Capitolo IV ProteoliSi durante la fermentazione di impasti acidi modello

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1 Capitolo IV Proteolisi durante la fermentazione di impasti acidi modello Impasti acidi modello ottenuti con farina di grano duro sono sati inoculati con sei diversi ceppi di batteri lattici, in associazione o meno con un lievito commerciale, per studiare la proteolisi durante la fermentazione. La conta cellulare, il ph e la concentrazione di aminoacidi liberi sono stati misurati a diversi tempi di incubazione ed un estrazione sequenziale è stata effettuata per separare le diverse frazioni proteiche. La frazione proteica (albumine e globuline) solubile in soluzione salina è stata analizzata mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (RP-HPLC) e SDS-PAGE, mentre le frazioni solubili in propanolo (gliadine) e insolubili (glutenine) sono state analizzate solamente con SDS-PAGE. Metodi statistici multivariati sono stati utilizzati per l analisi dei risultati. La presenza del lievito e dei batteri lattici ha influenzato in modo complesso i profili RP-HPLC e SDS-PAGE delle proteine solubili. Gli unici cambiamenti a carico delle proteine del glutine correlati alla presenza dei batteri lattici hanno riguardato la comparsa di nuovi frammenti proteici (20 e 27 kda) dalle gliadine e la degradazione delle subunità di glutenina ad alto peso molecolare Introduzione La fermentazione degli impasti acidi è un processo tradizionale utilizzato nell industria della panificazione per migliorare la qualità e il sapore dei prodotti da forno. L aggiunta degli impasti acidi durante la panificazione influenza in vari modi le proprietà del pane; durante questo processo, infatti, le attività metaboliche che si verificano sono responsabili dei cambiamenti della farina nonchè del profumo, del gusto, del valore nutrizionale e della conservazione del pane. I batteri lattici e i lieviti sono i microrganismi dominante negli impasti acidi (De Vuyst e Neysens, 2005) e, di conseguenza, le proprietà organolettiche e nutrizionali del pane dipendono da loro metabolismo e dalla loro attività di cooperazione. L acidificazione e i composti antimicrobici prodotti dalla microflora lattica contribuiscono alla stabilità dei prodotti e svolgono un 73

2 ruolo importante nella regolazione delle complesse interazioni che si verificano all interno della microflora starter e tra gli starter e la microflora contaminante (Messens et al., 2002). Gli esopolisaccaridi (EPS) possono sostituire gli idrocolloidi per migliorare la tessitura e le proprietà nutrizionali del pane (Thieking et al., 2003). La produzione di CO 2 da parte dei batteri lattici eterofermentanti e dei lieviti influisce sul processo di lievitazione dell impasto, migliorando la consistenza del pane. Inoltre, l interazione tra batteri lattici e lieviti può influenzare la sintesi di composti volatili che contribuiscono al sapore e al profumo dei prodotti da forno (De Vuyst e Neysens, 2005). L drolisi di agenti chelanti come l acido fitico, inoltre, può avere ripercussioni positive sulle implicazioni nutrizionali del pane aumentando la biodisponibilità di minerali (De Angelis et al., 2003). Le proprietà dell impasto e il valore nutrizionale del pane sono fortemente influenzati dal contenuto nonché dalla composizione delle proteine della farina. La degradazione delle proteine del glutine influenza la reologia degli impasti e, di conseguenza, la struttura del pane (Thiele et al., 2004); inoltre, l idrolisi della maglia glutinica migliora la lavorabilità dell impasto (Wehrle et al., 1999). Gli aminoacidi e i piccoli peptidi rilasciati durante la fermentazione sono importanti per la crescita microbica nonché per lo sviluppo dell aroma nei prodotti da forno. L attività proteolitica/ peptidolitica dei batteri lattici può contribuire all idrolisi dei peptidi amari e alla liberazione di peptidi bioattivi (Mugula et al., 2003). Alcune proteine della farina e i prodotti della loro idrolisi possono incidere sulla salute umana; in particolare, i peptidi generati dalla digestione delle prolamine del frumento danneggiano la mucosa intestinale umana in persone affette da morbo celiaco o da enteropatie causate dalla sensibilità al glutine (Di Cagno et al., 2002). In aggiunta, alcune sequenze di aminoacidi delle proteine del frumento sembrano essere correlate ad alcuni disturbi mentali, come la schizofrenia e l autismo (Pasini et al., 2001). In letteratura sono state proposte diverse teorie sul fatto che l attività proteolitica durante la fermentazione acida provenga dai batteri lattici e/o lieviti indigeni o dagli enzimi dei cereali (Loponen et al., 2004). La farina, i lieviti e i batteri lattici contengono proteasi e peptidasi che possono contribuire in modo diverso agli eventi proteolitici. Thiele et al. (2004) hanno dimostrato che la proteolisi durante la fermentazione degli impasti 74

