Marker d infiammazione nell esalato di bambini asmatici

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1 Marker d infiammazione nell esalato di bambini asmatici Chiara Zinelli, Massimo Corradi *, Elena Calcinai, Carlotta Povesi, Carlo Caffarelli Dipartimento dell Età Evolutiva e * Dipartimento di Clinica Medica, Nefrologia e Scienze della Prevenzione, Università di Parma L esalato respiratorio contiene diverse centinaia di composti, che sono classificati in base alle proprietà chimiche come gassosi o non gassosi; i non gassosi inoltre vengono suddivisi in composti volatili e non volatili 1 2. Tra le molecole gassose, l ossido nitrico (NO) ed il monossido di carbonio (CO) rivestono il maggiore interesse nell asma. Ossido Nitrico La frazione espirata del NO (FeNO) rappresenta il marker d infiammazione allo stato gassoso più studiato nell ultimo decennio, in quanto presenta favorevoli caratteristiche tra cui l alta riproducibilità della misurazione, immediatamente disponibile e ripetibile ogni qualvolta sia necessario. L enzima NO sintetasi (NOs) trasforma la molecola L-Arginina in NO; esistono 3 diverse isoforme 3 di questo enzima, due sono espresse in modo costitutivo da alcuni tipi di cellule, tra cui i neuroni (nnos, NOS1) e le cellule epiteliali (enos, NOS2), e la terza (inos, NOS2) può essere indotta in diversi tipi di cellule (tra cui le cellule del muscolo liscio, epiteliali, neutrofili, macrofagi), sotto lo stimolo di citochine infiammatorie, endotossine ed infezioni virali 4. Le cellule epiteliali delle vie aeree possono esprimere tutte le varie isoforme di NOS. Nella popolazione sana, l NO è prodotto in concentrazioni basali differenti, più basse nei polmoni, bronchi e trachea ed in concentrazioni maggiori nel naso e nasofaringe 5. Misurazione della FeNO Nel 1997 l American Thoracic Society (ATS) 6 ha pubblicato le raccomandazioni per una standardizzazione della misura della FeNO. Queste raccomandazioni sono state aggiornate nel 2005 dalla ATS/ European Respiratory Society (ERS) 7. La misurazione più diffusa è quella detta on-line, in cui il paziente, seduto comodamente con una clip al naso, respira attraverso un boccaglio direttamente collegato con l analizzatore. Nella misurazione detta off-line, invece, il paziente respira in un reservoir e l aria espirata viene analizzata successivamente. È stata trovata una buona correlazione tra la raccolta on-line e quella off-line 8. La misurazione della FeNO è possibile già a partire dall età di 4-5 anni. Sono state sviluppate tecniche particolari per consentirne la misurazione a partire dai 2 anni di vita 9. Un nuovo analizzatore portatile per il FeNO (NIOX MINO) offre la possibilità di misurare questa molecola anche a domicilio. È stata rilevata una sovrapposizione di risultati ottenuti con questa nuova apparecchiatura rispetto a quella tradizionale 10. Il range di riferimento della concentrazione di FeNO nella fascia d età 4-17 anni, è compreso tra 15 e 25 ppb, a seconda dell età e della presenza di atopia 11. La FeNO è considerato un indicatore dell infiammazione delle vie aeree nei bambini asmatici. Infatti, correla con la concentrazione eosinofila presente nel lavaggio bronco alveolare e nello sputum dei bambini con asma La FeNO sembrerebbe inoltre di utilità clinica nella diagnosi di asma. Smith et al. 15 in una popolazione mista di 47 adulti e bambini con sintomi riferibili ad asma bronchiale hanno dimostrato che anche una singola misurazione FeNO era fortemente predittiva di asma. Inoltre, la FeNO risultava molto più sensibile della spirometria, con un valore predittivo simile alla conta di eosinofili nello sputum. In un altro studio su 96 bambini in età prescolare con tosse cronica (e 62 controlli della stessa età), la FeNO ha permesso di evidenziare la presenza d infiammazione delle vie aeree già negli stadi precoci di asma

