Si definisce PROTEOMA l insieme di tutte le componenti proteiche di una cellula, un tessuto, un organismo...!

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1 Cos è il PROTEOMA?! Si definisce PROTEOMA l insieme di tutte le componenti proteiche di una cellula, un tessuto, un organismo...! Studiare il proteoma di una cellula quindi vuol dire:! elencare tutte le proteine nella cellula! confrontare le proteine presenti a diversi stadi di sviluppo! studiare tutte le modificazioni post-traduzionali,.. (es fosfoproteoma)! studiare tutte le possibili interazioni proteina-proteina (proteoma dei complessi)! confrontare le proteine in condizioni fisiologiche e patologiche (desease proteomics, clinical proteomics)! studiare l attività delle diverse proteine! studiare la struttura delle diverse proteine (structural proteomics)! PROBLEMI PRINCIPALI! complessità del quadro proteico! variabilità del quadro proteico! bassa quantità della componente proteica!

2 Componenti molecolari di una! cellula di Escherichia coli! Percento approssimato Numero approssimato! del peso totale di specie molecolari! della cellula diverse! Acqua 70 1! Proteine ! Acidi nucleici! DNA 1 1! RNA 6 >3000! Polisaccaridi 3 5! Lipidi 2 20! Subunità! monomeriche e! Intermedi 2 500! Ioni inorganici 1 20!

3 B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2007

4 - Il proteoma è molto + complesso del genoma. Ad esempio 1 gene può codificare fino a 50 differenti proteine.! ~ human genes alternative splicing of mrna 2-5 fold increase post-translational modifications of proteins (PTMs) 5-10 fold increase ~ 1'000'000 human proteins ~ 80 to human transcripts Protein complexity!

5 Why proteomics? La velocità di sintesi delle proteine è diversa in tessuti e cellule diverse e a seconda della sua attività.! one genome due proteomi Indovina la differenza!! La concentrazione delle proteine è diversa

6 Why proteomics? La concentrazione proteica varia in funzione di:

7 PROTEOMICS APPLICATIONS Proteogenomics Biomarkers discovery Phosphoproteomics Glycoproteomics Nitroproteomics Quantitative proteomics Application in nutritional science Toxicoproteomics Metabolomics Analysis of patterns, complexes and pathways Innovative biomaterials

8 Un solo approccio.. A Bruker MALDI TOF-TOF autoflex III * ThermoFisher LTQ Orbitrap Velos ETD and nano HPLC Ultimate 3000 Dionex Procise Applied Biosystems

9 pi= carica nulla!

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11 Sensibilità dell ordine dei 5-10 ng

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14 Metodo analitico per misurare esattamente il PM

15 Sample! +! _!

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17 337 nm UV laser! Fluid (no salt)! +! _! cyano-hydroxy! cinnamic acid! MALDI! Gold tip needle! ESI!

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20 aspirin!

21 53! 6! 54! 3! 4! 5! 1! 2! 10! 8! 9! 22! 11! 14! 15! 23! 17! 16! 20! 19! 18! 25! 24! 47! 52! 27! 29! 50! Quali proteine sono presenti nel mio campione?! 31! 34! 35!

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23 Sequence! Mass (M+H)! Tryptic Fragments! >Protein 1! acedfhsakdfqea! sdfpkivtmeeewe! ndadnfekqwfe! acedfhsak! dfgeasdfpk! ivtmeeewendadnfek! gwfe! >Protein 2! acekdfhsadfqea! sdfpkivtmeeewe! nkdadnfeqwfe! >Protein 3! acedfhsadfqeka! sdfpkivtmeeewe! ndakdnfeqwfe! acek! dfhsadfgeasdfpk! ivtmeeewenk! dadnfeqwfe! acedfhsadfgek! asdfpk! ivtmeeewendak! dnfegwfe!

24 Sequence! Mass (M+H)! Mass Spectrum! >Protein 1! acedfhsakdfqea! sdfpkivtmeeewe! ndadnfekqwfe! ! >Protein 2! acekdfhsadfqea! sdfpkivtmeeewe! nkdadnfeqwfe! >Protein 3! acedfhsadfqeka! sdfpkivtmeeewe! ndakdnfeqwfe! ! !

25 Trypsin!!! XXX[KR]--[!P]XXX! Chymotrypsin!! XX[FYW]--[!P]XXX! Lys C!!! XXXXXK-- XXXXX! Asp N endo!! XXXXXD-- XXXXX! CNBr!!! XXXXXM--XXXXX! K-Lysine, R-Arginine, F-Phenylalanine, Y-Tyrosine,! W-Tryptophan,D-Aspartic Acid, M-Methionine, P-Proline!

