Linfonodo sentinella. metodo OSNA: esperienze e confronto con il metodo tradizionale

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1 Linfonodo sentinella secondo metodo OSNA: esperienze e confronto con il metodo tradizionale Dott.ssa C.M.. Antonacci U.O. Anatomia Patologica A.O. Ospedale Luigi Sacco di Milano

2 Linfonodo sentinella Il primo linfonodo che riceve la linfa dal tumore Il linfonodo in cui è più probabile il riscontro di metastasi Fornisce informazioni sulla stadiazione e la prognosi Carcinoma Negativo Analisi del linfonodo sentinella Positivo Assenza di metastasi linfonodali Asportazione di linfonodi del cavo ascellare

3 OSNA: One Step Nucleic Acid Amplification Rivelazione intraoperatoria delle Metastasi Linfonodali (LN) in pazienti affette da Carcinoma Mammario Marker: Citocheratina 19 (CK19) marker epiteliale Determinazione quantitativa dell mrna della CK19 nel LN mediante amplificazione RT-LAMP

4 Motivazioni della scelta Motivazioni tecniche - Mancanza di personale - Tempi lunghi per la refertazione istologica Casistica - Prevalenza di T1 e Tis OSNA

5 Vantaggi metodo OSNA Rivelazione intra-operatoria delle metastasi linfonodali: ottimizzazione del trattamento chirurgico Possibilità di analisi dell intero linfonodo eliminazione errori di campionamento Standardizzazione del metodo e tempi di rilevazione

6 Metodiche di valutazione del linfonodo sentinella esame istologico definitivo Tempo medio di risposta 15 giorni esame istologico estemporaneo Tempo medio di risposta minuti molecolare (OSNA) Tempo medio di risposta (OSNA): minuti

7 Esame Istologico Definitivo: - Fissazione in Formalina - Inclusione in Paraffina - Taglio al Microtomo - sezioni seriate dell intero blocchetto (secondo metodo IEO): - Ogni 50µ per 10 livelli - Ogni 100µ fino ad esaurimento del materiale - 2 sezioni di 4µ per ogni livello per colorazioni con EE e IIC

8 Esame Istologico Estemporaneo: - Tessuto conservato a fresco - Inclusione in OCT - Congelamento - Taglio al Criostato -sezioni seriate dell intero materiale secondo metodo IEO - Colorazione EE e bianchi per IIC

9 OSNA: Analisi Molecolare - Tessuto conservato a fresco - Valutazione del campione da parte del Patologo - Preparazione del linfonodo Omogeneizzazione - Analisi OSNA: RT-LAMP dell mrna di CK19 - Valutazione dei Risultati - Sterilizzazione della strumentazione

10 Reagenti ecc LynoRagh: - Pre Pre-trattamento/ trattamento/omogenazione del campione - Stabilizza RNA e protegge dalle ribonucleasi - Riduce le inibizioni LynoAmp LynoAmp: - Reagente di Amplificazione e Calibrazione - Include: Enzimi Primer Controlli (CP CN) Calibratori RD100i: RD100i: - Analizzatore - Computer Calibratori (3 serie: C1, C2, C3 a diversa concentrazione di mrna di CK19)

11 Tecnologia: RT-LAMP (Loop Mediated Isotermal Amplification) Amplificazione Isotermica a 65 C Contemporanea Trascrizione inversa dell mrna di CK19 ed Amplificazione del cdna 6 primers differenti (elevata specificità) Assenza di purificazione dell acido nucleico Rilevazione target in tempo reale (tempo di amplificazione 16min) Quantificazione del numero delle copie di CK19 Quantificazione della torbidità del Magnesio Pirofosfato Tempo di incremento valutato in rapporto alla curva di calibrazione

12 Processazione Calibrazione dello Strumento RD100i Da eseguire ogni volta che si esegua una seduta di analisi Preparazione del campione LNS Omogenazione e Diluizione del LN secondo protocollo Amplificazione RT-LAMP

