Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

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1 Guida introduttiva Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Esperimenti di

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3 Guida introduttiva Introduzione Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Esperimenti di Disegno dell'esperimento Preparazione delle reazioni Esecuzione dell'esperimento Analisi dell'esperimento

4 Copyright 2006, 2010 Applied Biosystems. All rights reserved. Information in this document is subject to change without notice. Applied Biosystems assumes no responsibility for any errors that may appear in this document. APPLIED BIOSYSTEMS DISCLAIMS ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE. IN NO EVENT SHALL APPLIED BIOSYSTEMS BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF. Esclusivamente per uso a scopo di ricerca. Da non usarsi nell ambito di procedure diagnostiche. NOTICE TO PURCHASER: Label License The Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System is covered by US patents and corresponding claims in their non-us counterparts, owned by Applied Biosystems. No right is conveyed expressly, by implication, or by estoppel under any other patent claim, such as claims to apparatus, reagents, kits, or methods such as 5 nuclease methods. NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE A license to perform the patented 5 Nuclease Process for research is obtained by the purchase of (i) both Licensed Probe and Authorized 5' Nuclease Core Kit, (ii) a Licensed 5 Nuclease Kit, or (iii) license rights from Applied Biosystems. The TaqMan SNP Genotyping and TaqMan Drug Metabolizing Genotyping Assays contain Licensed Probe. Use of these products is covered by US patent claims and corresponding patent claims outside the US. The purchase of these products includes a limited, non-transferable immunity from suit under the foregoing patent claims for using only this amount of product for the purchaser s own internal research. Separate purchase of an Authorized 5' Nuclease Core Kit would convey rights under the applicable claims of US patents, and corresponding patent claims outside the United States, which claim 5 nuclease methods. No right under any other patent claim and no right to perform commercial services of any kind, including without limitation reporting the results of purchaser's activities for a fee or other commercial consideration, is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only. Diagnostic uses under Roche patents require a separate license from Roche. NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE A license to perform the patented 5 Nuclease Process for research is obtained by the purchase of (i) both Authorized 5' Nuclease Core Kit and Licensed Probe, (ii) a Licensed 5 Nuclease Kit, or (iii) license rights from Applied Biosystems. TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG is an Authorized 5 Nuclease Core Kit. Use of this product is covered by US patent claims and corresponding patent claims outside the US. The purchase of this product includes a limited, non-transferable immunity from suit under the foregoing patent claims for using only this amount of product for the purchaser s own internal research. Separate purchase of a Licensed Probe would convey rights under the applicable claims of US patents, and corresponding claims outside the United States. No right under any other patent claim and no right to perform commercial services of any kind, including without limitation reporting the results of purchaser's activities for a fee or other commercial consideration, is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only. Diagnostic uses under Roche patents require a separate license from Roche. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. TRADEMARKS: Applera, Applied Biosystems, AB (Design), MicroAmp, and VIC are registered trademarks, and FAM, StepOne, and TAMRA are trademarks of Applied Biosystems or its subsidiaries in the U.S. and/or certain other countries. AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. Excel, Microsoft and Windows are registered trademarks of Microsoft Corporation. All other trademarks are the sole property of their respective owners. N. di cat Rev. B 06/2010

5 Indice Premessa v Come utilizzare questa guida v Come ottenere ulteriori informazioni vii Come ottenere assistenza viii Convenzioni sulla sicurezza utilizzate in questo documento ix Simboli sugli strumenti xi Etichette di sicurezza sugli strumenti xii Sicurezza generale dello strumento xiii Sicurezza dalle sostanze chimiche xiv Sicurezza dei rifiuti chimici xvi Sicurezza elettrica xvii Sicurezza LED xviii Sicurezza rischio biologico xix Sicurezza della stazione di lavoro xix Norme di sicurezza e di compatibilità elettromagnetica (EMC) xx Capitolo 1 Introduzione Informazioni sul sistema StepOne Informazioni sugli esperimenti di Come utilizzare questa guida Informazioni sull'esperimento di esempio Flusso di lavoro dell'esperimento di esempio Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Descrizione generale Creazione di un nuovo esperimento Definizione delle proprietà dell'esperimento Definizione dei metodi e dei materiali Impostazione dei Saggi SNP Impostazione dei campioni e dei replicati Impostazione del metodo di esecuzione Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione Ordine dei materiali per l'esperimento Termine del flusso di lavoro del Design Wizard iii