3 acidi è legata principalmente all attivazione degli enzimi dei cereali in presenza di bassi valori di ph; le proteasi della farina, infatti, sono in grado di degradare le prolamine in condizioni di ph acido (Loponen et al., 2004). Al contrario, altri studi hanno dimostrato che i batteri lattici hanno un ruolo sostanziale nella proteolisi durante la fermentazione (Di Cagno et al., 2002; Wehrle et al., 1999). Lo scopo del presente lavoro è stato quello di indagare sui cambiamenti che si verificano a carico della frazione proteica durante fermentazione degli impasti acidi, nonché di individuare le fonti dell attività proteolitica e i fattori che possono essere responsabili di questi eventi, come l attività degli enzimi della farina, le condizioni di ph e il metabolismo microbico Materiali e metodi Ceppi e condizioni di coltura Due ceppi di Lactobacillus plantarum e un ceppo di Lb. pentosus, Lb. curvatus, Leuconostoc mesenteroides e Weissella cibaria sono stati utilizzati in questo studio. Tutti i ceppi sono stati isolati da impasti acidi per la produzione del pane Cornetto di Matera (Ricciardi et al., 2002) e sono stati mantenuti come coltura liofilizzata nella Collezione del Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali, Università della Basilicata, Potenza, Italia. Il lievito commerciale liofilizzato è stato ottenuto dalla Lesaffre Corporation (Nord America, Stati Uniti d America). I ceppi di batteri lattici sono stati propagati in MRS modificato (mmrs) contenente 10 g/l di maltosio e 5 g/l di glucosio e fruttosio (Thiele et al., 2004). Le cellule raccolte mediante centrifugazione (12000 x g, 10 min, 4 C), sono state lavate due volte e risosepse in NaCl 0,85% (w/v) per ottenere una concentrazione finale pari a 10 7 ufc/g di impasto. Il lievito è stato rivitalizzato con NaCl 0,85% (w/v) e aggiunto immediatamente alla impasto per ottenere una concentrazione finale di 10 6 ufc/g di impasto Fermentazione degli impasti acidi In tutte le prove è stata utilizzata una farina commerciale di grano tenero (Odlum gruppo, Dublino, Irlanda) contenente 12% di proteine (w/w sul peso secco), 0,5% di ceneri (w/w sul peso secco), 13% di umidità (w/w) e un valore di Hagberg pari a 250. La farina non è stata trattata o addizionata 75

4 con additivi. Gli impasti sono stati preparati come descritto in Tabella 1, miscelando acqua e farina con una spatola sterile per 3 minuti per ottenere un impasto con grado di idratazione (DY) pari a 200. Le fermentazioni sono state condotte per 24 ore a 30 C. Due fermentazioni, ottenuto aggiungendo antibiotici all impasto, sono state effettuate asetticamente a ph 6,0 e 3,5, rispettivamente. I campioni sono stati prelevati a 0, 6 e 24 ore per le successive analisi. Tabella 1. Formula per gli impasti acid modello Contollo neutro Controllo acido Lievito neutro Lievito acido Batteri lattici Batteri lattici, tampone Farina (g) Acqua (ml) NaCl (g) Soluzione acida b (µl) Penicillina G c (µl) Cicloesimmside c (µl) Cloramfenicolo c (μl) Batteri lattici a (ml) Lievito (ml) Tampone fosfato d (ml) Batteri lattici, lievito a Lb. plantarum DBPZ1015 o Lb. plantarum DBPZ1025, o Lb. pentosus DBPZ0984 o Lb. curvatus DBPZ1020 o W. cibaria DBPZ1006 o Leuc. mesenteroides DBPZ1005. b Miscela di 4 volumi of acido lattico (90%) and 1 volume di acido acetico (98%) c 1g/L cicloesimmside and cloramfenicolo; IU/mL Penicillina G d 1 mol/l tampone sodio fosfato a ph 6, Conta delle colonie e misura del ph I batteri lattici e i lieviti sono stati enumerati al termine della fermentazione su piastre di mmrs agar e YPD (estratto di lievito 10 g/l, Peptone 20 g/l, glucosio 20 g/l) agar, rispettivamente. I valori di ph sono stati misurati per ogni sospensione di impasto (1 g di impasto e 9 ml di acqua distillata) dopo 0, 6 e 24 ore di fermentazione utilizzando un elettrodo a vetro (phmetro 210, Radiometer, Copenhagen, DK). 76

5 Estrazione delle proteine dai campioni di impasto Le frazioni proteiche degli impasti sono state estratte in modo sequenziale utilizzando i seguenti solventi: (1) 0,5 mol/l di NaCl e 150 mmol/l di fosfato di sodio, ph 6,8 (albumine e globuline), (2) 50% (v/v) di 2-propanolo in H 2 O (gliadine), (3) 1,5% (w/w) SDS, 1% (w/w) di DTT e 0,063 mol/l di Tris-HCl, ph 7,5 (glutenine). 6 ml di solvente sono stati aggiunti a 2 g di impasto e ogni estrazione è stata effettuata per 30 minuti a temperatura ambiente (albumine, globuline e gliadine) o 70 C (glutenine), agitando la sospensione ogni 10 minuti. I surnatanti sono stati recuperati mediante centrifugazione per 10 minuti, x g a 4 C (albumine, globuline e gliadine) o a 20 C (glutenine). Un lavaggio del pellet con acqua deionizzata è stato incluso, in seguito all estrazione con soluzione salina, per rimuovere i residui di sale e di acidi organici. Gli estratti non sono stati combinati. La frazione contenente albumine-globuline è stata dializzata (Medicell International Ltd, Londra, tubi per dialisi di cut-off 3500 Da) contro acqua deionizzata a 4 C per 24 ore e successivamente liofilizzata e conservata a temperatura ambiente fino alle analisi mediante SDS-PAGE e RP- HPLC. Gli estratti contenenti gliadine e glutenine sono stati conservati a -80 C fino all analisi mediante SDS-PAGE Determinazione degli aminoacidi liberi totali La concentrazione di aminoacidi liberi totali presenti nella frazione solubile in soluzione salina è stata determinata utilizzando il metodo dell acido trinitrobenzensulfonico (TNBS; Adler-Nissen, 1979). Una curva di taratura è stata preparata utilizzando la leucina (Leu, Sigma) come standard (range 0,0-1,0 mmol/l di Leu) e risultati sono stati espressi come mg di Leu/kg di impasto Analisi degli estratti mediante RP-HPLC Gli estratti solubili in soluzione salina sono stati analizzati mediante RP-HPLC. I campioni liofilizzati sono stati disciolti (10 mg/ml) in acido trifluoroacetico (TFA, sequenziale grado, Sigma) allo 0,1% (v/v) in acqua deionizzata per HPLC (sistema Milli-Q, Waters Corp) e centrifugati a x g per 5 minuti a temperatura ambiente. I surnatanti sono stati filtrati con filtri in acetato di cellulosa con porosità di 0,45 μm (Sartorius GmbH, Goettingen, Germania) e iniettati (150 μl) in un sistema HPLC Varian (Varian Associates Inc., Walnut Creek, CA, USA), composto da un autocampionatore, un sistema PROSTAR con tre pompe per il solvente, uno rivelatore spettrofotometrico PROSTAR interfacciato con un PC e un software per il sistema di controllo e acquisizione dati (Varian 77