2 con un elevata sensibilità e specificità 16. La concentrazione di FeNO è in relazione anche con il grado di reattività bronchiale Tuttavia, recentemente Robroecks et al. 19 in uno studio condotto su bambini di età compresa tra i 5 ed i 16 anni, hanno rilevato una scarsa utilità della misurazione della FeNO nella diagnosi di asma. Il rapporto tra FeNO ed atopia negli asmatici risulta piuttosto controverso 6. Vi sono comunque studi che hanno dimostrato che la FeNO era aumentata in pazienti atopici 20, in bambini sani con prick tests cutanei positivi 21, in bambini che avevano presentato episodi di wheezing negli anni passati solo se atopici 22. FeNO e terapia dell asma Di grande interesse dal punto di vista clinico è considerata la possibilità di poter monitorare mediante il dosaggio della FeNO l efficacia della terapia antiasmatica. Alcuni studi hanno rilevato che la terapia con antagonisti dei leucotrieni riduce i livelli di FeNO 23 24, mentre i beta 2 agonisti a breve e lunga durata d azione hanno dimostrato di non avere effetto sulla concentrazione di FeNO 25. Maggiormente studiato è stato il rapporto tra livelli di FeNO e terapia inalatoria corticosteroidea. Ci sono evidenze del fatto che l aumento della dose di budesonide determini una riduzione significativa dei livelli di FeNO nei bambini asmatici 26. Inoltre negli adulti asmatici alla sospensione del cortisonico inalatorio, i livelli di FeNO discriminano coloro che vanno incontro a recidive asmatiche in maniera simile o inferiore alla conta degli eosinofili nello sputo Infine, Zacharasiewicz 30 ha valutato in 40 bambini con asma stabile l effetto su FeNO, sintomi e valori spirometrici, della variazione della dose di corticosteroidi inalatori. Essi osservarono che in presenza di una concentrazione di FeNO > 22 ppb, una riduzione della dose di ICS in atto si accompagnava ad un peggioramento del controllo clinico. D altra parte, il monitoraggio a domicilio del FeNO con NIOX MINO 31 mostrava variazioni diurne di FeNO con valori più alti al mattino senza evidenziare una correlazione con la gravità dei sintomi. In aggiunta, Pijnenburg 32 studiando bambini asmatici che avevano interrotto il corticosteroide inalatorio perché in remissione, ha osservato che la FeNO si correlava debolmente con la comparsa di riacutizzazioni asmatiche nei 6 mesi successivi alla sospensione. La migliore capacità diagnostica era raggiunta con livelli di FeNO pari a 49 ppb dopo 4 settimane dalla sospensione del corticosteroide. A questi livelli era possibile predire la comparsa di sintomi asmatici con una sensibilità del 71% ed una specificità del 93% 27. I bimbi con livelli di FeNO inferiori a 6 ppb non avevano ricadute. Sulla base di questi dati discordanti, negli ultimi anni, si è studiato l utilizzo della FeNO come guida nel modulare la terapia corticosteroidea inalatoria nei bambini con asma: sono presenti in letteratura, a questo riguardo, due lavori negli adulti e uno nei bambini (Tab. I). Smith et al. 33 in 97 adulti hanno evidenziato che, misurando i livelli di FeNO, la dose di steroidi per via inalatoria (fluticasone) può essere ridotta del 57% senza compromettere il controllo dell asma rispetto ad un gruppo di pazienti che utilizzava le Linee Guida GINA per modificare la terapia. Per di più, in quest ultimo gruppo si assisteva ad un incremento della dose di fluticasone di circa il 30% rispetto alla dose utilizzata all inizio dello studio. In entrambi i gruppi non si rilevavano benefici sul numero di esacerbazioni asmatiche, ponendo quindi il dubbio dell utilità di queste Linee Guida nella modulazione della terapia. Infine non erano inclusi nello studio pazienti con asma grave, pertanto le sue conclusioni non sono generalizzabili a tutti i soggetti asmatici. Shaw et al. 34 sono giunti a conclusioni simili dopo avere seguito 118 adulti per un anno. Il monitoraggio della FeNO era di beneficio per ridurre la dose finale del corticosteroide inalatorio, ma non sulla dose cumulativa annuale. Non si evidenziavano variazioni sul numero di attacchi d asma. Nel bambino, Pijnemburg et al. 35, hanno utilizzato una soglia di FeNO di 30 ppb per variare la terapia steroidea inalatoria. In questo modo non si otteneva né una riduzione della dose cumulativa annuale di steroide inalatorio, né del consumo di beta 2 agonisti, né un miglior controllo dei sintomi. La FeNO correlava con il punteggio dei sintomi e l uso di beta 2 agonisti nelle 2 settimane precedenti la visita di controllo, tuttavia non prediceva la gravità dei sintomi nelle 2 settimane successive alla visita di controllo. Non vi era correlazione tra FeNO e valori spirometrici. La modulazione della terapia steroidea inalatoria mediante i valori del FeNO sembra ridurne i livelli 34, almeno nell adulto. Se la FeNO è lo specchio fedele dell infiammazione delle vie aeree, la sua diminuzione potrebbe portare dei vantaggi a lungo termine anche per il bambino asmatico. Tuttavia, questa ipotesi deve essere ancora verificata, anzi, come sopra scritto, nello studio di Pijnemburg et al. 35 non sono stati dimostrati i vantaggi dell uso della misurazione della FeNO come parametro decisionale aggiuntivo nella gestione del bambino asmatico.