6 Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Descrizione generale Preparazione delle diluizioni del campione Preparazione della miscela di reazione Preparazione della piastra di reazione Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Descrizione generale Preparazione per l'esecuzione (Opzionale) Abilitazione delle notifiche Avvio dell'esecuzione Monitoraggio dell'esecuzione Rimozione della piastra di reazione e trasferimento dei dati Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Descrizione generale Apertura dell'esperimento per l'analisi Visulizzazione del Plot di discriminazione allelica Visualizzazione del layout di piastra Visualizzazione tabella Well (Pozzetto) Visualizzazione del riepilogo CQ Visualizzazione del Plot dei dati non elaborati Visualizzazione del Plot multicomponente Visualizzazione Plot di amplificazione Visualizzazione delle impostazioni di analisi Pubblicazione dei dati Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi Flusso di lavoro impostazione avanzata Flusso di lavoro avvio rapido Flusso di lavoro del templato Flusso di lavoro esportazione/importazione Bibliografia Glossario Indice iv

7 Premessa Come utilizzare questa guida Scopo della guida A chi si rivolge Ipotesi assunte Convenzioni del testo La guida spiega come eseguire esperimenti di sul sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. Questa guida funge da: Tutorial, utilizzando i dati dell'esperimento di esempio forniti con il software del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. Guida, per i propri esperimenti. Questa guida è pubblicata per il personale di laboratorio e per i ricercatori principali che eseguono esperimenti di utilizzando il sistema StepOne. La guida prevede che l'utente: Abbia conoscenze sull'utilizzo del sistema operativo Microsoft Windows XP. Abbia conoscenze sull'utilizzo di Internet e sui browser di navigazione in Internet. Conosca le modalità di manipolazione dei campioni DNA e della loro preparazione per la PCR. Abbia dimestichezza con la memorizzazione dei dati, il trasferimento di file e le funzioni di copia e incolla. Abbia esperienza di collegamenti in rete, nel caso sia prevista l'integrazione del sistema StepOne nel flusso di dati preesistente del proprio laboratorio. La guida utilizza le seguenti convenzioni: Il testo in Grassetto indica un azione dell'utente. Ad esempio: Digitare 0, quindi premere Enter (Invio) per ognuno dei campi rimanenti. Il testo in Corsivo indica parole nuove o importanti e viene utilizzato anche per enfatizzare. Ad esempio: Prima di un'analisi, preparare sempre matrice fresca. Un simbolo di freccia a destra ( ) separa i comandi successivi selezionati da un menu a discesa o da un menu a scelta rapida. Ad esempio: Selezionare File Open (Apri). v

8 Premessa Come utilizzare questa guida Messaggi di attenzione per l'utente Nella documentazione per l'utente Applied Biosystems compaiono due tipi di messaggi di attenzione. Ciascun messaggio presuppone un particolare livello di osservanza o l'esecuzione di una particolare operazione da parte dell'utente, secondo quanto descritto qui di seguito: Nota: Fornisce informazioni che potrebbero essere di interesse o di aiuto ma non di importanza critica per l'uso del prodotto. IMPORTANTE! Fornisce informazioni necessarie per il corretto funzionamento dello strumento, per l'uso accurato del kit di chimica o per l'uso sicuro di una prodotto chimico. Alcuni esempi dei messaggi di attenzione sono indicati qui di seguito: Nota: La funzione Calibrate (Calibra) è anche disponibile nella Control Console (Console di comando). IMPORTANTE! Per verificare la propria connessione client, è necessario un ID utente valido. Messaggi di sicurezza Nella documentazione per l'utente appaiono anche Messaggi di sicurezza. Per ulteriori informazioni, consultare Messaggi di sicurezza a pagina ix. vi

9 Premessa Come ottenere ulteriori informazioni Come ottenere ulteriori informazioni Documentazione correlata La documentazione seguente è allegata al sistema StepOne : Documento n. di cat. inglese n. di cat. italiano Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started Guide for Genotyping Experiments Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative C T Experiments Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started Guide for Standard Curve Experiments Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation, Maintenance, and Networking Guide Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation Quick Reference Card Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Site Preparation Guide Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System software Help La documentazione seguente è disponibile per l'acquisto da Applied Biosystems: Documento n. di cat. Applied Biosystems High-Capacity cdna Reverse Transcription Kits Protocol Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation Performance Verification Protocol Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation Qualification- Operation Qualification Protocol Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Planned Maintenance Protocol Custom TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol Custom TaqMan Genomic Assays Protocol TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol Ordering TaqMan SNP Genotyping Assays Quick Reference Card Performing a Custom TaqMan SNP Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick Reference Card Performing a TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick Reference Card Pre-Developed TaqMan Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol vii