6 Star Workstation 5). La colonna utilizzata era una C8 250 x 4 mm Nucleosil (5 μm dimensioni delle particelle, 300 A dimensione dei pori, a temperatura ambiente), con una colonna di controllo 4,6 x 10 mm (HPLC Capital Ltd., Broxburn, West Lothian, Regno Unito). Per la separazione sono stati utilizzati gli eluenti A, TFA 0,1% (v/v) in acqua deionizzata HPLC, e B, TFA 0,1% in acetonitrile (HPLC, Lab-scan Ltd., Dublino, Irlanda) e il seguente gradiente: 100% A per 5 min, 50% B (v/v) da 6 a 55 min, 50% B (v/v) per 6 minuti, 60% B (v/v) da 62 a 66 min e 60% B (v/v) per 3 min, con un flusso di 0,75 ml/min. La colonna è stata lavata con il 95% B (v/v) per 5 minuti. Le proteine sono state rilevate misurando l assorbanza a 214 nm. Alcuni campioni sono stati replicati tre volte per misurare la riproducibilità delle condizioni operative Analisi degli estratti mediante SDS-PAGE Tutte le frazioni proteiche sono state analizzate mediante SDS-PAGE utilizzando un apparato MiniProtean III (Bio-Rad Laboratories). Gli estratti liofilizzati contenenti albumine-globuline (circa 3,0 mg) sono stati sciolti in 0,5 ml di tampone (Sample buffer 2x, Sigma), mentre 1 volume degli estratti di gliadina e 1 volume degli di estratti glutenina sono stati mescolati con 3 o 4 volumi di Sample buffer, rispettivamente. I campioni sono stati riscaldati a 95 C per 5 minuti prima della corsa elettroforetica, eseguita utilizzando un gel per la separazione (12% w / v T, 2,67% w / v C) e uno per l allineamento (4% T, C 2,67%) (Laemmli, 1970) delle proteine. I gel sono stati corsi ad una corrente costante di 20 ma per 3 ore utilizzando un unità Power Pack 3000 (Bio-Rad Laboratories). La colorazione è stata effettuata in accordo con Pot et al. (1994) Analisi statistica dei dati I cromatogrammi RP-HPLC (altezza e tempo di ritenzione dei picchi) sono stati trasformati attraverso una funzione logistica, come descritto da Piraino et al. (2004). L altezza di picco è stato espresso come percentuale sul totale e i picchi con altezza < 0,5% sono stati scartati dall analisi. I gruppi di picchi (45; altezza della classe = 1,48) sono stati definiti sulla base del tempo di ritenzione (RT) compreso tra 5 minuti (prima classe) e 70 minuti (ultima classe). Le 45 classi sono state utilizzate come variabili per l analisi delle componenti principali (PCA). I profili SDS-PAGE sono stati elaborati, in accordo con Piraino et al. (2002), utilizzando una trasformazione logaritmica della massa molecolare (MM; log kda). I gruppi di bande (16; larghezza della classe = 0,040 log kda) 78

7 sono stati calcolati nel range di MM da 20 kda (prima classe) a 80 kda (ultima classe). I profili SDS-PAGE delle frazioni conteneti gliadina e glutenina sono state analizzate attraverso matching visivo. Tutte le analisi statistiche e grafici sono stati realizzati utilizzando Systat 10,0 per Windows (SPSS, Chicago, IL, Stati Uniti d America) Risultati e discussione Crescita microbica, diminuzione del ph e aminoacidi liberi totali Le fermentazioni sono state effettuate utilizzando colture pure di batteri lattici e combinazioni di batteri lattici e un lievito commerciale. In aggiunta, sono stati realizzati degli impasti inoculati con i batteri lattici in presenza di tampone fosfato per rallentare il decremento di ph causato dalla produzione di acido lattico nel tentativo di discriminare tra gli effetti del metabolismo microbico e le condizioni di ph. Due fermentazioni, ottenute mediante aggiungendo antibiotici alla miscela dell impasto, sono state effettuate a ph neutro (6,0) e acido (3,5), per valutare la proteolisi in assenza di metabolismo microbico. L aggiunta di antibiotici, ha dato un buon controllo della crescita di batteri lattici e/o lieviti. Infatti, conta delle colonie di lieviti e batteri lattici negli impasti di controllo era inferiore a 10 3 ufc/g di impasto. Dopo 24 ore di fermentazione, gli impasti acidi avevano popolazioni microbiche che andavano da 8,6 a 9,6 log (ufc/g) per i batteri lattici e da 7,6 a 8,9 log (ufc/g) per i lieviti (Figura 1). L aggiunta del lievito ha diminuito notevolmente la popolazione finale dei batteri lattici (p = 0,015). Di conseguenza, i valori di ph sono stati leggermente più elevati quando il lievito è stato utilizzato nell impasto. Questa potrebbe essere una conseguenza della competizione microbica per le fonti di carbonio durante la fermentazione. Infatti, la crescita batterica e la produzione di acidi lattico e acetico diminuisce quando S. cerevisiae è associato ai batteri lattici a causa del rapido consumo di maltosio e glucosio da parte del lievito. Pertanto, lo squilibrio tra il consumo da parte del lievito e l idrolisi dell amido da parte degli enzimi della farina hanno portato al rapido esaurimento dei carboidrati solubile durante la fermentazione che, a sua volta, ha diminuito l acidificazione da parte dei batteri lattici (Gobbetti, 1998). In particolare, in questo studio, la popolazione dei batteri lattici omofermentanti è stata influenzata dalla presenza o dall assenza del lievito in misura minore rispetto ai ceppi eterofermentanti. Probabilmente, la diminuzione della crescita di W. cibaria e Leuc. mesenteroides potrebbe essere dovuta all elevato consumo di acido aspartico e asparagina 79

