G. Perna, M. Lasalvia, V. Capozzi

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1 Applied Physics Laboratory University of Foggia Spettroscopia Raman e microscopia AFM di cheratinociti umani: modificazioni cellulari dopo esposizione a basse dosi di agenti xenobiotici G. Perna, M. Lasalvia, V. Capozzi Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università degli Studi di Foggia, Viale L. Pinto Foggia

2 Outline Sostanze xenobiotiche: HgCl 2 e pesticidi Modello cellulare: cheratinociti Metodi di indagine: microspettroscopia Raman e microscopia AFM Risultati su cellule fissate e viventi esposte a HgCl 2 Risultati su cellule fissate esposte a Chlorphyriphos e Deltametrina Risultati preliminari curve forza-distanza su cellule esposte a prodotto commerciale Conclusioni

3 Sostanze xenobiotiche composti che non vengono prodotti dal metabolismo degli organismi viventi Sono sintetizzati dall industria chimica: per la loro utilità nei processi produttivi industriali (catalizzatori, coloranti, polimeri, etc.) per incrementare la produzione agricola (pesticidi, fitofarmaci, concimi) per attività domestiche

4 Composti a base di mercurio (es. HgCl 2 ) HgCl 2 : presente in insetticidi, antisettici e disinfettanti

5 Pesticidi Prodotti chimici in grado di controllare, limitare, respingere o distruggere microrganismi considerati come nocivi Organofosfati: neutralizzano un enzima (acetilcolinaesterasi) fondamentale per il corretto funzionamento degli stimoli nervosi. Piretroidi: agiscono sui canali del sodio delle membrane nervose.

6 Esposizione a sostanze xenobiotiche: inalazione Atmosfera Atmosfera Campi coltivati Insediamento urbano e industriale

7 Esposizione a sostanze xenobiotiche: ingestione Emissione Ricaduta con la pioggia Atmosfera Insediamento urbano e industriale Campi coltivati Acque dolci e salate Acqua Trasformazione Animali d allevamento Consumatore Suolo Distribuzione e vendita

8 Esposizione a sostanze xenobiotiche: contatto Atmosfera Atmosfera Campi coltivati Insediamento urbano e industriale

9 Esposizione a sostanze xenobiotiche: limiti Per ciascuna sostanza esistono limiti di esposizione giornaliera accettabile: 0.01 mg Kg -1 peso corporeo giorno -1 ) (dose Effetti tossici hanno origine da alterazioni a livello cellulare strutture e funzioni cellulari possono essere alterate da modificazioni chimiche e morfologiche di componenti cellulari analisi su cellule in vitro Esposizione a basse concentrazioni ( 1 ordine di grandezza rispetto alla concentrazione citotossica)

10 Modello cellulare: cheratinociti Cheratinociti umani normali (linea primaria HUKE) Cellule in coltura in EpiLife medium a 37 C e 5% di CO 2 Esposizione per 24 h a diverse concentrazioni di xenobiotico Trypan blue Test colorimetrici MTT Concentrazione citotossica: provoca la morte di più del 50% del campione cellulare

11 Cellule viventi o cellule fissate? Fissazione Immersione in soluzione di paraformaldeide Formazione legami con proteine sulla membrana Cellula e componenti cellulari mantengono la loro morfologia anche in assenza delle condizioni chimico fisiche vitali Effetti fissazione: arresto dei processi vitali cellulari preservazione dei componenti cellulari contro processi di disgregazione.

12 Metodi di indagine: micro-spettroscopia Raman virtual state ƒ pump Raman Stokes excited state ground state Q.Matthews et al., Physics in Medicine and Biology 56, (2011)

13 Metodi di indagine: microscopia AFM T. Puntheeranurak et al., Nature Protocols 6, (2011)

14 Esposizione a HgCl 2 : Raman cellule fissate ~10-4 M concentrazione citotossica control treated with 10-6 M HgCl 2 treated with 10-4 M HgCl 2 Intensity (a.u.) Raman shift (cm -1 ) G. Perna et al., Journal Molecular Structure 834, (2007) 1206 cm -1 : C-C 6 H 5 Tyr, Phe, Trp; 1232 cm -1 : amide III ( sheet); 1262 cm -1 : amide III ( helix); 1287 cm -1 T, A (n.a.); 1302 cm -1 : CH 2 twisting (l); 1338 cm -1 : CH 2 twisting (p) + A, G (n.a.); 1379 cm -1 : A, G, T (n.a.).