10 Premessa Come ottenere assistenza Documento Allelic Discrimination Pre-Developed TaqMan Assay Reagents Quick Reference Card n. di cat Nota: Per ulteriori documentazioni, consultare Come ottenere assistenza a pagina viii. Informazioni dalla Guida software (Help) La voce Help (Guida) del software StepOne descrive le modalità di utilizzo di ogni funzione dell'interfaccia utente. Accedere alla voce Help (Guida) dal software StepOne in uno dei modi seguenti: Premere F1. Fare clic su nella barra degli strumenti. Selezionare Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). Per trovare argomenti di interesse nella voce Help (Guida): Esaminare l'indice. Cercare un argomento specifico. Cercare un indice alfabetico. Invio di commenti Applied Biosystems è lieta di ricevere i commenti e i suggerimenti dei clienti allo scopo di migliorare la propria documentazione per l'utente. È possibile inviare commenti tramite e- mail a: IMPORTANTE! Utilizzare l'indirizzo sopra indicato esclusivamente per inoltrare commenti e suggerimenti relativi alla documentazione. Per ordinare documenti, scaricare file PDF o per aiuto su questioni tecniche, visitare il sito web all'indirizzo quindi fare clic sul link per il Support (assistenza). (Vedere Come ottenere assistenza qui di seguito). Come ottenere assistenza Per le informazioni relative a servizi e assistenza tecnica più recenti per tutte le sedi, visitare il sito web all'indirizzo quindi fare clic sul link Support (Assistenza). Nella pagina dell'assistenza clienti, è possibile: Ricercare argomenti attraverso le domande frequenti (FAQ) Inviare una domanda direttamente al servizio di assistenza tecnica Ordinare documenti per l'utente Applied Biosystems, MSDS, certificati di analisi e altri documenti correlati Scaricare documenti in PDF Ottenere informazioni sull'addestramento del cliente Scaricare aggiornamenti e patch del software viii

11 Premessa Convenzioni sulla sicurezza utilizzate in questo documento Inoltre, la pagina dell'assistenza clienti fornisce l'accesso ai numeri di telefono e di fax in tutto il mondo per contattare l'assistenza tecnica e i punti vendita Applied Biosystems. IMPORTANTE! Contattare il Servizio clienti Applied Biosystems (Customer Care Center) quando suggerito da questa guida o in caso di necessità per programmare le operazioni di manutenzione (quali, manutenzione pianifcata annuale o verifica/calibrazione della temperatura) per il proprio strumento StepOne Strumento StepOne. Per ottenere un numero di telefono o un indirizzo del servizio clienti, andare su Convenzioni sulla sicurezza utilizzate in questo documento Messaggi di sicurezza Nella documentazione per l'utente di Applied Biosystems appaiono quattro diversi messaggi di attenzione in punti del documento dove risulta necessario essere ben consapevoli della possibilità di pericoli rilevanti. Ciascun messaggio IMPORTANTE, ATTENZIONE, AVVERTENZA, PERICOLO presuppone un particolare livello di osservanza o l'esecuzione di una particolare operazione da parte dell'utente, secondo quanto descritto qui di seguito. Definizioni IMPORTANTE! Indica informazioni necessarie per il corretto funzionamento dello strumento, per l'uso accurato del kit di chimica o per l'uso sicuro di una prodotto chimico. Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non evitata, potrebbe causare lesioni di minore o moderata entità. Può inoltre essere utilizzata per mettere in guardia l'utente nei confronti di pratiche non sicure. Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non evitata, potrebbe causare lesioni gravi o morte. Indica una situazione di pericolo incombente che, se non evitata, causerà morte o lesioni gravi. Questo messaggio viene utilizzato esclusivamente nelle situazioni di estremo pericolo. Ad eccezione di IMPORTANTE, ogni messaggio di sicurezza in un documento Applied Biosystems appare accanto a un figura di triangolo aperto contenente un simbolo di pericolo. Questi simboli di pericolo sono identici a quelli posizionati sugli strumenti Applied Biosystems (vedere Simboli di sicurezza a pagina xi). ix

