Health and Social Policy - Health Sector on 01 December Requisiti etici Ethical requirements Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico Indipendente per le Indagini Cliniche Non Farmacologiche (in data ) e condotto in soddisfazione dei seguenti requisiti etici. The study was approved by the Independent Ethical Committee for Non-Pharmacological Clinical Investigations (on ) and carried out in accordance with the following ethical requirements Tutti i soggetti partecipanti allo studio, sono volontari sani di almeno 18 anni di età. All the subjects participating in the study are healthy volunteers of at least 18 years old Tutti i soggetti partecipanti allo studio sono selezionati sotto la supervisione del dermatologo con l applicazione di criteri di inclusione/non inclusione (vedere ). All of the subjects participating in the study are selected with the supervision of a dermatologist according to inclusion/not inclusion criteria (see ). Pagina 4 di 42 Page 4 out of 42

5 Tutti i soggetti partecipanti allo studio, sono volontari informati sullo scopo e la natura dello studio. All of the subjects participating in the study are informed of the aim and the design of the study Tutti i soggetti partecipanti allo studio, sono informati del possibile rischio coinvolto nella esecuzione dello studio. All of the subjects participating in the study are informed of the possible risk involved in the study execution Tutti i soggetti partecipanti allo studio forniscono un consenso informato scritto firmato (vedere allegato 1) prima dell inizio del lo studio. All of the subjects participating in the study give their informed consent signed at the beginning of the study Prima che i volontari siano esposti al prodotto in analisi, sono state valutate tutte le informazioni di sicurezza rilevanti sul prodotto e sui suoi singoli componenti. Before volunteer exposure to the tested product, all relevant safety information about the product itself and each ingredient were collected and evaluated Tutte le procedure dello studio sono eseguite in conformità con i principi etici per la ricerca in campo medico (Principi etici per la ricerca medica che coinvolge soggetti umani, adottata dalla 18a Assemblea Generale dall AMM a Helsinki, Finlandia, nel giugno 1964 ed emendata dalla 29a Assemblea Generale a Tokyo, Giappone, nell'ottobre 1975, dalla 35a Assemblea Generale a Venezia, Italia, nell'ottobre 1983, dalla 41a Assemblea Generale a Hong Kong, nel settembre 1989, dalla 48a Assemblea Generale a Somerset West, Repubblica del Sud Africa, nell ottobre 1996, dalla 52a Assemblea Generale a Edimburgo, Scozia, nell ottobre 2000, dalla 53a Assemblea Generale a Washington, 2002 (nota esplicativa sul paragrafo 29), dalla 53a Assemblea Generale a Tokyo, 2004 (nota esplicativa sul paragrafo 30) e dalla 59a Assemblea Generale a Seoul, nell ottobre All of the study procedures are carried out in compliance with the ethical principles for the medical research (Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, adopted by the 18th WMA General Assembly Helsinki, Finland, June 1964 and amended by the 29th WMA General Assembly, Tokyo, Japan, October 1975, 35th WMA General Assembly, Venice, Italy, October 1983, 41st WMA General Assembly, Hong Kong, September 1989, 48th WMA General Assembly, Somerset West, Republic of South Africa, October October 1996, 52nd WMA General Assembly, Washington, 2002 (note of clarification on paragraph 29), by the 53th WMA General Assembly, Tokyo, 2004 (note of clarification on paragraph 30) and by the 59a WMA General Assembly, Seoul, October 2008) Sono prese tutte le precauzioni necessarie per evitare il verificarsi di reazioni cutanee avverse. All of the precautions are taken in consideration in order to avoid excessive skin reactions Nel caso si verificassero reazioni inaspettate/avverse lo sperimentatore medico ne giudicherà la gravità (riportandola in dettaglio nella scheda raccolta dati individuale del volontario) e di conseguenza intraprenderà appropriata cura. If any unexpected/adverse skin reaction occurs, medical investigating specialist evaluates the severity of the reaction (reporting it in the volunteer s data collecting sheet) and proceeds with appropriate therapy Soggetti partecipanti allo studio Test subjects Selezione dei soggetti Selection of the test subjects I soggetti partecipanti allo studio sono selezionati dal medico dermatologo da un panel di soggetti sani di sesso maschile e femminile (età compresa tra i 35 ed i 65 anni) applicando i criteri di inclusione e non inclusione di seguito riportati. The subjects participating in the study are selected by a dermatologist from a panel of healthy male and female subjects (age between 35 and 65 years old) in accordance with the following inclusion/non- inclusion criteria Criteri di inclusione Soggetti sani di sesso femminile (70%) e maschile (30%) Healthy female (70%) and male (30%) subjects Età: compresa tra i 35 ed i 65 anni (50% di soggetti da anni e 50% dei soggetti da 51 a 65 anni) Age: between 35 and 65 years (as follow: 50% in the range and 50% in the range 51-65). Razza: caucasica Race: Caucasian incarnato spento/opaco Dull complexion Pagina 5 di 42 Page 5 out of 42