3 Tab. I. Utilizzo della misurazione della FeNO e posologia dello steroide inalatorio in pazienti con asma. Autore Scopo N. pz inizio/ N. pz fine Smith AD et al. 33 Pijnenburg MWH et al. 35 Shaw DE et al. 34 Ridurre dose fluticasone, ridurre n. esacerbazioni asma tramite l ausilio della misurazione della FeNO Ridurre dose cumulativa annuale degli steroidi inalatori tramite l ausilio della misurazione della FeNO Ridurre dose CSI, ridurre n. esacerbazioni asma tramite l ausilio della misurazione della FeNO 97 adulti con asma lieve-moderato: - Gruppo 1: 48 /46 - Gruppo 2: 49/48 85 bambini con asma atopico: - Gruppo 1: 42/39 - Gruppo 2: 47/ adulti con asma: - Gruppo 1: 58 /52 - Gruppo 2: 60/51 Metodi Studio singolo cieco randomizzato controllato Fase di aggiustamento e poi per 1 anno ogni 4 settimane aumento o riduzione fluticasone - Gruppo 1: in base a FeNO >15 ppb - Gruppo 2: in base ai sintomi. - Studio randomizzato controllato in doppio cieco Pz seguiti per un anno con visite ogni 3 mesi La dose di corticosteroidi era variata - Gruppo 1: in base a: FeNO cut off 30 ppb; punteggio sintomi cut off 14 (in 2 sett) - Gruppo 2: solo punteggio sintomi Studio singolo cieco randomizzato. Pz seguiti per 12 mesi - Gruppo 1: variazione dose steroidi: aumento se FeNO > 26 ppb riduzione se ppb in 2 visite. Variazione broncodilatatori in base ai sintomi - Gruppo 2: variazione CSI e broncodilatatori in base a Linee BTS Parametri valutati - FeNO - Spirometria - Sintomi - FeNO - Iperreattività bronchiale alla visita 1 e visita 5 - Spirometria - Sintomi - FeNO - Spirometria - Sintomi A 6-12 mesi sputo indotto e test meta colina PEFR a domicilio Risultati - Gruppo 1: riduzione significativa dose fluticasone rispetto a gruppo 2 ( gruppo 1: 370 μg/ die, Gruppo 2: 641 μg/ die) senza riduzione del n.esacerbazioni/anno in entrambi i gruppi - Gruppo 2: aumento dose fluticasone del 30% (senza vantaggi clinici né sul FeNO, né rispetto al reclutamento) - No variazione significativa dose cumulativa annuale CSI, sintomi giornalieri e consumo/die di β 2 agonisti tra i 2 gruppi - Valori di FeNO non variavano nel Gruppo 1 diventavano più elevati nel gruppo 2 (così da essere significativamente più elevati che nel Gruppo 1) - Riduzione significativa dell iperreattività bronchiale nel gruppo 1 (tuttavia 27 (31%) dei b. erano esclusi da questa analisi) - Gruppo 1: riduzione significativa dose CSI rispetto a gruppo 2 (gruppo 1: 557 μg/die, Gruppo 2: 895 μg/ die) senza riduzione del n. esacerbazioni/anno - Valori di FeNO inferiori del 24% nel gruppo 1 rispetto al gruppo 2 - Nessuna differenza tra i gruppi per: sintomi, dose cumulativa annuale di CSI,consumo broncodilatatori, PEFR, spirometria, test metacolina, sputo indotto Riassumendo, al momento l utilizzo del FeNO nella scelta della terapia farmacologia per controllare i sintomi asmatici non è confermato nel bambino ed è incerto nell adulto. In considerazione anche dell alto costo, attualmente il FeNO è da considerarsi un test non routinario ma solo complementare a quelli convenzionali. Monossido di Carbonio I dati sul monossido di carbonio (CO) in bambini con asma sono ancora preliminari. Il CO è aumentato nell asma acuto e quanto più l asma è grave Il trattamento steroideo non influisce sui suoi livelli

