ALLERGIE ALIMENTARI: STIMOLARE LA RICERCA PER TUTELARE IL CONSUMATORE. Torino, 9 Novembre 2012

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1 ALLERGIE ALIMENTARI: STIMOLARE LA RICERCA PER TUTELARE IL CONSUMATORE Torino, 9 Novembre 2012 Valutazione della tossicità delle proteine del glutine di Triticum monococcum nei pazienti celiaci Maria Mazza, BSc S.C. Neuroscienze - CEA S.S. Genetica e Immunobiochimica Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta

2 LA CELIACHIA La malattia celiaca è una malattia infiammatoria cronica immuno-mediata Ingestione del glutine presente nelle farine di grano, orzo e segale Può manifestarsi a qualsiasi età con ampio spettro di manifestazioni cliniche Esistono diverse forme cliniche: forma tipica o classica; forma atipica; forma silente; forma latente

3 Forma tipica o classica Esordio della malattia nei primi mesi di vita (6-15 mese) Quadro clinico: diarrea cronica, inappetenza, rallentamento della crescita, perdita di peso, ipotonia muscolare, irritabilità. Alterazioni della mucosa intestinale. Forma atipica Sintomatologia extra-intestinale Manifestazioni cliniche secondarie al malassorbimento: anemia, bassa statura, rachitismo, displasia dello smalto dentario, dolori addominali ricorrenti, ritardo puberale, aftosi recidivante, stipsi, ipertransaminasemia idiopatica, sindromi emorragiche, alopecia. Forma silente Presenza delle tipiche lesioni istologiche della mucosa intestinale Forma apparentemente asintomatica Forma latente Soggetti asintomatici con mucosa intestinale normale ma con marcatori anticorpali positivi.

4 Complicanze Nel caso di diagnosi tardiva o per mancato trattamento possono presentarsi diversi problemi piuttosto gravi a carico di diversi apparati, quali: gastroenterico (linfoma) osteoscheletrico (osteoporosi, osteomalacia) genitale femminile (infertilità, poliabortività) Diagnosi Markers sierologici: ricerca di anticorpi anti-gliadina (AGA) ricerca di anticorpi anti-endomisio (IgA-EMA) ricerca di anticorpi anti-transglutaminasi tessutale (IgA-tTG) Biopsia intestino tenue

5 Diagnosi definitiva Esame istologico Soggetto sano Soggetto celiaco Assenza villi villi cripte cripte Totale o parziale atrofia dei villi con perdita dell orletto a spazzola; ipertrofia delle cripte; aumentato numero dei IEL; infiltrazione nella lamina propria di cellule infiammatorie.

6 Epidemiologia della celiachia La malattia celiaca coinvolge tra lo 0.5% e l 1% della popolazione mondiale. Patologia ancora sottodiagnosticata Modello ad iceberg della celiachia diagnosticato non diagnosticato

7 GLUTEN FREE DIET Frumento, Orzo, Segale, Avena, NO Farro, Kamut, Spelta, Triticale. pane, pasta, prodotti da forno, birra,alimenti lavorati (gelati, salumi) Amaranto, grano saraceno, riso,mais, miglio, sesamo, sorgo tapioca,castagna patata, legumi, SI latte, uova, formaggi, prodotti da forno preparati con proteine alternative a quelle del glutine La spiga di grano barrata compare sulla confezione degli alimenti e bevande privi di prolamine tossiche ( 20ppm).

8 Basi genetiche della celiachia Associazione con alcune varianti del complesso HLA (Human Leucocyte Antigen) La predisposizione alla celiachia si correla con la presenza degli alleli DQA1*05 e DQB1*02 APC catena β DQB1*02 catena α DQA1*05 catena β DQB1*0302 catena α DQA1*03 HLA-DQ2 HLA-DQ8 ~ 90% celiaci ~ 6% celiaci DQA1*05 e DQB1*02 sono alleli comuni nella popolazione sana, quindi la presenza delle molecole HLA-DQ2 o DQ8 rappresenta una condizione necessaria ma non sufficiente. Probabile coinvolgimento di altri geni e/o altri fattori.