6 BMI ottimale sia per i soggetti di sesso maschile che per quelli di sesso femminile (BMI compreso tra 20 e 25) BMI in the optimal range for both male and female subjects (BMI in the range 20-25) Discromie cutanee/macchie melaniche (in almeno il 60% dei soggetti partecipanti allo studio) Cutaneous Dyschromia / brown spot (presented in at least 60% of the participants in the study) Soggetti che non hanno partecipato in studi simili da almeno due mesi Subjects who have not participated in similar studies for at least the last two months Assenza di patologie cutanee Absence of skin diseases Impegno a non variare la normale routine quotidiana Promise not to change the normal daily routine Impegno a non utilizzare per tutto il periodo dello studio prodotti con attività sovrapponibile a quella del prodotto in esame Commitment not to use products with activity comparable to that of the product to be tested, throughout the study period Impegno a non utilizzare per tutto il periodo dello studio creme viso Commitment not to use face creams throughout the study period Impegno a non variare per tutto il periodo dello studio le abitudini alimentari Promise not to change alimentary habits throughout the study period Soggetti informati sulle procedure dello studio e che hanno firmato un consenso informato Subjects informed about the study procedures and who signed an informed consent form Criteri di non inclusione Non-inclusion criteria Soggetti che non soddisfano i criteri di inclusione Individuals who do not meet the inclusion criteria Donne incinte o in allattamento Pregnant or breast-feeding women Anamnesi positiva per atopia Past history of atopy Storia pregressa di allergia o sensibilità ai prodotti cosmetici, da toeletta, ai solari e/o a medicazioni topiche Past history of allergy or sensitivity to cosmetics, toiletries, solar and / or topical drugs. Soggetti con problemi dermatologici nell area del test Subjects with dermatological problems in the tested area Soggetti in terapia farmacologica sia locale che sistemica Subjects under pharmacological treatment (both locally or systemically) Bracci di trattamento Treatment arm Dopo l arruolamento i soggetti sono suddivisi in due gruppi di 25 soggetti. Sulla base del loro numero di ingresso nello studio i soggetti sono inseriti nel gruppo di trattamento attivo o placebo. I due bracci di trattamento attivo e placebo sono randomizzati secondo una appropriata procedura statistica dal direttore dello studio. After the enrolment subjects are divided in two groups of 25 subjects. Based on their number of entering the study, subjects are included in the active or placebo treatment group. Both active and placebo treatment are randomized according to an appropriate statistical procedure. Randomization is performed by the study director Lista di randomizzazione e cieco Randomization list and blinding Viene preparato uno schema di randomizzazione basato su appropriata procedura statistica (Efron s biased coin). Tale schema di randomizzazione è quindi conservato dal direttore dello studio. Tuttavia per garantire l accessibilità alle persone coinvolte nello studio e per mantenere la condizione di doppio cieco, nel caso si verificassero reazioni avverse, sono preparate 50 buste chiuse contenenti lo schema di randomizzazione per singolo soggetto. La custodia di tali buste è affidata al direttore dello studio. It is prepared a randomization scheme based on an appropriate statistical procedure (Efron's biased coin). The randomization scheme is then filed by the study director. However, to ensure accessibility to persons involved in the study and to maintain the double-blind condition, in case of adverse reactions, 50 sealed code envelopes containing the randomization scheme are prepared for each subject. The study director is entrusted to keep these envelopes Svolgimento dello studio Study development Lo studio prevede una fase iniziale di preselezione, in cui lo Sperimentatore o i suoi collaboratori individuano i soggetti potenzialmente eligibili a partecipare allo studio. A tali soggetti viene quindi proposto di partecipare allo studio Pagina 6 di 42 Page 6 out of 42

7 descrivendone le modalità sia verbalmente che per iscritto. Viene quindi fissata la data per il primo appuntamento in cui lo sperimentatore: a) acquisisce le misure basali, b) consegna il prodotto, c) invita il soggetto ad effettuare il prelievo presso il centro analisi La Minerva (27100 Pavia - 3, v. Cavallini), d) fissa gli appuntamenti a distanza di 1 mese e due mesi di utilizzo del prodotto. The study foresee for an initial pre-selection phase, in which the investigator or its staff identify those potentially eligible to participate in the study. Potential eligible subjects are proposed to participate in the study, describing its modality both verbally and in writing. It is then make the date for the first visit during which the investigator: a) take the baseline measures, b) delivery the product to the subject, c) invite the subject to take the sample at the analysis center "La Minerva" (27100 Pavia - 3, Cavallini v.), d) makes the dates for the visits after 1 month and two months of product use MATERIALI E METODI MATERIALS AND METHODS Di seguito sono descritti i materiali e metodi impiegati nel corso dello studio. Here below are described the materials and methods employed in the study Condizioni Ambientali Ambient conditions Le valutazioni strumentali e cliniche sono acquisite in condizioni di temperatura (22±2 C) ed umidità controllate (50±10%). Prima di procedere con le valutazioni, il soggetto si acclimata alle condizioni ambientali per almeno 15 minuti. The clinical and instrumental evaluations are taken under controlled temperature (22±2 C) and humidity (50±10%) conditions. Before measurements, the subject acclimate to environmental conditions for at least 15 minutes Sede delle misurazioni Measurement sites Idratazione cutanea: guancia destra in 5 punti Skin moisturization: right cheek in 5 points Elasticità cutanea: guancia destra Skin elasticity: right cheek Profilometria cutanea: area perioculare destra Skin profilometry: right periocular area Intensità delle macchie melaniche: all interno della macchia melanica (e macchie) Brown spot intensity: inside the brown spot Rugosità cutanea: viso intero Skin wrinkledness: full face Luminosità dell incarnato: viso intero Skin brightness: full face Stripping cutanei: perioculare sinistra Skin stripping: left periocular area d-roms test e Oxy-Adsorbent test: prelievo ematico (plasma) d-roms test and Oxy-Adsorbent test: blood collection (serum) Espressione di SIRT-1: prelievo ematico (linfociti) SIRT-1 expression: blood collection (lymphocytes) Valutazioni degli effetti cutanei Evaluation of the cutaneous effects Valutazione dell idratazione cutanea Evaluation of the skin moisturization La misurazione dell idratazione cutanea è basata sul metodo CORNEOMETER (Courage+Khazaka, electronic GmbH) internazionalmente riconosciuto. La misurazione si basa sulla valutazione della costante dielettrica dell acqua. La sonda di misurazione mostra i cambiamenti del contenuto idrico del campione da misurare. Un campo elettrico diffuso, generato dalla testa della sonda, penetra i primi strati della pelle e determina la dielettricità. The measurement of the skin moisture is based on the internationally recognized CORNEOMETER method (Courage+Khazaka, electronic GmbH).This measurement is based on the dielectric constant of water. The probe shows changes of capacitance according to the moisture content of the measuring object. An electric scatter field penetrates the very first layer of the skin and determines the dielectricity Valutazione dell elasticità cutanea Evaluation of the skin elasticity La valutazione dell elasticità cutanea si basa sul metodo della suzione/elongazione e del successivo rilascio della pelle all interno della sonda dello strumento di misurazione. Durante la fase di suzione/elongazione lo strumento genera una pressione negativa costante (450 mbar) in grado di aspirare la pelle all interno della sonda. Alla fase di suzione segue la fase di rilascio, in cui la pressione all interno della sonda viene portata Pagina 7 di 42 Page 7 out of 42