4 Tab. II. Valori di riferimento dei composti esalati e popolazione utilizzata per determinarli. Valori normali Popolazione FeNO < ppb dipendente dall età e dall atopia 405 bimbi, 4-17aa (11) EBC - - H 2 O 2 < mm 93 bimbi, 8-13 aa. Rilevabile nei 2\3 di bimbi e adulti (46) ph pz no differenza tra bambini e adulti (80) Temperatura dell esalato Nell infiammazione delle vie aeree si ha un aumento del flusso sanguigno mucosale con conseguente aumento della temperatura dell aria esalata. La validità della temperatura dell aria esalata come misura dell infiammazione delle vie aeree è supportata dal fatto che la somministrazione di albuterolo, un vasodilatatore, in soggetti non asmatici induce un aumento della temperatura dell aria esalata 38 e viceversa la somministrazione di budesonide, un vasocostrittore, provoca una significativa riduzione della temperatura 39. In 2 studi, non controllati, su bambini asmatici è stata dimostrata una correlazione tra la temperatura dell aria esalata e la concentrazione di FeNO. Non c è invece rapporto con la somministrazione della terapia steroidea, e neppure una significativa riduzione con la mancata esposizione all antigene Perché tale metodica divenga di largo utilizzo è necessario condurre studi mirati alla standardizzazione della procedura, in quanto la temperatura dipende dal flusso respiratorio e dalle condizioni dell aria inspirata. Condensato dell esalato Il condensato dell esalato respiratorio (EBC) è formato dalla raccolta e dalla condensazione dell aria esalata. L aria esalata è satura di vapore acqueo che condensa quando viene a contatto con una superficie fredda. Si forma così una soluzione acquosa costituita al 99% da acqua e da piccole quantità di sostanze volatili e non-volatili. La raccolta dell esalato è una manovra non invasiva, facile da eseguire e che non provoca nessun disagio e rischio per il bambino. La procedura è stata codificata da Linee Guida internazionali 42. Il bambino seduto respira a volume corrente in uno strumento raffreddato che termina in un collettore dove si viene a formare il condensato. È consigliabile utilizzare una clip nasale per assicurarsi che il bambino non respiri attraverso il naso. Il volume di EBC prodotto dipende principalmente dal tempo di ventilazione corrente e dalla temperatura di raffreddamento. Normalmente è necessario ottenere almeno 1 ml di EBC, che si forma in 10 minuti di ventilazione a volume corrente. La concentrazione dei diversi marker è considerata indipendente dalla quantità. I condensatori sono di materiale inerte, polietilene e polipropilene, per evitare qualsiasi assorbimento o rilascio di metaboliti e devono disporre di un filtro salivare. L EBC può essere raccolto a partire dai 3-4 anni, ma anche in soggetti di età inferiore utilizzando una maschera facciale. I campioni di EBC possono essere analizzati subito oppure possono essere congelati ed analizzati in seguito, a seconda della stabilità dei composti congelati. Anche se ancora non si conosce da quale specifico sito anatomico provenga l esalato, si ritiene che rifletta la composizione del film mucosale delle vie aeree e quindi anche l infiammazione cellulare di esse Nei bambini asmatici l esalato può essere utilizzato per valutare un gran numero di biomarker dello stress ossidativo (8-isoprostano, perossido di idrogeno, malondialdeide ecc.) e dell infiammazione (come cisteinil leucotrieni) e per valutare i cambiamenti biochimici delle vie aeree. Solo di alcuni biomarkers (Tab. II) sono disponibili i range di normalità delle loro concentrazioni nell esalato, questo anche perché in pochi studi è stato considerato un gruppo di controllo. H 2 O 2 Il perossido di idrogeno esalato è un indicatore dello stress ossidativo. Può essere misurato con diversi metodi tra cui la fluorimetria, la spettrometria, la chemiluminescenza. Esso è stato utilizzato nella ricerca pediatrica, in particolare nei bambini asmatici e nella fibrosi cistica, dove sono stati trovati livelli più alti di H 2 O 2 rispetto ai controlli 45 46, indipendentemente dalla terapia con corticosteroidi inalatori. Con la tecnica colorimetrica i valori di H 2 O 2 sono spesso al di sotto o ai limiti inferiori di rilevamento 47 per cui il loro valore risulta incerto. Inoltre la mancanza di un metodo standardizzato porta a dover ancora definire l utilità di questo marker. 11