12 Premessa Convenzioni sulla sicurezza utilizzate in questo documento Esempi IMPORTANTE! Creare un foglio elettronico separato per ogni piastra a 96-pozzetti. PERICOLO CHIMICO. TaqMan Universal PCR Master Mix può provocare irritazione degli occhi e della pelle. L'esposizione può provocare problemi in caso di ingestione o inalazione. Leggere la scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) e attenersi rigorosamente alle istruzioni relative alla manipolazione di questa sostanza. Indossare un'adeguata protezione oculare, indumenti e guanti di protezione. PERICOLO DI INFORTUNIO. Durante il funzionamento dello strumento, il pannello di copertura riscaldato e il blocco campione possono raggiungere temperature che superano anche i 100 C. PERICOLO ELETTRICO. La continuità del circuito di messa a terra è vitale per il funzionamento in sicurezza. Non mettere mai in funzione il sistema con il conduttore di messa a terra scollegato. x

13 Premessa Simboli sugli strumenti Simboli sugli strumenti Simboli elettrici sugli strumenti Sugli strumenti Applied Biosystems potrebbero essere visualizzati i seguenti simboli elettrici. Simbolo Descrizione Simbolo Descrizione Indica che l'interruttore di alimentazione dell'apparecchiatura è in posizione On (Acceso). Indica che l'interruttore di alimentazione dell'apparecchiatura è in posizione Off (Spento). Indica un interruttore di standby mediante il quale lo strumento viene commutato in una condizione di Standby. Se questo interruttore si trova in standby, potrebbe svilupparsi una tensione pericolosa. Indica le posizioni On/Off (Acceso/Spento) dell'interruttore di alimentazione a pulsante dell'apparecchiatura. Indica che un terminale può essere collegato alla messa a terra di un altro strumento. Non si tratta di un terminale di terra protetto. Indica un terminale di terra protetto che va collegato a terra prima di eseguire qualsiasi altro collegamento elettrico all'apparecchiatura. Indica un terminale che può ricevere o erogare corrente o tensione alternata. Indica un terminale che può ricevere o erogare corrente o tensione continua. Simboli di sicurezza Sugli strumenti Applied Biosystems potrebbero essere visualizzati i seguenti simboli elettrici. Ogni simbolo potrebbe apparire da solo o con un testo che spieghi il pericolo rilevante (vedere Etichette di sicurezza sugli strumenti a pagina xii). Questi simboli di sicurezza potrebbero inoltre apparire vicino alle indicazioni di PERICOLO, AVVERTENZA e ATTENZIONE riscontrabili in questo e in altri documenti. Simbolo Descrizione Simbolo Descrizione Rimanda alla consultazione del manuale per ottenere ulteriori informazioni e chiede all'utente di procedere con la giusta cautela. Indica la presenza pericolosa di superfici calde o di altre condizioni di alta-temperatura e chiede all'utente di procedere con la giusta cautela. Indica la presenza di parti in movimento e chiede all'utente di procedere con la giusta cautela. Indica la presenza di pericolo di folgorazione e chiede all'utente di procedere con la giusta cautela. Indica la presenza di un laser all'interno dello strumento e chiede all'utente di procedere con la giusta cautela. xi

14 Premessa Etichette di sicurezza sugli strumenti Simboli ambientali sugli strumenti I seguenti simboli sono applicabili a tutti i prodotti elettrici ed elettronici Applied Biosystems presenti sul mercato europeo dopo il 13 agosto Simbolo Descrizione Non eseguire lo smaltimento di questo prodotto come rifiuto urbano indifferenziato. Seguire le ordinanze locali per i rifiuti urbani per uno smaltimento corretto, allo scopo di ridurre l'impatto ambientale delle apparecchiature elettriche ed elettroniche fuori uso (WEEE). Clienti dell'unione europea: Contattare l'ufficio di Assistenza Clienti Applied Biosystems locale per la raccolta e il riciclo dell'apparecchiatura. Consultare il sito web per un elenco degli uffici di Assistenza Clienti presenti nell'unione europea. Etichette di sicurezza sugli strumenti Le seguenti dichiarazioni di ATTENZIONE, AVVERTENZA e PERICOLO potrebbero essere visualizzabili sugli strumenti Applied Biosystems in combinazione con i simboli di sicurezza descritti nella sessione precedente. Inglese CAUTION Hazardous chemicals. Read the Material Safety Data Sheets (MSDSs) before handling. CAUTION Hazardous waste. Refer to MSDS(s) and local regulations for handling and disposal. CAUTION Hot surface. DANGER High voltage. WARNING To reduce the chance of electrical shock, do not remove covers that require tool access. No user-serviceable parts are inside. Refer servicing to Applied Biosystems qualified service personnel. CAUTION Moving parts. DANGER Class 3B (III) visible and/or invisible LED radiation present when open and interlocks defeated. Avoid exposure to beam. Francese ATTENTION Produits chimiques dangeureux. Lire les fiches techniques de sûreté de matériels avant la manipulation des produits. ATTENTION Déchets dangereux. Lire les fiches techniques de sûreté de matériels et la régulation locale associées à la manipulation et l'élimination des déchets. ATTENTION Surface brûlante. DANGER Haute tension. AVERTISSEMENT Pour éviter les risques d'électrocution, ne pas retirer les capots dont l'ouverture nécessite l'utilisation d'outils. L instrument ne contient aucune pièce réparable par l utilisateur. Toute intervention doit être effectuée par le personnel de service qualifié de Applied Biosystems. ATTENTION Parties mobiles. DANGER Rayonnement visible ou invisible d un faisceau LED de Classe 3B, (III) en cas d ouverture et de neutralisation des dispositifs de sécurité. Evitez toute exposition au faisceau. Posizione delle avvertenze Il sistema StepOne presenta un'avvertenza nella posizione indicata qui di seguito: xii