26 Enzima molto stabile Lavora in un ampio range di ph e T. E abbastanza specifico nel taglio Produce peptidi di PM ideale per analisi di massa E poco costoso Produce picchi di autolisi che si usano come std interni , , , , , , ,

27 546 aa! 60 kda; Da pi = 4.75! >RBME00320 Contig0311_ _ EC-mopA 60 KDa chaperonin GroEL! MAAKDVKFGR TAREKMLRGV DILADAVKVT LGPKGRNVVI EKSFGAPRIT KDGVSVAKEV! ELEDKFENMG AQMLREVASK TNDTAGDGTT TATVLGQAIV QEGAKAVAAG MNPMDLKRGI! DLAVNEVVAE LLKKAKKINT SEEVAQVGTI SANGEAEIGK MIAEAMQKVG NEGVITVEEA! KTAETELEVV EGMQFDRGYL SPYFVTNPEK MVADLEDAYI LLHEKKLSNL QALLPVLEAV! VQTSKPLLII AEDVEGEALA TLVVNKLRGG LKIAAVKAPG FGDCRKAMLE DIAILTGGQV! ISEDLGIKLE SVTLDMLGRA KKVSISKENT TIVDGAGQKA EIDARVGQIK QQIEETTSDY! DREKLQERLA KLAGGVAVIR VGGATEVEVK EKKDRVDDAL NATRAAVEEG IVAGGGTALL! RASTKITAKG VNADQEAGIN IVRRAIQAPA RQITTNAGEE ASVIVGKILE NTSETFGYNT! ANGEYGDLIS LGIVDPVKVV RTALQNAASV AGLLITTEAM IAELPKKDAA PAGMPGGMGG! MGGMDF!

28 Trypsin yields 47 peptides (theoretically)! Peptide masses in Da:! 501.3! 533.3! 544.3! 545.3! 614.4! 634.3!!! 674.3! 675.4! 701.4! 726.4! 822.4! 855.5!!! 861.4! 879.4! 921.5! 953.4! 974.5! 988.5!!! ! ! ! ! ! !!! ! ! ! ! ! !!! ! ! ! ! ! !!! ! ! ! ! ! !!! ! ! ! ! !!!

29 1007! 1199! 2211 (trp)! 609! 450! 698! 1940 (trp)! 2098! !

30 Query Masses Database Mass List Results! ! ! ! ! ! ! (P21234)! (P12345)! (P89212)! (P12345)! (P89212)! (P12345)! (P21234)! (P21234)! (P89212)! (P89212)! (P21234)! (P12345)! 2 Unknown masses! 1 hit on P21234! 3 hits on P12345! Conclude the query! protein is P12345!

31 PeptIdent (ExPasy)! Mascot (Matrix Science)! MS-Fit (Prospector; UCSF)! ProFound (Proteometrics)! MOWSE (HGMP)! Human Genome Mapping Project! Mascot! theoretical! Protein ID! experimental!

32 2DE gel Intact protein Experimental proteolytic peptides Experimental MS COMPUTER SEARCH DNA sequence database Protein sequence database Theoretical proteolytic peptides Theorectical MS Susana Cristobal Bioinformatik, 4p. KTH

33 E necessario che la proteina sia presente in banca dati Picchi spuri possono dare problemi nel riconoscimento La precisione e l accuratezza del dato di massa è un fattore critico Generalmente si riescono ad identificare circa il 40% degli spots di un gel

34 P.M. 43 KDa Componente del ribosoma coinvolta nella biosintesi proteica Abbondante in S. aureus Simile alla Ribosomal protein S2 in Neurospora caninum, proteina immunodominante

35 Innovative biomaterials! BIAS BioInspired Adhesives for Surgery Università degli Studi di Milano Bicocca Department of Biotecnology and Biosciences Department of Material Science Department of Surgical Sciences Università di Milano Deparment of Animal Pathology Hygiene and Public Health Max-Planck Institute for Metal research University of Idaho Department of Biological Science Monogenoid ean parasite! Protein S1!? form the glue! Protein S2! Protein S3 detaching enzyme!

36 Quali sono le proprietà della mia proteina?!

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38 MODIFICAZIONI DI PEPTIDI E PROTEINE -redox Cys! -fosforilazioni (-OH di Ser Thr Tyr)! -amidazioni (c-terminale)! -deamidazioni ( Asn Asp Gln Glu)! -adenilazioni (AMP) e uridilazioni (-OH di Ser e Tyr)! -ADP-ribosilazione (Arg, Cys, Glu)! -idrossilazioni (aa aromatici)! -metilazioni -O-CH 3! -CO-O- CH 3!! -NH-CH 3! -ossidazioni (Met)!