5 Eicosanoidi Gli ecosanoidi derivano dall acido arachidonico. Il ruolo degli eicosanoidi nell asma è stato valutato attraverso lo studio di leucotrieni, prostaglandine, trombossani ed isoprostani nel condensato. Leucotrieni Tra i vari eicosanoidi analizzati nel condensato, i leucotrieni (LTs) sono quelli meglio caratterizzati. I cisteinil-lts (C4, D4, E4) inducono broncostruzione, perdita microvascolare, ipersecrezione mucosa e rimodellamento delle vie aeree, tutte importanti caratteristiche dell asma. Inoltre essi sono i principali LTs che si trovano nel lavaggio broncoalveolare dei pazienti asmatici. Tra i Cys-LTs, il LTC4 viene trasformato in LTE4 nel polmone e pertanto non è rilevabile. Gli altri risultano essere aumentati nei bambini asmatici rispetto ai soggetti sani e risultano elevati in bambini con asma persistente indipendentemente dalla terapia con steroidi inalatori. Carraro et al. 50 hanno mostrato alti livelli di Cys-LTs nell esalato di bambini con asma da sforzo che correlavano con la caduta del FEV 1 dopo esercizio fisico. Il LTB4, fattore chemiotattico per i neutrofili, è aumentato nelle forme di asma persistente, non è chiaro se sia aumentato nell asma intermittente, e sembrerebbe essere normale in soggetti con asma da esercizio fisico. Tuttavia uno studio recente avrebbe dimostrato che questo LT è derivato dalla contaminazione salivare. La relazione tra i LTs ed altri mediatori dell infiammazione non è chiara, per esempio non vi è correlazione tra LTD3, LTD4 e Cys-LTs e spirometria o FeNO Solo uno studio evidenzia una correlazione tra Cys-LTs e FeNO in pazienti asmatici non in terapia steroidea 53, ed un altro sempre in bambini asmatici tra Cys-LTs e 8-isoprostano 49. Riguardo al rapporto tra terapia antinfiammatoria e livelli di LTs nell EBC si può dire che tanto la somministrazione di steroidi per via inalatoria o orale quanto l assunzione di montelukast riducono il loro livello 54. È da sottolineare che il montelukast riduce i livelli di LTE4 solo in bambini atopici con asma 55. Anche il livello di Cys-LTs è ridotto dall eliminazione dell allergene. Prostanoidi La loro misurazione nell EBC non sembra essere un marker utile nell asma infantile. PGE 2 55, PGD 2 56, PGF 2 alfa 57 e trombossano B 2 58 non mostrano variazioni tra soggetti asmatici e sani e non sono influenzati dal trattamento con montelukast o steroidi inalatori isoprostano Gli isoprostani e gli analoghi delle prostaglandine sono formati dalla perossidazione dell acido arachidonico da parte delle specie reattive dell ossigeno (ROS). La misurazione di queste molecole nell esalato è vantaggiosa rispetto agli altri marker di ossidazione perchè sono stabili chimicamente. Alcuni studi riportano che l 8-isoprostano è elevato in bambini asmatici indipendentemente dalla terapia steroidea Tuttavia Shahid ha osservato che esso spesso non è rilevabile nell EBC di bambini asmatici. Inoltre è stato osservato che il livello di 8-isoprostano era inferiore nelle donne asmatiche 60 rispetto ai controlli e non era riproducibile a distanza di un giorno 61. Questi studi pongono la questione della sensibilità di questo metodo per monitorare l infiammazione. L impatto di differenti tecniche come la gas-cromotografia/spettrometria di massa richiede ulteriori studi. Ammoniaca L ammoniaca è un composto