8 negli impasti inoculati con il lievito (Collare e Martinez, 1993); la maggior parte dei batteri eterofermentanti, infatti, sono auxotrofi per arginina, leucina, fenilalanina, triptofano, tirosina e valina (Collare et al., 1991). D altro canto, l aggiunta dei batteri lattici ha stimolato la crescita del lievito, che è passata dal 7,7 log (ufc/g) in assenza di batteri lattici, fino a 8,6-8,9 log (ufc/g) quando il lievito era utilizzato in associazione con ceppi di Lb. curvatus, W. cibaria e Lb. pentosus. Ciò suggerisce che la crescita dei lieviti potrebbe essere rafforzata da rilascio di aminoacidi e/o peptidi in seguito all azione proteolitica dei batteri lattici durante la fermentazione. La proteolisi operata dai batteri lattici, infatti, aumenta la concentrazione totale di aminoacidi liberi che possono essere utilizzati dai lieviti (Gobbetti, 1998). In questo studio, la concentrazione di aminoacidi aumentava durante la fermentazione, fino a raddoppiare dopo 24 ore di incubazione (Figura 2). Gli impasti acidi e l impasto di controllo a ph 3,5 hanno mostrato un aumento degli aminoacidi liberi rispetto all impasto di controllo neutro. Negli impasti fermentati con il lievito e i batteri lattici, la concentrazione di aminoacidi era inferiore (p = 0,001) rispetto a quella degli impasti fermentati solo con batteri lattici, indicando che il consumo di aminoacidi è maggiore in presenza di lieviti. Tuttavia, questi risultati possono essere dovuti in parte ai maggiori valori di ph (0,25 unità in media, p = 0,001) osservati a causa dell inibizione della crescita dei batteri lattici. La più bassa concentrazione di aminoacidi è stata osservata negli impasti fermentati solo con il lievito. Thiele et al. (2002) hanno dimostrato la fermentazione con batteri lattici porta ad un aumento delle concentrazioni di aminoacidi, mentre gli impasti inoculati con un coltura mista o con lieviti hanno un livello più basso di aminoacidi, a conferma che la presenza dei lieviti porta ad una esaurimento degli amminoacidi durante la fermentazione. La concentrazione di aminoacidi, inoltre, non ha registrato un aumento lineare durante la fermentazione; all inizio dell incubazione (6 ore) il livello di amminoacidi era inferiore negli impasti inoculati con i batteri lattici rispetto all impasto di controllo acidificato, suggerendo un periodo di adattamento dei batteri all ambiente seguito da una forte domanda di azoto assimilabile. I nostri risultati indicano che i livelli di aminoacidi ngli impasti dipendono da vari fattori, principalmente dal ph, dal tempo di fermentazione, dall attività proteolitica della microflora e/o degli enzimi della farina e dal consumo di aminoacidi da parte di batteri lattici e/o lieviti. L aggiunta di tampone fosfato non ha fornito un buon controllo del ph a causa dell elevata capacità acidificante dei ceppi di batteri lattici. I 80

9 Figura 1. Popolazione microbica (espressa come log ufc/ml) del lievito (yeasts) e dei batteri lattici (LAB) dopo 24 ore di fermentazione. P1=Lb. plantarum DBPZ1025, P2=Lb. plantarum DBPZ1015, PE=Lb. pentosus DBPZ0984, C=Lb. curvatus DBPZ1020, W=W. cibaria DBPZ1006, M=Leuc. mesenteroides DBPZ1005, N3=impasto di controllo acidificato, NN=impasto di controllo neutro; 7=condizioni tamponate; ( )=0 ore di fermentazioni, ( )=6 ore, ( )=24 ore. Simboli pieni=presenza di lievito. Figura 2. Concentrazione di aminoacidi liberi totali (espressa come mg Leu/kg di impasto) durante la fermentazione degli impasti. P1=Lb. plantarum DBPZ1025, P2=Lb. plantarum DBPZ1015, PE=Lb. pentosus DBPZ0984, C=Lb. curvatus DBPZ1020, W=W. cibaria DBPZ1006, M=Leuc. mesenteroides DBPZ1005, N3=impasto di controllo acidificato, NN=impasto di controllo neutro; 7=condizioni tamponate; ( )=0 ore di fermentazioni, ( )=6 ore, ( )=24 ore. Simboli pieni=presenza di lievito. 81