8 a zero mbar permettendo così alla pelle di ritornare allo stato di riposo. Un sistema di rilevazione ottico, valuta quindi la profondità raggiunta dalla pelle all interno della sonda nelle due fasi di misurazione, i dati sono quindi rielaborati graficamente e numericamente allo scopo di calcolare le proprietà viscoelastiche della pelle. Lo strumento utilizzato è il CUTOMETER MPA 580 (Courage+Khazaka, electronic GmbH). Per maggiori informazioni sulla misurazione ed il calcolo dell elasticità cutanea vedere riquadro 1. Skin elasticity measurement is based on the suction/elongation method and the subsequent release of the skin inside the opening of the instrument device. During the suction/elongation phase the instrument generates, in fact, a constant negative pressure (450 mbar) able to aspirate the skin inside the measurement probe. The suction phase is followed by the release phase, in which the pressure inside the probe is switched to 0 mbar allowing the skin recovery after the elongation phase. An optical measurement system, evaluates the depth of the skin inside the probe in the two phases of the measurement, the obtained data are then elaborated and showed graphically and numerically in order to calculate the viscoelastic properties of the skin. The instrument used for measuring is the CUTOMETER MPA 580 (Courage+Khazaka, electronic GmbH). For further see box 1 on the next page. Riquadro 1 - Elasticità cutanea Box 1 - Skin elasticity La misurazione dell elasticità cutanea si basa sul principio della suzione/elongazione della pelle in seguito ad uno stimolo pressorio negativo e costante e quindi sul suo successivo rilascio quando l effetto dello stimolo viene annullato. La figura sottostante mostra graficamente il comportamento della pelle nella fase di suzione/elongazione (F0) e quindi nella fase di rilascio (F1). The measurement of the skin elasticity is based on skin suction/elongation principle after a negative and constant pressure stimulation and on its subsequent release when the stimulus finishes. The figure below shows graphically the behaviour of the skin in the suction/elongation phase (FO) and in the release phase (F1). Come è possibile notare dalla figura la pelle reagisce allo stimolo pressorio negativo con una risposta di tipo bifasico caratterizzata da una prima fase di rapida distensione (Ue) a cui segue una seconda fase in cui la pelle tende ad opporsi allo stimolo (Uv) raggiungendo il suo massimo grado di deformazione (Uf). In letteratura la prima parte della curva è nota come la componente elastica della pelle mentre la seconda parte ne caratterizza la componente viscoelastica, rappresentata per la maggior parte dalla componente plastica. Analogo è il comportamento della pelle al termine dello stimolo pressorio negativo nella fase di rilascio. Infatti, se in una prima fase (Ur) la pelle tende a ritornare al suo stato originario di riposo - date le sue qualità elastiche - in una seconda fase la componente plastica supera quella elastica rallentando la velocità di rideformazione della pelle (Ua-Ur) sino a mantenere la pelle in uno stato deformato (Uf-Ua); tale fenomeno è noto come isteresi. Nel presente studio l elasticità viene calcolata dal rapporto tra la deformazione residua e l estensione massima della pelle ovvero Ua/Uf. Tale rapporto noto in letteratura come parametro R2 indica la capacità della pelle di ritornare al suo stato originale di riposo in seguito ad un evento stressante. Più il valore tende a 1 maggiormente elastica sarà la pelle. As it is possible to notice in the figure the skin reacts to the negative pressure stimulation in a biphasic manner characterized by a first rapid elongation phase (Ue) followed by a second phase in which the skin tends to oppose to the stimulation (Uv) reaching it s maximum deformation state. In bibliography the first phase of the curve is known as the elastic component of the skin while the second part characterize the viscoelastic component of the skin, mainly the plastic component. Similar is the behaviour of the skin at the end of the negative pressure stimulation during the release phase. In fact, if in phase (Ur) the skin tends to return to its basal state - due to its elastic qualities - in a second phase the plastic component exceeds the elastic component decreasing so the velocity of redeformation of the skin (Ua-Ur) to maintain the skin in a deformed state (Uf-Ua); this phenomenon is known as hysteresis. In this study the skin elasticity was calculated as the ratio between the residual deformation and the maximum elongation of the skin or Ua/Uf. This ration is known in literature as R2 and indicates the ability of the skin to return to its original state of recovery after a stressing event. Closer the value is to 1 more elastic the skin is. Pagina 8 di 42 Page 8 out of 42

9 Valutazione del rilievo cutaneo (Profilometria cutanea) Evaluation of skin surface properties (skin profilometry) Il rilievo cutaneo è valutato mediante Primos 3D (GFMesstechnik GmbH). Primos 3D è uno strumento non a contato per la valutazione della cute in vivo il cui principio di funzionamento si basa sulla proiezione di luce strutturata. In combinazione con un software di valutazione 3D, il sensore dello strumento consente di valutare le proprietà profilometriche del rilievo cutaneo (es. la profondità ed il volume della ruga, la rugosità, ecc.). In questo studio sono calcolati i parametri profilometrici Ra (ISO 4287, DIN 4768), Rz (ISO 4287, DIN 4768) e la profondità della ruga. Per maggiori informazioni vedere il riquadro 2. Skin surface is quantitatively assessed by Primos 3D (GFMesstechnik GmbH). Primos 3D is a non-contact in vivo skin measurement device based on structured light projection. In conjunction with a comprehensive 3-D measurement and evaluation software, the sensor allows to evaluate skin surface properties (i.e. winkle depth, volume, roughness etc.). In this study it is calculated the Ra parameter (ISO 4287, DIN 4768), Rz (ISO 4287, DIN 4768) and wrinkle depth. For further information see box 2. Riquadro 2 - Profilometrica cutanea mediante Primos 3D Box 2 - Skin profilometry by means of Primos 3D analysis La tecnica. Primos 3D è uno scanner 3D che acquisisce una nuvola di punti (in un sistema di coordinate tridimensionale) della superficie dell oggetto da misurare. Questi punti sono utilizzati per estrapolare la forma dell oggetto (un processo chiamato ricostruzione). Come le camere, uno scanner 3D ha un campo visivo simile ad un cono, e come le camere può raccogliere informazioni solo di oggetti illuminati. Al contrario delle camere, che raccolgono le informazioni sul colore, gli scanner 3D raccolgono informazioni sulle distanze dell oggetto all interno del loro campo visivo. Le immagini prodotte da uno scanner 3D descrivono quindi la distanza dell oggetto per ogni punto all interno dell immagine (vedere l immagine nell inserto). The technique. Primos 3D is a 3D scanner that create a point cloud (set of vertices in a three-dimensional coordinate system) of geometric samples on the surface of the subject. These points are then used to extrapolate the shape of the subject (a process called reconstruction). Like cameras, 3D-scanner have a cone-like field of view, and like cameras, they can only collect information about surfaces that are not obscured. While a camera collects color information about surfaces within its field of view, 3D scanners collect distance information about surfaces within its field of view. The picture produced by a 3D scanner describes the distance to a surface at each point in the picture (see the image in the insert). Calcolo della rugosità. Per il calcolo della rugosità il software definisce un campo di misura a forma di stella. Il calcolo del parametro avviene per ciascuna linea di intersezione disegnate dal programma. In questo studio la rugosità è valutata mediante i parametri Ra e Rz. Il parametro Ra è la media aritmetica dei valori assoluti delle ordinate del profilo di rugosità (vedere a figura sottostante). Il parametro Rz è la media aritmetica dei singoli 5 valori di Rzi (solchi più profondi) all interno della linea di misura. Calculation of roughness. For the calculation of a star roughness, intersections are arranged in a star shape by the program. The calculation of the parameter occurs accordingly to the determination of the line roughness (separate for every star shape arranged intersection). In this study roughness is calculated the Ra and Rz parameter. Ra parameter is the arithmetic average of the absolute values of the roughness profile ordinates (see the picture here below). Rz is the arithmetic mean value of the single roughness depths Rzi of 5 consecutive sampling lengths: Matemaricamente Ra è calcolato come: Mathematically Ra is calculated as: Matemaricamente Ra è calcolato come: Mathematically Rz is calculated as: Calcolo della profondità della ruga. Viene calcolata la profondità delle rughe all interno della linea di misura. Questo calcolo è fatto sull immagine di sezione trasversa (profondità vs. sezione). Calculation of wrinkle depth. It is calculated the height of wrinkles in the sampling lengths:. This calculation is done on the sectional picture (wrinkle depth vs. section). Pagina 9 di 42 Page 9 out of 42