volatile generato dalla glutaminazione della glutamina e ha una funzione tampone sugli acidi regolando il ph dell EBC. Tuttavia essa viene anche prodotta durante l idrolisi dell ureasi nella bocca, tanto che potrebbe riflettere il ph orale più che quello delle vie aeree 62. Due studi condotti in età pediatrica dimostrano che la concentrazione di ammoniaca è significativamente più bassa nei soggetti con asma stabile rispetto ai controlli e che è negativamente correlata con la FeNO, per cui l acidità delle vie aeree potrebbe favorire la produzione di NO Nei soggetti sani i valori ammoniaca presentano un range molto ampio e spesso si sovrappongono con quelli dei soggetti asmatici. ph È stato proposto che la valutazione del ph dell EBC possa essere un marker dell infiammazione delle vie aree. Sicuramente il fatto che sia misurabile in maniera semplice, veloce, non invasiva, non costosa e riproducibile risulta vantaggioso. Va comunque tenuto presente che il ph è influenzato dal dispositivo utilizzato per la raccolta dell EBC. La misurazione del ph può essere eseguita dopo una standardizzazione con gas, deareazione, che equilibra il condensato con un gas CO 2 -refrigerato, o senza una standardizzazione con gas. È stato possibile calcolare, in soggetti sani, il range di normalità del ph dell EBC standardiz- 12

6 zato con gas. I valori possono variare tra 7,8 e 8,1 65 e non sono influenzati da età, sesso o dalla durata della ventilazione o dal volume dei campioni raccolti 66. Sono stati condotti 7 studi caso-controllo, in bambini asmatici. In sei studi su sette si è osservato un valore di ph più basso nei bambini asmatici rispetto ai controlli Il ph è tanto più basso quanto l asma è più grave I valori di ph dell EBC risultano più elevati in asmatici in terapia con steroidi inalatori rispetto a quelli non in terapia 70. Valori contrastanti sono stati trovati durante l attacco acuto d asma Inoltre non è stata trovata alcuna correlazione tra il ph e atopia, funzionalità polmonare o responsività delle vie aeree alla metacolina. È stato suggerito che durante la raccolta, una contaminazione salivare che contiene alte quantità di acetato e di ammoniaca, potrebbe avere un effetto alcalinizzante sul ph dell EBC 72. In realtà il ph dell EBC non diminuisce dopo la rimozione dell ammoniaca di origine orale, ottenuta attraverso l intubazione endotracheale e/o un risciacquo orale, né dopo la parziale o completa rimozione di tutta l ammoniaca di origine respiratoria attraverso il condensamento a basse temperatura o la raccolta dopo liofilizzazione. Inoltre è difficile spiegarsi come la contaminazione salivare possa spiegare i differenti ph nei diversi gradi di asma. Quindi sembra probabile che il ph dell EBC rifletta l acidità a tutti i livelli e possa essere un utile marker di infiammazione delle vie aeree. e che sembrano essere correlati all iperattività bronchiale ed al MEF 50. La NO 2 -tyr è un prodotto stabile che potrebbe rappresentare un biomarker della formazione dei prodotti intermedi del metabolismo del nitrogeno. Baraldi et al. hanno ricercato i livelli di NO 2 -tyr attraverso un nuovo metodo di cromatografia/spettrometria di massa ed hanno evidenziato concentrazioni 5 volte maggiori nei soggetti asmatici rispetto ai sani 74. Lo SNO è un broncodilatatore e risulta carente nei bambini asmatici in insufficienza respiratoria 75. Aldeidi e glutatione Le aldeidi ed il glutatione sono dosabili nell EBC attraverso differenti metodiche: cromatografia/spettrometria di massa per le prime e cromatografia liquida a fluorescenza per il secondo. Il limite inferiore a cui le aldeidi vengono rilevate è di 0,31-1,07 