10 valori di ph sono stati in media di 0,12 unità superiori (p = 0,001) in presenza di tampone, ma questo non ha avuto alcun effetto significativo sulla crescita dei batteri. Il contenuto di aminoacidi liberi è stato leggermente inferiore quando è stato utilizzato il tampone, suggerendo che la proteolisi è principalmente associato alla diminuzione di ph che promuove l attivazione degli enzimi dei cereali. Tuttavia, il ph non è l unico fattore che determina il livello di aminoacidi liberi. In realtà, differenze significative erano evidenti a simili valori di ph e tempo di incubazione. In particolare, dopo 24 ore di fermentazione, l impasto inoculato con Lb. plantarum DBPZ1025 aveva una concentrazione di amminoacidi liberi superiore a quella dell impasto inoculati con Lb. pentosus anche se il ph finale era lo stesso (ph = 3,75). Inoltre, allo stesso tempo di fermentazione, la quantità di aminoacidi dell impasto inoculato con Lb. plantarum DBPZ1025 era superiore anche a quella dell impasto di controllo acidificato (ph = 3,5), suggerendo il contributo sostanziale dei batteri lattici negli eventi proteolitici, come già dimostrato da Di Cagno et al. (2002). In contrasto con i nostri dati, Thiele et al. (2002) hanno dimostrato che il rilascio di aminoacidi non ha superato le concentrazioni degli impasti di controllo acidificati, indicando che l attività proteolitica dei batteri è trascurabile rispetto all attività proteolitica degli enzimi della farina Idrolisi delle proteine solubili in soluzione salina durante la fermentazione degli impasti I cambiamenti che si sono verificati a carico della frazione proteica solubile in soluzione salina, durante la fermentazione degli impasti, sono stati analizzati qualitativamente mediante SDS-PAGE. Gli estratti conteneti albumine-globuline avevano polipeptidi con masse molecolari (MM) comprese tra 10 e 80 kda, con un alta concentrazione di bande con MM nel range di kda, kda e kda. I profili proteici mostrano che la fermentazione ha determinato la degradazione di proteine ad alto peso molecolare (Figura 3). L intensità di queste bande, infatti, è diminuita all aumentare del tempo di fermentazione e alcune bande sono completamente scomparse a causa della attività proteolitica. Le differenze tra i pattern SDS-PAGE degli impasti di controllo neutro e acidificato suggeriscono che i principali effetti sull idrolisi delle proteine 82

11 Figura 3. Esempio di SDS-PAGE della frazione contenete albumine e globuline. C1214 (60.8 kda), C10 (45.9 kda), C7 (34.8 kda), C5 (28.9 kda) e C2 (21.9 kda) sono le principali bande proteiche idrolizzate durante la fermentazione. L1, L7=standard di massa molecolare (Sigmamarker Wide Range, Sigma); L2=albumine; L3=globuline; L4= controllo neutro a 6 ore; L5= controllo acidificato a 6 ore; L6=Leuc. mesenteroides DBPZ1005 a 6 ore; L8=Leuc. mesenteroides DBPZ1005 a 24 ore; L9=Lb. plantarum DBPZ1025 con lievito a 6 ore; L10=Lb. plantarum DBPZ1025 con lievito a 24; L11=Lb. pentosus DBPZ0984 con tampone a 6 ore; L12=Lb. pentosus DBPZ0984 con tampone a 24 ore. erano imputabili alle condizioni di ph e all attività proteolitica degli enzimi della farina. Tuttavia, la presenza di lieviti e batteri lattici ha influenzato significativamente il pattern della frazione proteica solubile sia dopo 6 che 24 ore di fermentazione. Un elevato grado di idrolisi delle proteine è stato osservato negli impasti inoculati con Lb. plantarum DBPZ1015 e Lb. curvatus dopo 6 ore di fermentazione. Al termine dell incubazione (24 ore), negli impasti inoculati con i due ceppi di Lb. plantarum, e con il ceppo di Lb. curvatus e Lb. pentosus è stata osservata la maggiore degradazione delle proteine solubili. L associazione con il lievito, inoltre, ha portato ad un aumento delle frazioni proteiche con bassa MM rispetto agli impasti inoculati solo con i batteri lattici (Figura 4). In associazione con Lb. curvatus o con i due 83

12 ceppi di Lb. plantarum, la presenza del lievito migliorava la degradazione delle proteine a 60,8 kda, 38,2-34,8 kda e 28,9 kda, aumentando le frazioni proteiche nel range di 26,4-24,1 kda. L interazione tra Lb. pentosus e il lievito ha aumentato la produzione di frammenti nel range di MM da 21,9 a 20,0 kda, come conseguenza dell idrolisi delle proteine di MM compresa tra 28,9 e 24,1 kda. Analisi multivariata dei pattern SDS-PAGE della frazione proteica solubile Per determinare i principali fattori che influenzano l idrolisi delle proteine durante la fermentazione, è stata condotta un analisi delle componenti principali Figura 4. Multiplot dei profili SDS-PAGE della frazione proteica solubile, relative all interazione tra batteri lattici (LAB) e lievito (yeast) dopo 24 ore di fermentazione. CB=W. cibaria DBPZ1006, CU=Lb. curvatus DBPZ1020; ME=Leuc. mesenteroides DBPZ1005, NN=impasto di controllo neutro; P1=Lb. plantarum DBPZ1025, P2=Lb. plantarum DBPZ1015, PE=Lb. pentosus DBPZ0984. PINT= intensità della banda proteica come percentuale dell intensità totale. (PCA) sulla matrice di covarianza dei dati elettroforetici della frazione contenete albumine e globulina. Dopo un analisi preliminare, sono state selezionate le variabili (bande) C1214 (comprendente C12, C13 e C14), C11, C10, C8, C7, C5, C4 e C3. Due componenti principali sono stati usate per speigare il 79,8% della varianza totale. Le Figure 5 (a) e (b) mostrano la distribuzione dei campioni. La maggior parte della varianza (69,4%) è stata fortemente associata alla somma delle intensità delle bande che vanno da 55,3 a 66,5 kda (C1214, classe centrata a 60,8 kda) e debolmente legata ai cambiamenti delle bande appartenenti alle classi C4 (26,4 kda) e C8 (38.2 kda). Variazioni sul secondo asse principale (10,4% della varianza totale) sono state associate con le variabili C7 (34,8 kda), C11 (50,4 kda), C3 (24.1 kda) e C5 (28,9 kda). I campioni erano divisi in due gruppi, in base al tempo di fermentazione. 84