10 Valutazione dell intensità delle macchie melaniche, calcolo dell ITA (individual typology angle) Evaluation of the brown spot intensity, calculation of ITA (individual typology angle) L intensità della macchia melanica è valutata mediante uno spettrofotometro/colorimetro CM-700D. Sono acquisiti i valori di L* e b* che caratterizzano la macchia melanica, successivamente questi dati sono interpolati mediante una formula matematica che consente di caratterizzare l ITA. Tale parametro consente di valutare l intensità del colore della macchia. Per maggiori informazioni vedere il riquadro 3. The intensity of melanic spot is evaluated by using a spectrophotometer / colorimeter CM-700D. Are taken the values of L* and b* which characterize the melanic spot, these data are then interpolated using a mathematical formula that allows to calculate the ITA. This parameter is used to evaluate the intensity of the color of the stain inside the brown spot. For further information see box 3. Riquadro 3 - Valutazione dell intensità delle macchie melaniche, calcolo dell ITA (individual typology angle) Box 3 - Evaluation of the brown spot intensity, calculation of ITA (individual typology angle) a) b) Guideline for the colorimetric determination of skin colour typing and prediction of the minimal erythemal dose (MED) without UV exposure. La tecnica. Lo spettrofotometro CM-700d misura il colore cutaneo nello spazio cromatico CIELab (a). CIELab è uno spazio colore standardizzato in cui il colore è definito - in condizioni di illuminazione e angolo dell osservatore standard - dai valori di a* e b* che ne definiscono la tinta e la saturazione e dal valore di L* che ne definisce la luminosità. Lo strumento, che si basa sulla spettrofotometria di riflettanza, emette una luce intensa bianca che riemessa dall oggetto (ad un angolo di 10 ) viene raccolta da 36 fotodiodi ciascuno con sensibilità spettrale differente (da 400 nm a 700 nm). La sensibilità dei fotodiodi è regolata secondo un osservatore standard simulando cosi la sensibilità dell occhio umano. Queste informazioni sono quindi rielaborate da un microprocessore è visualizzate graficamente come mostrato nella figura b). The technique. The spectrophotometer CM-700d measure the skin color in the CIELab chromatic space (a). CIELab is a standardized color space in which the color is defined - under standard illumination conditions (illuminant) and observer angle - by the values called a* and b* that defines hue and color saturation and by the value called L* that defines the color brightness. The instrument, which principle of function is the reflectance spectrophotometry, emits an intense white light that re-emitted from the object (at an angle of 10 ) is collected by 36 photodiodes each with different spectral sensitivity (from 400 nm to 700 nm). The sensitivity of the photodiodes is regulated according to a "standard observer" simulating the sensitivity of the human eye. This information is then elaborated by a microprocessor is displayed graphically as shown in Figure b). Calcolo dell ITA. L ITA è calcolato come segue: ITA =ArcTan (L*-50) x b* Sulla base dell ITA è possibile definire le seguenti categorie: ITA >55 Molto chiaro 55 >ITA >41 Chiaro 41 >ITA >28 Intermedio 28 >ITA >10 Abbronzato ITA <10 Scuro ITA calculation. ITA is calculated as follows: ITA =ArcTan (L*-50) x b* Based on ITA it is possible to define the following categories: ITA >55 Very light 55 >ITA >41 Light 41 >ITA >28 Intermediate 28 >ITA >10 Tan ITA <10 Brown Analisi clinica Clinical analysis Mediante scala clinica a punteggio il dermatologo valuta gli effetti del prodotto sulla rugosità cutanea e la luminosità dell incarnato. Nel riquadro 4 a pagina seguente sono riportate la scale utilizzate. Using a clinical score the dermatologist evaluate the effects of the product on skin wrinkledness and on complexion. In the box 4 (on the next page) are reported the used scales. Pagina 10 di 42 Page 10 out of 42

11 Riquadro 4 - Scale cliniche di valutazione effetti cutanei Box 4 - Clinical scales for the evaluation of the skin effects Rugosità cutanea a T0 T0 classification of wrinkledness Nessuna rugosità. Rughe non visibili; tramatura cutanea regolare No wrinkle. No visible wrinkle; continuous skin line Rughe molto superficiali ma visibili Very shallow yet visible wrinkle Rughe sottili. Rughe visibili e leggera indentazione Fine wrinkle. Visible winkle and slight indentation Rughe visibili e chiara indentazione Visible wrinkle and clear indentation Rughe moderate. Rughe chiaramente visibili Moderate wrinkle. Clearly visible wrinkle Rughe prominenti e visibili Prominent and visible wrinkle Rughe profonde. Rughe e solchi profondi Deep wrinkle. Deep and furrow winkle Score Rugosità cutanea a T60 T60 classification of wrinkledness Score 0 Nessuna variazione No variation Lieve miglioramento Slight improvement Moderato miglioramento Moderate improvement Notevole miglioramento Remarkable improvement Luminosità dell incarnato a T0 T0 classification of Luminosità dell incarnato a T60 T60 complexion Score classification of complexion Score Colorito molto spento Very out complexion 1 Nessuna variazione No variation 1 Colorito spento Out complexion Lieve miglioramento Slight 2 2 improvement Cute leggermente asfittica (poco perfusa) Light Moderato miglioramento Moderate 3 3 asphyctic skin (little perfused) improvement Cute luminosa (ben ossigenata e ben perfusa) Bright Notevole miglioramento Remarkable 4 4 skin (well oxygenated and well perfused) improvement Valutazione della capacità antiossidante cutanea Evaluation of the skin antioxidant capacity La capacità antiossidante cutanea viene determinata su prelievi seriali dello strato corneo, ottenuti utilizzando il cerotto Corneofix. Mediante metodo biochimico (FRAP, Ferric Reducing Antioxidant Power) viene determinata la capacità della pelle di opporsi ai danni indotti dai radicali liberi. La valutazione della capacità antiossidante totale è espressione della somma e della sinergia dei sistemi antiossidanti non enzimatici. Il Ferric Reducing Antioxidant Parameter (FRAP) rappresenta una misura diretta del potere riducente totale di una matrice biologica, indice indiretto della capacità del sistema di resistere al danno ossidativo. Il FRAP utilizza gli antiossidanti come agenti riducenti in un metodo colorimetrico basato su reazioni redox (Benzie IFF, Strani JJ, Anal Biochem 1996, 239: 70-76). La reazione che viene monitorata è la seguente: Antiossidanti TPTZ-Fe(III) TPTZ-Fe(II) ph = 3.6 T= 37 C La riduzione a ph acido del complesso TPTZ-Fe(III) nella forma ferrosa è caratterizzata da un intenso colore blu. La reazione viene monitorata misurando il cambiamento di assorbanza della soluzione a λ = 595 nm. La lettura effettuata viene confrontata con una curva di calibrazione Fe(II) di valore noto. Il risultato è direttamente proporzionale al potere riducente totale degli antiossidanti presenti nella miscela di reazione. Skin antioxidant capacity is determined on serial samples of the stratum corneum, obtained using the Corneofix foil. The skin ability to resist the damage caused by free radicals is determined by means of biochemical methods (FRAP, Ferric Reducing Antioxidant Power). The assessment of the total antioxidant capacity is an expression of the sum and synergy of the non-enzymatic antioxidant systems. Pagina 11 di 42 Page 11 out of 42