13 Metodi: Preparazione del campione Campione trasportato a secco in ghiaccio Valutazione del tessuto da parte del Patologo: - peso (range mg) - eliminazione tessuto adiposo Sezione del Linfonodo e Apposizione Citologica: - colorazioni Omogeneizzazione Centrifugazione Diluizione del campione Analisi OSNA: processazione del campione nello strumento RD100i

14 Valutazione dei risultati Neg: : negativo - assenza di mrnack19 (+): Micrometastasi <copie mrna CK19< 5000 (++): Macrometastasi - copie mrna CK19 >5000

15 Analisi Citologica Linfonodo Taglio centrale Parte laterale Parte laterale Apposizioni su vetrino delle parti laterali Viene eseguita prima della Valutazione Molecolare. Rappresenta materiale di archivio Fissazione (aria/alcool) Colorazione May-Grunwald-Giemsa (MGG) Papanicolau (PAP)

16 Confronto Valutazione Istologica/OSNA Casistiche (pazienti): PRE-OSNA: 139 OSNA: 116 MACRO MICRO TOT POS / PZ PRE-OSNA 10 (66,7%) 5 (33,3%) 15 15/139 (10,8%) OSNA 5 (31,2%) 11(68,8%) 16 16/116 (13,8%) T1 Tis T2,T3 tot PRE-OSNA 10 (66,7%) 1 (6,6%) 4 (26,7%) 15 OSNA 11 (68,7%) 2 (12,5%) 3 (18,8%) 16 NON sensibile aumento della positività Inversione della distribuzione MACRO/MICRO metastasi Analoga distribuzione delle positività nei diversi stadi

17 Ad oggi: Azienda Ospedaliera, Polo Universitario, L. Sacco Milano: novembre luglio 2013 Pazienti OSNA: 458 Positivi: 83 (18,1%) Macrometastasi: 43 (52%) Micrometastasi: : 40 (48%)

18 In Europa gli utilizzatori del metodo OSNA in routine sono circa 190 distribuiti prevalentemente in Spagna, Francia, Italia, Inghilterra e Germania In Italia i Centri utilizzatori OSNA ad oggi sono 32 a partire dal 2008.noi il 4 4 centro

19 Linee guida OSNA: meeting Napoli 2013 I criteri di selezione delle pazienti: - Negatività clinica, ecografica e citologica dell agobiopsia del cavo ascellare - La positività IHC della CK19 testata sulla core biopsy o agoaspirato pre-operatorio del carcinoma primitivo mammario NON è un criterio indispensabile di selezione Analisi dell intero linfonodo: - Previo apposizione della sezione centrale che rimane l unico materiale di archivio Indicatori di qualità: - Media < 1,5 LN/paziente - Positività (Macro+Micro)) tra 20-30% della casistica del centro

20 Aspetto clinico della metodica 1. Consenso informato obbligatorio 2. Referto: - Descrizione Macroscopica (peso e dimensioni) - Descrizione Microscopica (apposizioni) - Diagnosi: Neg/Micro/Macro 3. Utilizzo clinico del risultato OSNA (-): NON si esegue dissezione ascellare OSNA (++): macro-metastasi: metastasi: SI esegue la dissezione del cavo OSNA (+): micro-metastasi: metastasi: la decisione clinica è rimandata all esperienza/consuetudine di ogni singolo centro

21 Futuro:??? Nomogramma Database (gestito dal Prof De Filippo Istituto Tumori Regina Elena - Roma) di tutti i casi OSNA positivi raccolti dai centri Europei utilizzatori, al fine di scrivere linee guida per un uniforme comportamento fra clinici nell approccio della Patologia Mammaria

22 CASO NEGATIVO Sezione istologica colorata con EE Apposizione colorato con MGG Curva di crescita (OSNA)

23 CASO POSITIVO (macrometastasi) Sezione istologica colorata con EE Apposizione colorata con PAP Curva di crescita (OSNA)

24 Da ultimo GRAZIE!

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