9 Eziologia Prolamine:ricche di prolina e glutamina Glutenine - elasticità Gliadine - estensibilità Gliadine: frazione alcool-solubile coinvolta nella patogenesi della celiachia Glutenine: frazione idro-solubile poco coinvolta nella tossicità

10 Gliadine Costituiscono il 40% delle proteine di riserva della cariosside A-PAGE ω γ Caratteristiche principali monomeriche solubili in alcool (etanolo) distinte in tre famiglie (ω, γ e α/β) p.m. compreso tra 28 e 70 kda α/β

11 Glutenine SDS-PAGE A D HMW Caratteristiche principali polimeriche, HMW ( kda) e LMW (10-70 kda) idro-solubili distinte in 4 gruppi:a (HMW); D, B e C (LMW) B C LMW

12 Prolamine Glutenine Gliadine Prolamine (ricche di prolina e glutamina) epitelio int. celiaco Proteasi Azione tossica 2-5 kda Zonulina

13 Patogenesi della malattia celiaca Attività citotossica Sistema immunitario innato

14 Patogenesi della malattia celiaca Attività immunogenica Sistema immunitario adattativo

15 PNAS October 14, 2003 vol. 100 no. 21 The HLA-DQ2 gene dose effect in celiac disease is directly related to the magnitude and breadth of gluten-specific T cell responses Willemijn Vader, Dariusz Stepniak, Yvonne Kooy, Luisa Mearin, Allan Thompson, Jon J. van Rood, Liesbeth Spaenij, and Frits Koning Soglia patologica Il numero di peptidi che interagiscono con i recettori HLA-DQ2 o HLA-DQ8 nella mucosa intestinale e l intensità della risposta delle cellule T indotta da ciascun peptide prolaminico determinano una soglia che deve essere superata affinchè in un individuo geneticamente predisposto alla celiachia si abbia una reazione immunitaria patologica verso le proteine del glutine.

16 Test in vitro Utilizzo di colture in vitro per studiare gli effetti dell esposizione alle prolamine e i meccanismi cellulari e molecolari della celiachia IMMUNITA INNATA Cellule K562(S) (mieloma leucemico umano) Cellule Caco2 (adenocarcinoma umano) Riduzione resistenza elettrica transepiteliale Agglutinazione Minimal Agglutination Concentration Crescita epiteliale simile alla mucosa in testinale Attivazione apoptosi

17 Test in vitro IMMUNITA ADATTATIVA Proliferazione cellulare Secrezione INF-γ Linfociti T prelevati dalla mucosa di pazienti celiaci

18 Peptidi tossici Esistono numerose sequenze peptidiche coinvolte nei processi di tossici Peptide 13-mer LGQQQPFPPQQPY (31-43 α-gliadina o A-gliadina), molto attivo nell indurre lesioni della mucosa intestinale e apoptosi dell enterocita (peptide citotossico). Questo peptide o la sua variante PGQQQPFPPQQPY è presente in molte delle sequenze α-gliadine Peptide 33-mer LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF presente nel grano tenero e contiene tre epitopi immunodominanti lunghi 11, 12 o 13 aa noti come DQ2-a-I (LQPFPQPQLPY), DQ2-a-II (PQPQLPYPQPQL) e DQ2-a-III (QLPYPQPQLPYPQ) che reagiscono fortemente con i linfociti T intestinali di tutti i pazienti celiaci (peptide immunogenico).

19 Peptide protettivo Peptide 10-mer QQPQDAVQPF (~1,2 kda), isolato tra i peptidi prolaminici della varietà di grano duro Adamello, previene l agglutinazione delle cellule K562 (S) causata dalle prolamine di grano tenero, grano spelta e di alcune accessioni di farro. Azione protettiva legata: 1. alla presenza di acido aspartico (D) in pos. 5; 2. alla presenza dell alanina (A) in posizione 6. I residui di aspartato e alanina competono per il legame con le APC e blocco della risposta immunitaria.