12 The Ferric Reducing Antioxidant Parameter (FRAP) is then a direct measure of the total reductive power of a biological matrix and an indirect index of the capability of the considered system to resist to the oxidative damage. FRAP uses the antioxidants in the biological system as reductive agent in a colorimetric method based on redox reactions (Benzie IFF, Strani JJ, Anal Biochem 1996, 239: 70-76). Monitored reactions is: Antioxidants TPTZ-Fe(III) TPTZ-Fe(II) ph = 3.6 T= 37 C The reduction at acid ph of the complex TPTZ-Fe(III) in the ferrous form (Fe(II)) is characterised by an intense blue colour. The reaction is monitored by measuring the solution absorbance at 595 nm. The recorded absorbances are compared to a Fe(II) standard curve of known values. The results is direcly proportional to the total reductive power of the antioxidant in the reaction mix Valutazioni degli effetti sistemici Evaluation of the sistemyc effects Gli effetti sistemici del prodotto sono valutati sulla frazione plasmatica o linfocitaria del sangue. Queste sono ottenute come segue: 1. il prelievo di sangue intero viene frazionato mediante centrifugazione differenziale, ottenuta la frazione plasmatica ne viene conservata una aliquota, una seconda aliquota viene centrifugata su gradiente di Ficoll per isolare i linfociti; 2. le aliquote plasmatica e linfocitaria (preservata in DMSO) sono conservate a -80 C fino alle successive analisi. The systemic effects are evaluated on the serum or lymphocyte fraction of the blood. These are obtained as follows: 1. the whole blood is fractionated by differential centrifugation, an aliquot of the obtained serum fraction is stored and a second aliquot is centrifuged on Ficoll gradient to isolate lymphocytes; 2. plasma and lymphocyte (preserved in DMSO) aliquots are stored at -80 C until further analysis D-ROMs test Il test d-roms è un test spettrofotometrico che consente di valutare in un campione biologico la concentrazioni di idroperossidi (ROOH). Questi composti sono generati nelle cellule in seguito all attacco ossidativo dei ROS di vari substrati organici (ad esempio, i carboidrati, i lipidi, gli aminoacidi, le proteine, i nucleotidi, ecc.). Le iniziali del test ROMs indica che gli analiti misurati da questo test, ad esempio gli idroperossidi, appartengono ai metaboliti reativi dell ossigeno (ROMS). Mediante il test d-roms gli idroperossidi in un campione biologico, ad esempio il plasma, dopo aver reagito con un substrato cromogeno sviluppano un derivato colorato (da rosa a rosso). Tale complesso colorato è rilevabile e quindi quantificabile mediante spettrofotometria. La concentrazione degli idroperossidi, che correla direttamente con l intensità del colore, è espressa in unità arbitrarie di facile comprensione nella pratica clinica. Tali unità sono indicate dalle iniziali U CARR, ovvero unità Carratelli, dal nome del ricercatore italiano Mauro Carratelli (Pienza, Italia), l inventore del test d-roms. Nel test d-roms, quindi, gli idroperossidi di un campione biologico, ad esempio il plasma, sono posti nella stessa condizione della reazione di Fenton s per generare in vitro radicali alchil e perossil. Praticamente una piccola quantità di plasma è diluita in una soluzione acidica (ph 4.8). In queste condizioni gli ioni ferro legati alle proteine plasmatiche diventa disponibile per catalizzare in vitro la conversione degli idroperossidi in radicali alchil e perossil (figura 1). Un composto (cromogeno) che ha la capacità di cambiare il proprio colore quando ossidato dai radicali idroperossili e alchili è quindi aggiunto a questa soluzione. Il substrato cromogenico utilizzato nel test è la N,N,-diethylparaphenylen-diamine, che possiede la caratteristica di essere ossidata dai radicali idroperossili e alchili, cambiando cosi il proprio colore in un catione colorato da rosa a rosso. Questo catione è un radicale sufficientemente stabile che è possibile quantificare mediante uno spettrofotometro (lunghezza d onda 505 o 546 nm, camino ottico 1 cm, temperatura 37 C, modalità cinetica o fissa). La concentrazione del complesso colorato è direttamente correlata ai livelli di idroperossidi presenti nel campione biologico testato. Pagina 12 di 42 Page 12 out of 42