13 Figura 5. (a) Grafico dei due fattori dell analisi delle componenti principali (PCA). P1=Lb. plantarum DBPZ1025, P2=Lb. plantarum DBPZ1015, PE=Lb. pentosus DBPZ0984, C=Lb. curvatus DBPZ1020, W=W. cibaria DBPZ1006, M=Leuc. mesenteroides DBPZ1005, N3=controllo acidificato, NN=controllo neutro; 7=condizione tamponata; ( )=0 ore di fermentazione, ( )=6 ore, ( )=24 ore. Simboli pieni=presenza di lievito. (b) Grafico delle bande che influenzano la varianza nell analisi delle componenti principali a b 85

14 I campioni dopo 6 ore di fermentazione risultavamo più raggruppati rispetto a quelli analizzati dopo 24 ore di incubazione, ad eccezione dell impasto di controllo acidificato (NONE3) che presentava un ph basso fin dall inizio della fermentazione. I campioni di impasto inoculati solo con il lievito, sia a 6 che 24 ore, erano situati nella parte sinistra del grafico e mostravano i più bassi livelli di attività proteolitica. Le repliche degli stessi campioni erano molto vicini dimostrando la ripetibilità dell analisi. L analisi delle singole bande in funzione del tempo e del ph ha dimostrato che le bande appartenenti alla classe centrata a 60,8 kda diminuiva all aumentare del tempo e con la diminuzione del ph. La presenza del lievito migliorava l idrolisi delle proteine, soprattutto in associazione con Lb. curvatus, Lb. pentosus o Lb. plantarum DBPZ1015. Bande della classe C10 (45,9 kda) erano completamente scomparse dopo 24 ore. D altro canto, l intensità delle bande della classe C4 (26,4 kda) aumentava con il tempo di incubazione e, in misura minore, con la diminuzione del ph. Un alta intensità delle bande a 26,4 kda è osservata per gli impasti inoculati con Lb. curvatus e Lb. pentosus, in coltura pura o in associazione con il lievito, suggerendo che l attività microbica, insieme a cambiamenti di ph, erano alla base della proteolisi Analisi quantitativa della frazione proteica solubile mediante RP-HPLC L analisi dei cromatogrammi RP-HPLC frazione proteica solubile ha dimostrato che la fermentazione ha generato cambiamenti nei profili proteici. La fermentazione dell impasto di controllo ha causato una forte diminuzione dei picchi eluiti dopo 50 min (tempo di ritenzione, RT) e un aumento di quelli con RT di 40 min. Lo stesso andamento è stato osservato per gli impasti inoculati con W. cibaria, Lb. curvatus e Lb. plantarum DBPZ1015 dopo 24 ore di incubazione. Dopo 6 ore di fermentazione, l interazione con il lievito non ha modificato i profili RP-HPLC negli impasti inoculati con W. cibaria e Leuc. mesenteroides, mentre alcune differenze erano evidenti per gli impasti inoculati con i due ceppi di Lb. plantarum e, in misura minore, con Lb. pentosus. Al termine della fermentazione (24 ore), i maggiori cambiamenti sono stati osservati in presenza di lievito (Figura 6). Una PCA è stata effettuata sulla matrice di covarianza dei dati. Le variabili utilizzate per l analisi statistica sono state le classi comprese tra C24 e C34 (RT da 38,97 a 53,75 minuti, rispettivamente) e le due componenti principali spiegavano il 78,8% 86

15 Figura 6. Multiplot dei profili RP-HPLC della frazione proteica solubile, relative all interazione tra batteri lattici (LAB) e lievito (yeast) dopo 24 ore di fermentazione. CB=W. cibaria DBPZ1006, CU=Lb. curvatus DBPZ1020; ME=Leuc. mesenteroides DBPZ1005, NN= impasto di controllo neutro; P1=Lb. plantarum DBPZ1025, P2=Lb. plantarum DBPZ1015, PE=Lb. pentosus DBPZ0984. PEAKH= altezza del picco come percentuale dell altezza totale. della varianza totale. I risultati sono mostrati in Figura 7 (a) e (b). La prima PC (48,8% della varianza totale) è stata associata negativamente con C30 (picchi con RT di 47,8 min) e debolmente con C29 (RT di 46,36 min). La seconda PC (30% della varianza totale) è stata fortemente e negativamente correlata ai cambiamenti dei picchi con RT di 40,45 min (C25). I picchi C24 (RT di 38,97 min), C26 (RT di 41,93 min) e C28 (RT di 44,88 min) erano correlati debolmente e negativamente alla PC secondaria Un piccolo gruppo di campioni (sezione in basso a destra del grafico) aveva un profilo molto simile all impasto di controllo acidificato dopo 24 ore di fermentazione, con un decremento del picco con RT di 47,8 min e un aumento dei picchi con RT di 40,45 e 41,93 min. Questo andamento è stato osservato soprattutto quando Lb. curvatus, W. cibaria e Lb. plantarum DBPZ1025 erano utilizzati come starter e non erano associati al lievito. Questi risultati suggeriscono ancora una volta che il ph non è l unico fattore a determinare i cambiamenti a carico della frazione proteica durante la fermentazione. Un altro gruppo di campioni, analizzato sia dopo 6 che 24 ore (sezione in alto a destra del grafico) aveva un profilo simile all impasto di controllo neutro dopo 6 e 24 ore e a quello di controllo acidificato dopo 6 ore, indicando una moderata degradazione delle proteine. Gli studi sull idrolisi delle albumine e delle globuline durante la fermentazione sono rari rispetto a quelli sull idrolisi delle gliadine e delle glutenine e, di conseguenza, il confronto dei nostri risultati con i dati riportati in letteratura 87

16 Figura 7. (a) Grafico dei due fattori dell analisi delle componenti principali (PCA). PL1=Lb. plantarum DBPZ1025, PL2=Lb. plantarum DBPZ1015, PE=Lb. pentosus DBPZ0984, CU=Lb. curvatus DBPZ1020, CO=W. cibaria DBPZ1006, ME=Leuc. mesenteroides DBPZ1005, NONE3=controllo acidificato, NONEN= controllo neutro; 7= condizione tamponata; ( )=0 ore di fermentazione, ( )=6 ore, ( )=24 ore. Simboli pieni=presenza di lievito. (b) Grafico dei picchi che influenzano la varianza nell analisi delle componenti principlali a b