20 Triticum monococcum E un frumento diploide a cariosside vestita con genoma AA (2n=14). Rappresenta una varietà antica di frumento coltivata attualmente su poche centinaia di ettari in aree remote della regione mediterranea. Caratteristiche peculiari di questa varietà sono: 1. grande resistenza a stress ambientali e a vari patogeni; 2. elevato valore nutrizionale (maggiore contenuto in proteine, carotenoidi, vitamina E, lipidi, zinco e ferro); 3. migliore tollerabilità alimentare delle prolamine

21 Ricerca Corrente IZS PLV 14/10 Obiettivi Valutare la presenza ed il numero di peptidi tossici in alcune varietà di grano monococco attraverso studi immunobiochimici e test di tossicità in vitro. Selezionare linee di monococco tollerate dai celiaci ma soprattutto di ridurre l esposizione della popolazione umana alle proteine tossiche del glutine Unità Operative coinvolte 1. S.S. Genetica e Immunobiochimica (IZSPLV); Dr.ssa M. Mazza; 2. CRA-QCE; Dr. Norberto Pogna; 3. Ospedale G. Gaslini di Genova; Dr. Giovanni Candiano.

22 Materiali e metodi Varietà di grano monococco: Stendhal, Monlis e ID331 1.Estrazione e purificazione delle proteine del glutine dalle tre linee di grano monococco. 2.Separazione elettroforetica bidimensionale (A-PAGE x SDS-PAGE) delle proteine estratte. 3.Identificazione immunologica mediante Western Blot degli epitopi prolaminici immunodominanti. 4.Identificazione mediante spettrometria di massa degli spot proteici immunodominanti. 5.Valutazione della tossicità dei pepetidi prolaminici in vitro su cellule K562(S) e linfociti T di mucosa intestinale umana.

23 Risultati immunobiochimici Assenza nelle tre linee di monococco del peptide 13- mer (P31-43) con attività citotossica. Presenza di diversi peptidi con sequenza simile al peptide 33-mer con attività immunogenica. Assenza del peptide protettivo 10-mer.

24 Citotossicità Stendhal e ID331 non risultano tossici verso la mucosa celiaca, eccetto il Monlis che sembra comportarsi come il frumento tenero. Citotossicità del Monlis associata a peptidi diversi dal 13- mer. Presenza nel monococco di peptidi protettivi diversi dal peptide 10-mer.

25 Triticum monococcum Dal sequenziamento dei geni delle ω-gliadine di monococco, è stata individuata una sequenza codificante un peptide di 9 aa, con sequenza simile a quella ritrovata in grano duro varietà Adamello: Adamello QQPQDAVQPF Monococco QQPQRPQPF Sebbene siano leggermente diverse, queste sequenze sono accomunate dalla presenza di aa carichi in posizione centrale. Se questo peptide viene somministrato in combinazione con le prolamine di grano tenero, viene ridotta la produzione di IL-15 (responsabile dell effetto citotossico sulle cellule della mucosa intestinale).

26 Perché alcune linee di monococco non scatenano l immunità innata? Dall analisi elettroforetica A-PAGE delle tre linee si osserva che Monlis è priva di ω-gliadine, Stendhal presenta 4 bande che, in seconda dimensione, si risolvono in c.ca 13 spot e ID331 presenta una sola banda che si risolve, in seconda dimensione, in un solo spot a basso peso molecolare. 1. Stendhal 2. Monlis 3. ID 331 Stendhal ID331

27 Triticum monococcum I digesti PT-gliadinici delle tre accessioni di monococco sono stati testati sulle cellule K562 e su espianti bioptici del duodeno di pazienti celiaci in remissione: I digesti di Monlis hanno lo stesso comportamento dei digesti del grano tenero, sono quindi in grado di agglutinare le cellule K562 e stimolare l immunità innata. I digesti di ID331 non agglutinano le cellule K562 e non sono in grado di stimolare l immunità innata La proprietà protettiva di ID331 è dovuta all ω-gliadina, assente in Monlis?

28 Ringraziamenti Laboratorio Fisiopatologia dell Uremia Giovanni Candiano Unità di Ricerca per la Valorizzazione Qualitativa dei Cereali (QCE) di Roma Norberto Pogna SS Genetica e Immunobiochimica Pier Luigi Acutis Simona Carrella

29 Grazie a tutti per l attenzione

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