13 Poiché i radicali alchilici e perossilici generati dalla conversione degli idroperossidi sono chimicamente eterogenei, i risultati del test d-roms sono espressi in unità arbitrarie, ovvero le Unità Carratelli (U CARR), dove una 1 U CARR corrisponde a 0.08 mg/100 ml H 2 O 2. The d-roms test is a spectrophotometric test that allows assessing, in a biological sample, the concentration of hydroperoxides (ROOH). Such compounds are generated into the cells by the oxidative attack of ROS on a number of organic substrates (e. g. carbohydrates, lipids, amino acids, proteins, nucleotides etc.). The initials ROMs underlines that the analites measured by this test, i. e. hydroperoxides, belong to the reactive oxygen metabolites (ROMs). By means of d-roms test the hydroperoxides of a biological sample, e. g. the blood serum, after reacted with a chromogenic substrate develop a colored derivative (pink to red). Such colored complex is detectable and then quantifiable by a spectrophotometric method. Hydroperoxides concentration, which directly correlates with detected color intensity, is expressed as arbitrary units which are of easy use in clinical practice. Such unities are indicated with the initials CARR U, i. e. Carratelli Units, by the name of the Italian research chemist Mauro Carratelli (Pienza, Italy), the inventor of the d-roms test. In the d-roms test, therefore, hydroperoxides of a biological sample, e. g. blood serum, are posed in the same conditions of the Fenton s reaction to generate in vitro alkoxyl and peroxyl radicals. Practically, a small amount of serum is diluted in a acidic buffered solution (ph 4.8). In these conditions, iron ions before bonded to the serum proteins become available to catalyze in vitro the breakdown of blood hydroperoxides to alkoxyl and peroxyl radicals (figure 1). A compound (chromogen) that has the ability to change its color when is oxidized by hydroperoxyl and alkoxyl radicals is then added to this solution. The chromogenic substrate used in the d-roms test is N,N,- diethylparaphenylen-diamine, that possess the feature of being oxidized by hydroperoxyl and alkoxyl radicals, thus transforming itself in a pink to red colored cation. Such cation is a radical but it is sufficiently stable so that it is possible to assess its quantity by means of a photometer (work conditions: wavelength 505 or 546 nm, optical path 1 cm, temperature 37 C, kinetic or endpoint mode). The concentration of colored complex will be directly related to the hydroperoxides levels of the tested biological sample. Because the chemical heterogeneity of alkoxyl and peroxyl radicals generated by hydroperoxide breakdown, the results of d-roms test are expressed as arbitrary units, the CARRATELLI UNITS (CARR U), where 1 CARR U correspond to 0.08 mg/100 ml H 2 O 2. Figura 1 - Le reazioni del test d-roms Figure 1 - The reactions of d-roms test. 1A) R-OOH + Fe 2+ > R-O * + Fe 3+ + OH - 1B) R-O * + A-NH 2 > R-O - + [A-NH 2 * ] + 2A) R-OOH + Fe 3+ > R-OO * + Fe 2+ + H + 2B) R-OO * + A-NH 2 > R-OO - + [A-NH 2 * ] + dove: where: R-OOH è un generico idroperossido is a generic hydroperoxides R-O * è un radicale alchil di un idroperossido generico is the alkoxyl radical of a generic hydroperoxides R-OO * è un radicale idroperossile di un generico idroperossido is the hydroperoxyl radical of a generic hydroperoxides A-NH 2 è la is N, N-diethyl-paraphenylendiamine, il substrato cromogeno del test d-roms is N, N-diethylparaphenylendiamine, i. e. the chromogenic substrate of d-roms test [A-NH 2 * ]+ è il radicale cationico colorato del substrato cromogenico is the coloured radical cation of the chromogenic substrate Oxy-Adsorbent test Parecchi composti plasmatici sono capaci di tamponare il potenziale ossidante di specie reattive dell ossigeno. Virtualmente qualsiasi composto in grado di cedere elettroni è in grado di bloccare il potenziale lesivo dei radicali liberi dal momento che la reattività di un radicale libero è dovuta alla perdita di elettroni. Ovviamente, qualsiasi danno a tale barriera plasmatica/sierica alla ossidazione può risultare in un danno ossidativo ai tessuti. Il test OXY-Adsorbent valuta la capacità del plasma/siero di opporsi alla azione ossidativa Pagina 13 di 42 Page 13 out of 42

14 massiva di una soluzione di acido ipocloroso (HClO). Tale ossidante è stato selezionato, tra altri agenti ossidanti, poiché non solo è una potente ossidante ma anche un ossidante fisiologico capace di riprodurre in vitro alcune reazioni che possono verificarsi in vivo. Brevemente, nel test OXY-Adsorbent l efficacia del sistema antiossidante ematico è monitorato indirettamente misurando l eccesso di HClO (rilasciato come radicale) nel siero. I radicali di HClO che non hanno reagito reagiscono con un substrato cromogenico (N,N-diethylparaphenylendiamine) correttamente tamponato, a dare un complesso colorato che può essere misurato spettrofotometricamente, con un picco massimo di assorbanza a 505 o 546 nm. La concetrazione del complesso colorato è direttamente proporzionale alla concentrazione di HClO e indirettamente alla capacità antiossidante. Several compound are able in the plasma to buffer the oxidant potential of oxygen reactive species. Virtually, any compounds able to give electrons is able also to block the potential damage of a free radical, because the reactivity of a free radical is just due to the lack of electrons. Obviously, any injury to such plasma/serum barrier to oxidation can result in oxidative tissue damage. The OXY Adsorbent test evaluates the plasma/serum ability to oppose the massive oxidative action of a hypochlorous acid (HClO) solution. In the OXY-Adsorbent test HClO was selected among other oxidant agents because it is not only a powerful but also a physiological oxidant. Therefore it is able to reproduce in vitro some situations which occur in vivo. Briefly, in the OXY-Adsorbent test the efficacy of the blood antioxidant system is monitored indirectly by measuring the excess of HClO in serum (released as radical). As unreacted radicals of HClO react with a correctly buffered chromogenic substrate (N,N-diethylparaphenylendiamine), a colored complex develops that can be measured photometrically, presenting a maximum peak of absorbance at 505 or 546 nm. The concentration of the colored complex is directly proportional to the concentration of HClO and indirectly related to the antioxidant capacity Valutazione dell espressione di SIRT-1 Evaluation of the SIRT-1 expression L espressione di SIRT-1 è valutata mediante la tecnica del Western Blot. La tecnica prevede: preparazione del tessuto, le celle sono lisate allo scopo di ottenere le proteine; elettroforesi su gel, le proteine del campione sono separate utilizzando la elettroforesi; trasferimento, le proteine sono trasferite dal gel alla membrana (blotting); blocking, allo scopo di prevenire i legami aspecifici la membrana è posta in una soluzione di proteine sciolte in un tampone salino tamponato (TBS) contenente un detergente; rilevazione; la membrana è quindi legata ad un anticorpo (legato ad un enzima reporter) specifico per la proteina di interesse; le bande ottenute sono analizzate e quantificate. Allo scopo di controllare il corretto carico del gel e in caso di errori o di incompleto trasferimento, è utilizzato come controllo positivo la proteina actina. The SIRT-1 expression is evaluated by means of Western Blot technique. This technique foresee for: tissue preparation, cells are lysed in order to obtain proteins; gel electrophoresis, the proteins of the sample are separated using electrophoresis; transfer, proteins are moved from within the gel onto a membrane (blotting process); blocking, in order to prevent aspecific binding membrane is placed in a dilute solution of protein in Tris- Buffered Saline (TBS) and a detergent; detection; membrane is probed for the protein of interest with a modified antibody linked to a reporter enzyme; analysis, bands are analysed and quantified. In order to control gel loading and in case of errors or incomplete transfers, actin is used as positive control Autovalutazione Self assessment Dopo 60 giorni di utilizzo del prodotto ai soggetti viene chiesto di esprimere il loro personale giudizio rispondendo alle domande di un questionario. Pagina 14 di 42 Page 14 out of 42