17 non è facile. Inoltre, l interpretazione dei risultati potrebbe essere difficile a causa della complessità di queste frazioni proteiche che potrebbero contenere peptidi solubili derivanti dall idrolisi di gliadine e/o glutenine. Di Cagno et al. (2002) hanno dimostrato un significativo grado di idrolisi della frazione solubile in acqua e sale durante la fermentazione di impasti inoculati con lattobacilli. Inoltre, la degradazione delle albumine e delle globuline è stata osservata anche in impasti acidificati (Thiele et al., 2003). L attività di una proteinasi spertica del glutine (GlAP 1) non ha avuto alcun effetto visibile sul profile SDS-PAGE di albumine e globuline (Bleukx et al., 1998), mentre un modesto cambiamento è stato osservato dopo 72 ore di digestione con una seconda proteinasi aspartica (GlAP 2) (Bleukx e Delcour, 2000) Analisi dei pattern SDS-PAGE di gliadine e glutenine Le gliadine e le glutenine sono state degradate in misura minore rispetto alle albumine e alle globuline durante la fermentazione (dati non mostrati). L idrolisi della frazione contenete le gliadine ha generato nuovi frammenti proteici con MM di ca. 20 kda e 27 kda, dopo 24 ore di fermentazione. In particolare, un elevata intensità della banda a 27 kda era presente nell impasto di controllo acidificato e e in quelli inoculati con Lb. plantarum DBPZ1015, in assenza del lievito. L intensità della banda a 20 kda, invece, è stata più elevata nell impasto di controllo acidificato e in quello inoculato con Lb. curvatus in associazione con il lievito. I profili elettroforetici delle glutenine indicano che la fermentazione ha portato alla rottura di proteine ad alta MM. I cambiamenti nelle glutenine sono stati osservati soprattutto nell impasto di controllo acidificato in cui si è verificata una completa scomparsa delle bande con MM tra 110 e 85 kda e da una diminuzione nell intensità delle bande con MM da 65 a 60 kda e da 54 a 34 kda. Nuovi frammenti proteici con MM di ca. 57 kda sono stati generati dall attività proteolitica degli enzimi della farina. Un simile grado di idrolisi è stato osservato negli impasti inoculati con i due ceppi di Lb. plantarum, da soli o in associazione con il lievito, e per quelli preparati con Lb. curvatus e Leuc. mesenteoides in associazione con il lievito. Non è stato possibile eseguire un analisi statistica multivariata dei risultati a causa della difficoltà nel risolvere l intensità delle bande da 36 a 45 kda che occupavano la maggior parte dei campioni di gliadine e glutenine. La proteolisi che si verifica durante fermentazione degli impasti acidi è stata 89

18 studiata da diversi autori, ma sono ancora poco chiari gli effetti del ph,del metabolismo microbico e delle attività enzimatiche. In letteratura, infatti, sono presenti numerosi lavori sull idrolisi delle proteine del glutine, ma molti di questi sono divergenti a causa della complessità del fenomeno. Le proteine del glutine contribuiscono alla forza dell impasto, alla ritenzione di gas e al miglioramento della struttura e del sapore dell impasto (Drago e Gonzalez, 2001). Tuttavia, l insolubilità in acqua delle proteine del glutine può limitare il substrato per gli enzimi proteolitici (Thiele et al., 2002), rendendo difficile la degradazione delle proteine. Inoltre, durante la fermentazione le subunità di glutenina sono idrolizzate e peptidi a basso peso molecolare rilasciati possono rimanere associati al macropolimero di glutine (Thiele et al., 2004). Thiele et al. (2004) hanno dimostrato che l idrolisi delle glutenine è legata principalmente alla diminuzione del ph durante il processo di fermentazione che, a sua volta, promuove l attivazione degli enzimi della farina, piuttosto che a specifiche proteinasi dei batteri lattici. Durante la fermentazione di impasti inoculati con lattobacilli aumentano le concentrazione di piccoli peptidi, come dipeptides e aminoacidi, mentre le quantità delle subunità di glutenina a peso molecolare (LMW-GS) rimangono inalterate. Al contrario, quando la fermentazione è svolta in assenza di colture starter, la maggior parte delle LMW-GS risulta in un alta concentrazione di peptidi (Thiele et al., 2003). L idrolisi delle proteine del glutine è principalmente connessa all attività di enzimi proteolitici della farina, come le proteinasi aspartiche (GlAP) e le serina proteinasi. Bleukx et al. (1998) hanno dimostrato che una GlAP aveva la massima attività di idrolisi del glutine a ph 3,0. I pattern SDS-PAGE degli impasti incubati con questa GlAP mostravano un elevata degradazione delle subunità di glutenina ad alto peso molecolare (HMW-GS) e la comparsa di diverse bande di proteine con MM nel range di 9-19 kda, kda, 57 kda e kda. Una GlAP (GlAP2), in contrasto con la prima, non era in grado di idrolizzare le subunità LMW-GS delle gliadine, mentre le HMW- GS sono state idrolizzate con il rilascio di frammenti proteici con MM di kda, 42 e 72 kda (Bleukx e Delcour, 2000). L idrolisi del glutine da parte dei batteri lattici è stata riportata da Wehrle et al. (1999). Tra i batteri lattici, Lb. sanfraciscensis CB1 ha dimostrato di avere una particolare capacità di degradare le proteine o i peptidi durante la fermentazione. Il sistema proteolitico Lb. sanfraciscensis CB1, caratterizzato da una serina 90