39 Phosphorylation of Sic1 by CK2 in budding yeast cells (A) 2-D silver-stained gel of Sic1 immunopurified from elutriated cells with 0.90 of budding index (yeast strain 4245 Sic1-HA). Spots 1 and 2 are indicated (upper panel). After treatment with alkaline phosphatase only the spot 1 was detected (lower panel). (B) MALDI-TOF spectra of the spot 2 of Sic1 pooled from five individual gels. A peak at m/z corresponding to peptide was indicated. Inset shows that after phosphatase treatment the non-phosphorylated peak at m/z was identified. BBRC 346 (2006) !

40 Lysine specific histone demethylase 1 (LSD1): tissue specificity and phosphorylation pattern of the LSD1-8a isoform! LSD1 contributes to chromatin remodeling by specifically removing methyl groups from Lys4 of histone H3. The E8a containing isoforms are detected only in brain tissues and contributes to neurite morphogenesis! LSD1-2a/8a! LSD1-2a! LSD1-8a! LSD1! 8a 2a! 8a! Asp Thr Val Lys! 1-876aa! 1-872aa! 1-856aa! 1-852aa!

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43 E importante identificare il sito della modifica?! NO 2! P! Tyr 17! Tyr 376! NO 2! N- terminal! C- terminal!

44 !!! TAU PROTEIN! Pathological conditions! Nitration of TAU protein is linked to neurodegeneration in tauopathies (Alzheimer s disease, lateral sclerosis, Huntington s disease,.)! Physiological conditions! TAU is nitrated in PC12 cells after NGF-induced differentiation! TAU is nitrated in rat and mouse brain! Nitration is a novel modification involved in modulation of cytoskeleton stability! TAU_MOUSE Tyr17 Tyr488 Tyr601 Tyr685 // TAU_RAT Tyr17 Tyr507 Tyr620 Tyr704 Tyr432 hτ40_human Tyr29 Tyr197 Tyr310 Tyr394 // Neurochem Res. 33 (2008), ! TAU green / anti NOTYR red / DAPI blue!

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51 -solubilità diversa delle proteine! -la 2D NON separa tutte le proteine! -molte proteine sono poco espresse (es. chinasi)! -proteine non presenti in banca dati NON possono essere identificate! -ci possono essere più isoforme! -non esiste una tecnica analoga all PCR x campioni poco abbondanti!

52 Fractionation &! Isolation! 2-DE! Liquid! Chromatography! Peptides! Characterization! Mass Spectrometry! Identification! Post Translational modifications! Quantification! Database Search! MALDI-TOF MS! µ-(lc)-esi-ms/ms!

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54 Protein Mixture! Tandem Mass Spectrometer! Digestion! 2D Chromatography! Peptide Mixture! RP! SCX! > 1,000 Proteins Identified! MS/MS Spectrum! SEQUEST! DTASelect & Contrast!

55 337 nm UV laser! cyano-hydroxy! cinnaminic acid! MALDI!

56 Normal! Tumor!

57 BIBLIOGRAFIA! Methods in Molecular Biology Basic protein and peptide protocols - Vol. 32! John M, Walker ed.! Methods in Molecular Biology 2-D proteome analysis protocols Vol 112! Andrew J. Link ed.! K. Wilson, J. Walker Metodologia Biochimica, Raffaello Cortina Editore, Milano! NATURE INSIGHT PROTEOMICS - 422, (2003)! Riviste:! Electrophoresis! Methods in Enzymology! Analytical Biochemistry! Proteomics! Journal of mass spectrometry! Journal of proteome research! Links utili:!

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59 CID: Collision-Induced Dissociation! CAD: Collision Activated Dissociation! Cella di collisione! m/z! Gas di collisione! Lo ione entra nella cella di collisione!

60 CID: Collision-Induced Dissociation! CAD: Collision Activated Dissociation! Collisione! Cella di collisione! m/z! Gas di collisione! Lo ione collide con una molecola di gas presente nella cella di collisione!

61 CID: Collision-Induced Dissociation! CAD: Collision Activated Dissociation! Cella di collisione! Molecola attivata! m/z! Gas di collisione! Lo ione passa ad uno stato attivato (energia dell urto)!

62 CID: Collision-Induced Dissociation! CAD: Collision Activated Dissociation! Cella di collisione! Frammenti! (m/z) 1! (m/z) 2! (m/z) 3! N! Gas di collisione! Lo ione Dissipa l energia frammentandosi!

63 CID: Collision-Induced Dissociation! CAD: Collision Activated Dissociation! Cella di collisione! Frammenti! N! (m/z) 3! (m/z) 2! (m/z) 1! MS! Gas di collisione! Gli ioni generatisi per frammentazione possono! essere analizzati dal secondo analizzatore!

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65 His 6 - Cdc34 S130A 123 SVLISIVA 130 LLE 133 Cell Cycle 7 (2008), 1-12!

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