15 After 60 days of product use the subjects were asked to express their personal opinion by means of a questionnaire Risultati e statistica Results and statistics Risultati Results I risultati sono riportati nelle rispettive unità di misura in tabelle. The results are reported in their respective units in tables. 1) I valori medi sono stati calcolati come: The mean values were calculated as: m = p [1] dove: where: p è il valore del parametro in analisi. p is the value of the parameter to be analyzed. 2) L errore standard (SEM) dei dati è calcolato come: The standard error of the mean was calculated as: n 2 p n i 2 1 (pi) 1 n SEM = (n 1) n [2] 3) Le variazioni percentuali medie sono state calcolate come: The mean percentage variations were calculated as: 20 X = T X0 Var(%) X [3] 1 0 dove: where X o è il valore del parametro in analisi al tempo 0 X o is the value of the parameter to be analyzed at T0 X t è il valore del parametro in analisi dopo 15 o 30 giorni di trattamento X t is the value of the parameter to be analyzed after 15 or 30 days of treatment. Tutti i calcoli sono stati fatti utilizzando un foglio di calcolo di Microsoft Excel. All the calculations were done using a Microsoft Excel worksheet Analisi statistica Statistical analysis I dati sono stati sottoposti a test t di Student bilaterale per dati appaiati. Data were submitted to two-way paired Student s t-test. I risultati dello studio citato nel presente rapporto si riferiscono esclusivamente ai prodotti testati ed alle particolari condizioni sperimentali impiegate nello studio. The results of the study reported in this document only refer to the tested sample and the specific experimental conditions. Il presente rapporto o parti di esso possono essere riprodotti solo con il consenso della società Farcoderm s.r.l. Any part of this report can only be reproduced with the consent of Farcoderm s.r.l. Copia informatica della presente relazione finale è conservata presso Farcoderm s.r.l. A copy of this report is kept on file at Farcoderm s.r.l. Il consenso informato e la scheda informativa sono archiviate presso Farcoderm s.r.l. per un periodo di 5 anni dall emissione del rapporto di prova. Both the informed consent and the information forms are kept on file at Farcoderm s.r.l. for 5 years after the date of issue of the report. Pagina 15 di 42 Page 15 out of 42

16 RISULTATI E GRAFICI: IDRATAZIONE CUTANEA RESULTS AND GRAPHS: SKIN MOISTURIZATION TABELLA 1 - Nella tabella sottostante sono riportati i dati strumentali ottenuti per il parametro sopra riportato. I dati sono espressi in unità corneometriche. TABLE 1 - The table below shows data obtained for each subject in terms of the monitored parameter. Data are expressed in corneometric units. ATTIVO ACTIVE PLACEBO n Vo l ID T 0 T 60 T R 047H 45,5 47,6 4,6% 02 C 076C 33,8 43,3 28,1% 03 L039B 40,6 47,1 16,0% 04 S093S 43,9 59,6 35,8% 05 L004M 53,8 64,9 20,6% 06 P 046G 40,9 51,3 25,4% 07 P 039N 43,2 56,1 29,9% 08 S068L 49,2 51,4 4,5% 09 C 063M 45,6 47,9 5,0% 10 B 168L 52,3 75,7 44,7% 11 C 092S 41,9 55,2 31,7% 12 B 012G 27,7 49,5 78,7% 13 A 086R 30,2 42,5 40,7% 14 S135S 20,9 29,2 39,7% 15 M 019F 35,0 44,6 27,4% 16 G156F 53,8 57,4 6,7% 17 M 064G 49,4 66,2 34,0% 18 B 084B 23,9 42,9 79,5% 19 P 135F 24,9 40,6 63,1% 20 T 023T 30,5 35,9 17,7% 21 L025G 43,4 55,3 27,4% 22 B 078M 27,1 38,9 43,5% 23 R 067L 39,0 46,3 18,7% 24 N 054R 35,5 62,1 74,9% 25 N 047M 36,2 40,2 11,0% M edia / M ean 38,7 50,1 32,4% SEM * 1,92 2,12 n Vo l ID T 0 T 60 T B 170C 44,2 45,2 2,3% 02 T 067F 47,0 34,9-25,7% 03 S162C 36,1 36,3 0,6% 04 B 152D 36,8 35,2-4,3% 05 M 170M 52,8 53,3 0,9% 06 S110E 33,9 38,2 12,7% 07 F 041M 39,7 38,3-3,5% 08 D 004G 46,0 40,4-12,2% 09 I002S 42,4 44,6 5,2% 10 B 130G 42,9 43,0 0,2% 11 D 010P 24,9 32,2 29,3% 12 C 144A 43,8 51,4 17,4% 13 M 144G 43,5 49,6 14,0% 14 B 120M 35,5 35,2-0,8% 15 G005G 31,6 35,1 11,1% 16 D 046G 35,6 40,8 14,6% 17 B 167A 52,2 56,2 7,7% 18 F 070M 44,4 40,2-9,5% 19 I015A 42,0 55,2 31,4% 20 S155A 35,2 38,1 8,2% 21 C 135M 32,9 38,6 17,3% 22 E005L 32,1 36,1 12,5% 23 P 006D 35,1 40,5 15,4% 24 T 074G 30,2 34,1 12,9% 25 P 170G 46,3 44,3-4,3% M edia / M ean 39,5 41,5 6,1% SEM * 1,40 1,38 * SEM, errore standard della media * SEM, standard error of the mean Pagina 16 di 42 Page 16 out of 42

17 GRAFICO 1 - Il grafico riporta i dati medi ottenuti a ciascun tempo sperimentale per il parametro in oggetto. I dati sono espressi come media ± SEM. GRAPH 1 - The graph shows the mean data obtained for the reported parameter. Data are reported as mean ± SEM. 55 ***, p= Pelle idratata Moisturized skin indice di idratazione (u.c.) Moisturization index (c.u.) Pelle secca Dry skin Active Placebo 30 *** T0 T60 Tempo (gg) Time (dd) All interno delle barre dell istogramma è riportata l analisi statistica intergruppo (attivo vs. placebo). Le linee riportano l analisi statistica intragruppo (T60 vs. T0). Inside the bars of the histogram is reported the intergroup statistical analysis (active vs. placebo). The lines report the intragroup statistical analysis (T60 vs. T0). Pagina 17 di 42 Page 17 out of 42