19 proteasi, da una dipeptidasi e un aminopeptidasi generale, aveva un elevata capacità di idrolisi nei confronti delle gliadine (Gobbetti et al., 1996). Di Cagno et al. (2002) hanno dimostrato che alcuni ceppi di batteri lattici sono in grado di idrolizzare il peptidi 33-mer, un potente induttore della risposta immunitaria mediata dalle cellule T nei pazienti affetti da morbo celiaco. I nostri risultati hanno dimostrato che la proteolisi da parte dei lieviti è trascurabile rispetto alle attività dei batteri lattici e degli enzimi della farina. Pochissimi sono i lieviti con una marcata attività proteolitica. Tuttavia, alcuni ceppi della specie Yarrowia lipolytica sono caseinolitici, e altri appartenenti ai generi Candida e Saccharomyces spp. producono proteinasi extracellulari con varie applicazioni nell industria alimentare, tra cui la liquefazione della gelatina (Mugula et al., 2003). Nel presente lavoro, i profili proteici ottenuti mediante SDS-PAGE e RP-HPLC hanno dimostrato la presenza di attività proteolitica durante la fermentazione. In particolare, questo studio conferma che gli eventi proteolitici durante la fermentazione degli impasti acidi sono in gran parte legati alle attività degli enzimi dei cereali ma, allo stesso tempo, i nostri risultai dimostrano il ruolo significativo svolto dai batteri lattici nella proteolisi e la loro possibile applicazione nel settore della panificazione. BIBLIOGRAFIA Adler-Nissen, J Determination of degree of hydrolysis of food proteins hydrolysates by trinitrobenzensulfonic acid. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 27, Bauer, N., Koehler, P., Wieser, H., Schieberle, P Studies on effect on microbial transglutaminase on gluten proteins of wheat. I. Biochemical Analysis. Cereal Chemisrty, 80, Bleukx, W.; Delcour, J. A. A second aspartic proteinase associated with wheat gluten Journal of Cereal Science, 32, Bleukx, W., Brijs, K., Torrekens, S., Van Leuven, F., Delcour, J.A Specificity of wheat gluten aspartic proteinase. Biochimical and Biophysica Acta, 1387, Collar, C., Martinez, C.S Amino acid profiles of fermenting wheat sour doughs. Journal of Food Science, 58, Collar, C., Mascarós, A.F., Prieto, J.A., Benedito De Barber, B Changes in free amino acid during fermentation of wheat doughs starter whit pure culture of lactic acid bacteria. Cereal Chemistry, 68, De Angelis, M., Gallo, G., Corbo, M.R., McSweeney, P.L.H., Faccia, M., Giovine, M., Gobbetti, M Phytase activity in sourdough lactic acid bacteria: purification and characterization of a phytase from Lactobacillus sanfranciscensis CB1. International 91

20 Journal of Food Microbiology, 87, De Vuyst, L; Neysens, P. The sourdough microflora: biodiversity and metabolic interactions Trends in Food Science and Technology, 16, Di Cagno, R., De Angelis, M., Lavermicocca, P., De Vincenzi, M., Giovannini, C., Faccia, M., Gobbetti, M Proteolysis by sourdough lactic acid bacteria: effects on wheat flour protein fractions and gliadin peptides involved in human cereal intolerance. Applied and Environmental Microbioogy, 68, Drago, S.R., González, R.J. Foaming properties of enzymatically hydrolysed wheat gluten Inovative Food Scence and Emerging Technologies, 1, Gobbetti, M. The sourdough microflora: Interactions of lactic acid bacteria and yeasts Trends in Food Science and Technology, 28, Gobbetti, M., Smacchi, E., Corsetti, A The proteolytic system of Lactobacillus sanfrancisco CB1: purification and characterizamtion of a proteinase, a dipeptidase, and aminopeptidase. Applied and Environmental Microbiology, 62, Laemmli, U.K Cleavage of structural srotein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, Loponen, J., Mikola, M., Katina, K., Sontag-Strohm, T., Salovaara, H Degradation of HMW glutenins during wheat aourdough fermentations. Cereal Chemistry, 81, Messens, W., De Vuyst, L Inhibitory substances produced by Lactobacilli isolated from sourdoughs-a review. International Journal of Food Microbiology, 72, Mugula, J. K., Sørhaug, T., Stepaniak, L Proteolytic activities in togwa, a Tanzanian fermented food. International Journal of Food Microbiology, 84, Pasini, G., Simonato, B., Giannattasio, M., Peruffo, A.D.B., Curioni, A Modification of wheat flour proteins during on vitro digestion of bread dough, crumb, and crust: an electrophoretic and immunological study. Journal of Agricultural and Food Chemisrty, 49, Piraino, P., Parente, E., McSweeney, P.L.H Processing of chromatographic data for chemometric analysis of peptide profiles from cheese extracts: a novel approach. Journal of Agricultural and Food Chemisrty, 52, Piraino, P., Ricciardi, A., Lanorte, M.T., Malkhazova, I., Parente, E A procedure for data reduction in electrophoretic fingerprints. Biotechnology Letters, 24, Pot, B., Vandamme, P., Kersters, K Analysis of electrophoresis whole-organism protein fingerprintings. In: Goodfellow, M., o Donnell, A.G. (Eds), Modern Microbiological Methods. Chemical Methods in Procaryotic Systematic. John Wiley and Son, Chichester Ricciardi, A., Paraggio, M., Salzano, G., Andreotti, G., De Fina, M., Romano, P La microflora degli impasti utilizzati per la produzione del Cornetto di Matera e del Pane di Altamura. Tecnica Molitoria Thiele, C., Grassl, S., Gänzle, M.G Gluten hydrolysis and depolymerization during sourdough fermentation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, Thiele, C., Gänzle, M.G., Vogel, R.F Flourescence labeling of wheat proteins for 92

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