nm e del glutatione è di 2 nm con un range di normalità tra nm e nm rispettivamente. Il coefficiente di variazione medio della misurazione di aldeidi nell EBC è del 12-20% per le diverse aldeidi. Esiste un unico studio 76 in bambini asmatici che osservò alti livelli di aldeidi e bassi livelli di glutatione durante le esacerbazioni asmatiche rispetto ai controlli. I valori tornavano alla normalità dopo 5 giorni di trattamento con prednisolone. Ossidi d azoto I seguenti prodotti derivati dall ossido di azoto (NOx) sono stati rilevati nell EBC: l NO 2 (nitrito), NO 3 (nitrato), SNO (S-nitrosotiolo), NO 2 -tyr (nitro-tirosina). I NOx derivano probabilmente da 2 compartimenti dell aria esalata: particelle aerosolizzate dal fluido del rivestimento delle vie aeree, e fase gassosa dell ossido nitrico. La misurazione dei NOx nell EBC più quella della FeNO (cosiddetto totale degli ossidi dell azoto esalati) fornisce un modo migliore per distinguere gli asmatici dai controlli 73. L NO 2 e l NO 3 derivano dall ossidazione di NO che sono presenti nel fluido di superficie del tratto respiratorio e che si ritrovano nell esalato. L NO 3 deriva anche dall apporto dietetico di nitrato, e quindi dai suoi livelli plasmatici, e dalla quantità prodotta nel tratto orofaringeo. La maggior parte dell NO 2 origina dal tratto orofaringeo tramite la riduzione del nitrato salivare da parte dei batteri. Per adesso sono disponibili solo dati preliminari sui NOx che sembrano però mostrare un aumento della loro concentrazione nell EBC di soggetti asmatici 73 Citochine Le cellule Th2 hanno un ruolo patogenetico nell infiammazione asmatica. Sia le citochine Th2 (IL4,IL5) che le chemochine Th2 specifiche sono prodotte in eccesso nei soggetti asmatici. Tuttavia la concentrazione di diverse citochine è appena rilevabile o al di sotto del limite stabilito dal produttore. Perciò, per ovviare a tale inconveniente, i campioni devono essere spesso liofilizzati in modo tale da concentrarli prima della loro determinazione. Nei soggetti asmatici sono risultate aumentate le concentrazioni di IL4, IL5 e diminuite quelle di INF-gamma Tuttavia, Robroeks et al. 19 hanno valutato congiuntamente il livello di varie citochine e di FeNO per identificare i soggetti con asma, osservando che solo l IL4 era un marker significativo di malattia. In conclusione, l EBC è da considerare una tecnica molto promettente nella valutazione dell infiammazione delle vie aeree. Vi sono però dei problemi ancora irrisolti. Mancano procedure standardizzate per la raccolta dell esalato e la conseguente espressione dei risulta- 13

7 ti. Inoltre vi sono difficoltà analitiche, legate principalmente alla bassa concentrazione dei biomarker nell EBC. Una particolare prudenza va esercitata quando si usano tecniche biochimiche non validate, che producono valori vicini al limite inferiore di determinazione. È possibile migliorare la specificità della misurazione utilizzando altre metodiche come la cromatografia, la spettrometria di massa e l elettroforesi 79. Bibliografia 1 Goldoni M, Caglieri A, Andreoli R, Poli D, Manini P, Vettori MV, et al. Influence of condensation temperature on selected exhaled breath parameters. BMC Pulm Med 2005;5:10. 2 Effros RM, Peterson B, Casaburi R, Su J, Dunning M, Torday J, et al. Epithelial lining fluid solute concentrations in chronic obstructive lung disease patients and normal subjects. J Appl Physiol 2005;99: Nathan C, Xie QW. Regulation of biosynthesis of nitric oxide. J Biol Chem 1994;269: Gaston B, Drazen JM, Loscalzo J, Stamler JS. The biology of nitrogen oxides in the airways. 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