18 RISULTATI E GRAFICI: ELASTICITÀ CUTANEA (parametro R2) RESULTS AND GRAPHS: SKIN ELASTICITY (R2 parameter) TABELLA 2 - Nella tabella sottostante sono riportati i dati strumentali ottenuti per il parametro sopra riportato. I dati sono espressi dal rapporto Ua/Uf. TABLE 2 - The table below shows data obtained for each subject in terms of the monitored parameter. Data are expressed as Ua/Uf ratio. ATTIVO ACTIVE PLACEBO n Vo l ID T 0 T 60 T R 047H 0,5758 0,6125 6,4% 02 C 076C 0,5718 0, ,5% 03 L039B 0,4348 0, ,1% 04 S093S 0,6140 0, ,7% 05 L004M 0,6102 0, ,6% 06 P 046G 0,7840 0,8394 7,1% 07 P 039N 0,7130 0, ,7% 08 S068L 0,7849 0,7984 1,7% 09 C 063M 0,6519 0,6529 0,2% 10 B 168L 0,5944 0, ,4% 11 C 092S 0,7793 0,7847 0,7% 12 B 012G 0,7411 0, ,5% 13 A 086R 0,7344 0,7815 6,4% 14 S135S 0,5519 0, ,8% 15 M 019F 0,7805 0,7916 1,4% 16 G156F 0,7966 0,8595 7,9% 17 M 064G 0,7635 0, ,7% 18 B 084B 0,7739 0,7842 1,3% 19 P 135F 0,6045 0, ,7% 20 T 023T 0,6087 0,6145 1,0% 21 L025G 0,5591 0, ,0% 22 B 078M 0,6975 0,7636 9,5% 23 R 067L 0,7616 0,8090 6,2% 24 N 054R 0,6525 0, ,0% 25 N 047M 0,6458 0, ,3% M edia / M ean 0,6714 0, ,3% SEM * 0,0195 0,0170 n Vo l ID T 0 T 60 T B 170C 0,5660 0,5227-7,7% 02 T 067F 0,4567 0,4307-5,7% 03 S162C 0,6042 0,6088 0,8% 04 B 152D 0,5614 0,6113 8,9% 05 M 170M 0,7345 0,6952-5,4% 06 S110E 0,6500 0, ,9% 07 F 041M 0,7787 0,7304-6,2% 08 D 004G 0,6875 0, ,8% 09 I002S 0,8854 0, ,9% 10 B 130G 0,7245 0,7148-1,3% 11 D 010P 0,6883 0,6423-6,7% 12 C 144A 0,7118 0,7560 6,2% 13 M 144G 0,8462 0,8030-5,1% 14 B 120M 0,7413 0,6953-6,2% 15 G005G 0,7629 0,7398-3,0% 16 D 046G 0,5778 0, ,7% 17 B 167A 0,7123 0,7109-0,2% 18 F 070M 0,6803 0, ,3% 19 I015A 0,7286 0,7425 1,9% 20 S155A 0,6500 0, ,7% 21 C 135M 0,5244 0, ,3% 22 E005L 0,6544 0,5912-9,7% 23 P 006D 0,5612 0,5411-3,6% 24 T 074G 0,7088 0,6544-7,7% 25 P 170G 0,5236 0, ,4% M edia / M ean 0,6688 0,6267-5,9% SEM * 0,0206 0,0201 * SEM, errore standard della media * SEM, standard error of the mean Parametro R2: rappresenta l elasticità complessiva, parametro correlato alla quantità e alla qualità delle fibre elastiche e che rappresenta la capacità e la rapidità della pelle di tornare alla sua originaria posizione, quella che aveva prima della suzione applicata dallo strumento (Cutometer MPA580). R2 Parameter: it represents the general elasticity that is correlated to the quantity and the quality of the elastic fibers.it represents the ability and the rapidity of the skin to return to its native position (before the suction applied by the measuring device (Cutometer MPA580) Pagina 18 di 42 Page 18 out of 42

19 GRAFICO 2 - Il grafico riporta i dati medi ottenuti a ciascun tempo sperimentale per il parametro in oggetto. I dati sono espressi come media ± SEM. GRAPH 2 - The graph shows the mean data obtained for the reported parameter. Data are reported as mean ± SEM. 0,80 ***, p= Elasticità cutanea (R2=Ua/Uf) Skin elasticity (R2=Ua/Uf) 0,75 0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 **, p= *** Active Placebo T0 T60 Tempo (gg) Time (dd) All interno delle barre dell istogramma è riportata l analisi statistica intergruppo (attivo vs. placebo). Le linee riportano l analisi statistica intragruppo (T60 vs. T0). Inside the bars of the histogram is reported the intergroup statistical analysis (active vs. placebo). The lines report the intragroup statistical analysis (T60 vs. T0). Pagina 19 di 42 Page 19 out of 42

20 RISULTATI E GRAFICI: Ra, LEVIGATEZZA CUTANEA RESULTS AND GRAPHS: Ra, SKIN SMOOTHNESS TABELLA 3 - Nella tabella sottostante sono riportati i dati strumentali ottenuti per il parametro sopra riportato. I dati sono espressi in µm. TABLE 3 - The table below shows data obtained for each subject in terms of the monitored parameter. Data are expressed in µm. ATTIVO ACTIVE PLACEBO n Vo l ID T 0 T 60 T R 047H ,4% 02 C 076C ,6% 03 L039B ,3% 04 S093S ,2% 05 L004M ,7% 06 P 046G ,1% 07 P 039N ,0% 08 S068L ,2% 09 C 063M ,0% 10 B 168L ,7% 11 C 092S ,9% 12 B 012G ,0% 13 A 086R ,9% 14 S135S ,1% 15 M 019F ,7% 16 G156F ,0% 17 M 064G ,8% 18 B 084B ,5% 19 P 135F ,3% 20 T 023T ,5% 21 L025G ,6% 22 B 078M ,4% 23 R 067L ,0% 24 N 054R ,8% 25 N 047M ,6% M edia / M ean 33,1 31,6-4,5% SEM * 1,55 1,55 n Vo l ID T 0 T 60 T B 170C ,9% 02 T 067F ,8% 03 S162C ,5% 04 B 152D ,7% 05 M 170M ,5% 06 S110E ,0% 07 F 041M ,0% 08 D 004G ,9% 09 I002S ,9% 10 B 130G ,0% 11 D 010P ,9% 12 C 144A ,7% 13 M 144G ,1% 14 B 120M ,5% 15 G005G ,8% 16 D 046G ,7% 17 B 167A ,0% 18 F 070M ,4% 19 I015A ,0% 20 S155A ,1% 21 C 135M ,0% 22 E005L ,1% 23 P 006D ,3% 24 T 074G ,4% 25 P 170G ,0% M edia / M ean 32,6 32,5 0,6% SEM * 1,62 1,71 * SEM, errore standard della media * SEM, standard error of the mean Pagina 20 di 42 Page 20 out of 42

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