15 Esposizione a HgCl 2 : AFM cellule fissate 10controllo -4 M HgCl M HgCl 2 G. Perna et al., Journal Molecular Structure 834, (2007)

16 Esposizione a HgCl 2 : AFM cellule viventi Cellula prima dell esposizione a 10-7 M HgCl line 1 y( m) x( m)

17 Esposizione a HgCl 2 : AFM cellule viventi Cellula 15 minuti dopo inizio esposizione a 10-7 M HgCl line 1 line 2 y( m) x( m)

18 Esposizione a HgCl 2 : AFM cellule viventi Cellula 35 minuti dopo inizio esposizione a 10-7 M HgCl line 1 y( m) x( m)

19 Esposizione a HgCl 2 : AFM cellule viventi Cellula 55 minuti dopo inizio esposizione a 10-7 M HgCl 2 (a) line 1 M. Lasalvia et al., Journal of Microscopy 243, (2011) y( m) (b) x( m)

20 Esposizione a HgCl 2 : AFM cellule viventi Relazione diretta tra morfologia cellulare ed HgCl 2 sui cheratinociti ad una concentrazione di 100 nm ALTERAZIONE MORFOLOGIA CELLULARE non citotossica citotossica 100 nm 1 μm 10 μm 100 μm 1 mm

21 Esposizione a pesticidi: vitalità cellulare Chlorphyriphos (organofosfato) alive cells dead cells Deltametrina (piretroide) alive cells dead cells HUKE cells ( %) HUKE cells (%) control chlorpyriphos concentration (M) 0 control x10-4 deltamethrin concentration (M) Concentrazione citotossica (24h) ~10-3 M (Chlorphyriphos) ~2.5x10-4 M (Deltametrina)

22 Esposizione a pesticidi: microspettroscopia Raman Cellule esposte a Chlorphyriphos intensity (a.u.) protein control 10-6 M 10-5 M protein protein + DNA lipid + protein DNA protein Raman shift (cm -1 ) G. Perna et al., Applied Physics Letters 95 (8), (2009)

23 Esposizione a pesticidi: microspettroscopia Raman Cellule esposte a Deltametrina Raman Intensity (a.u.) protein control 10-6 M 10-5 M protein protein+dna lipid+protein DNA protein Raman wavenumber (cm -1 ) G. Perna et al., Vibrational Spectroscopy 57, (2011)

24 Intensity (a.u.) Esposizione a pesticidi: analisi spettri Raman (a) Deconvoluzione con funzioni Gaussiane (b) (c) Raman shift (cm ) 1000 cm -1 : symmetric ring breathing Phe; 1032 cm -1 : CH in-plane bending Phe; 1088 cm -1 : PO 2 - stretching (n.a.) + C-O, C-C stretching (p) + C-C stretching (l); 1123 cm -1 : C-N stretching (p); 1177 cm -1 : C-H bending Tyr; 1206 cm -1 : C-C 6 H 5 Tyr, Phe, Trp; 1232 cm -1 : amide III ( sheet); 1262 cm -1 : amide III ( helix); 1302 cm -1 : CH 2 twisting (l); 1337 cm -1 : CH 2,, CH 3 wagging (p) + A, G (n.a.); 1379 cm -1 : A, G, T (n.a.); 1450 cm -1 : CH 2 /CH 3 scissoring (l.) + CH 2 bending (p.); 1480 cm -1 : A, G (n.a.); 1552 cm -1 : Trp; 1581 cm -1 : A, G (n.a.); 1615 cm -1 : C=C, Tyr. Trp; 1655 cm -1 : amide I ( helix); 1680 cm -1 : amide I ( sheet)

25 0.5 Esposizione a pesticidi: analisi spettri Raman Chlorphyriphos (1615 cm -1 ) (1206 cm -1 ) (1000 cm -1 ) Singoli amminoacidi 1000 cm -1 : symmetric ring breathing Phe 1206 cm -1 : C-C 6 H 5 Tyr, Phe, Trp 1615 cm -1 : C=C, Tyr. Trp intensity (a.u.) (control) ( cm -1 ) ( cm -1 ) 0 (control) (1379 cm -1 ) (1581 cm -1 ) (1480 cm -1 ) Legami fra amminoacidi cm -1 : amide I cm -1 : amide III Acidi nucleici 1379 cm -1 : A, G, T 1581 cm -1 : A, G 1480 cm -1 : A, G L intensità di ciascun picco è normalizzata rispetto a quella del picco a 1450 cm (control) Chlorphyriphos concentration (M)

26 Esposizione a pesticidi: analisi spettri Raman Deltametrina 0 (control) (1615 cm -1 ) (1204 cm -1 ) (1000 cm -1 ) Singoli amminoacidi 1000 cm -1 : symmetric ring breathing Phe 1204 cm -1 : C-C 6 H 5 Tyr, Phe, Trp 1615 cm -1 : C=C, Tyr. Trp intensity (a.u.) ( cm -1 ) ( cm -1 ) 0 (control) (1056 cm -1 ) Legami fra amminoacidi cm -1 : amide I cm -1 : amide III Carboidrati 1056 cm -1 : C-C L intensità di ciascun picco è normalizzata rispetto a quella del picco a 1450 cm (control) Deltamethrin concentration (M)

27 Esposizione a pesticidi: misure AFM Chlorphyriphos Controllo: nucleo compatto, superficie liscia, assenza di rugosità e fori M and 10-5 M: forma regolare, nucleo compatto, superficie con lievi increspature rispetto al controllo G. Perna et al., J. Raman Spectroscopy 42, (2011)

28 Esposizione a pesticidi: misure AFM Deltametrina Controllo:: nucleo compatto, superficie liscia, assenza di rugosità e fori M e 10-5 M: forma irregolare, membrana plasmatica danneggiata. G. Perna et al., Vibrational Spectroscopy 57, (2011)

29 Curve forza-distanza modulo di Young E sforzo, deformazione F>0: repulsiva F<0: attrattiva La forza di interazione è descritta da relazioni analitiche dipendenti dalla forma della punta e dalle caratteristiche dei due materiali a contatto

30 Curve forza-distanza Dimensioni sonda ~nm => proprietà elastiche locali Dimensioni sonda ~µm => => proprietà elastiche globali Stima di E: modello di Hertz Forza di indentazione su un materiale elastico ed omogeneo: F 4 RC 3 1 E 2 3/ 2 δ: profondità di indentazione ν: coefficiente di Poisson R C : raggio della sonda E: modulo di Young

31 Esposizione a pesticidi: curve forza-distanza Prodotto commerciale: Deltametrina + coformulanti + solvente Vitalità cellulare Concentrazione citotossica (per 24 h): > M L aggiunta di coformulanti diminuisce la concentrazione citotossica (~2 ordini di grandezza) Deflessione microleva (nm) controllo 5X10-8 M 5X10-7 M spostamento piezoelettrico (nm) Curve forza-distanza indentazione = spostamento - deflessione 5x10-7 M diminuisce deflessione aumenta indentazione

32 Esposizione a pesticidi: calcolo modulo di Young F 4 RC E / 2 F K, con K E R C K 3/ 2 4 RC E valori di K => 2 valori di E E 1 : indentazione minore di ~20 nm : regione membrana E 2 : indentazione maggiore di ~20 nm: regione citosol

33 Conclusioni Esposizione a concentrazioni di 1 o 2 ordini di grandezza inferiori alla citotossica causa alterazioni biochimiche nelle cellule CHLORPHYRIPHOS basi del DNA, singoli aminoacidi, legami peptidici, legami lipidici di membrana HgCl 2 legami lipidici di membrana e acidi nucleici DELTAMETRINA legami -CH 2 dei lipidi delle citomembrane

34 Conclusioni Esposizione a concentrazioni di 1 o 2 ordini di grandezza inferiori alla citotossica causa alterazioni morfologiche e meccaniche nelle cellule DELTAMETRINA Forma irregolare, formazione di fori e rigonfiamenti sulla membrana, riduzione del modulo di elasticità di membrana HgCl 2 Superficie irregolare, formazione di fori e rigonfiamenti sulla membrana HgCl 2 Azione immediata dell HgCl 2 provoca modificazioni della membrana plasmatica

35 Collaborazioni Vito Capozzi Marco Lazzarino Maria Lasalvia Elisa Migliorini Palma D Antonio Giuseppe Quartucci Emilio Mezzenga Antonio Cricenti Marco Luce