15 Premessa Sicurezza generale dello strumento Sicurezza generale dello strumento PERICOLO DI INFORTUNIO. Utilizzando lo strumento in un modo non specificato da Applied Biosystems potrebbero verificarsi lesioni personali o danni allo strumento. Spostamento e sollevamento dello strumento PERICOLO DI INFORTUNIO. Lo strumento deve essere spostato e posizionato esclusivamente dal personale o del venditore specificato nella guida applicabile di preparazione della sede. In caso di sollevamento o di spostamento dello strumento dopo lo sua avvenuta installazione, non tentare di sollevare o di spostare lo strumento senza l'assistenza di terzi, l'uso di una idonea apparecchiatura per lo spostamento e tecniche corrette di sollevamento. Il sollevamento senza le opportune precauzioni può provocare traumi dorsali dolorosi e permanenti. A seconda del peso, lo spostamento o il sollevamento di uno strumento può richiedere la presenza di due o più persone. Spostamento e sollevamento del Computer e del Monitor Non tentare di sollevare o di spostare il computer o il monitor senza l'assistenza di terzi. A seconda del peso del computer e/o del monitor, il loro spostamento può richiedere la presenza di due o più persone. Considerazioni prima del sollevamento del computer e/o del monitor: Accertarsi di avere una presa comoda e sicura sul computer o sul monitor durante il sollevamento. Accertarsi che il percorso di spostamento dal punto di partenza al punto di arrivo sia libero da eventuali ostacoli. Non sollevare un oggetto e contemporaneamente ruotare il busto. Mantenere la colonna vertebrale in una corretta posizione neutra mentre si esegue il sollevamento con le gambe. xiii

16 Premessa Sicurezza dalle sostanze chimiche I partecipanti devono coordinare le proprie azioni di sollevamento e spostamento prima di cominciare il trasporto. Invece di sollevare l'oggetto dalla confezione, ribaltare con attenzione la scatola su un lato e reggerla mentre qualcun altro fa scivolare il contenuto al di fuori di essa. Messa in funzione dello strumento Pulizia o decontaminazione dello strumento Accertarsi che chiunque utilizzi lo strumento abbia: Ricevuto tutte le istruzioni sulle pratiche di sicurezza generali per i laboratori e su quelle specifiche per lo strumento. Letto con attenzione tutte le informazioni contenute in tutte le MSDS pertinenti. Vedere Schede di sicurezza dei materiali a pagina xv. Prima di utilizzare un metodo di pulizia o di decontaminazione diverso da quelli raccomandati dalla ditta produttrice, verificare con la ditta stessa che il metodo proposto non danneggerà l'apparecchiatura. Sicurezza dalle sostanze chimiche Avvertenze relative alle sostanze chimiche pericolose PERICOLO CHIMICO. Prima di manipolare eventuali sostanze chimiche, fare riferimento alle MSDS fornite dalla ditta produttrice e osservare tutte le relative precauzioni. PERICOLO STOCCAGGIO CHIMICO. Non raccogliere o riporre mai i rifiuti chimici in contenitori di vetro, che potrebbero incrinarsi o frantumarsi. I flaconi dei reagenti e delle sostanze chimiche di rifiuto possono essere soggetti a incrinature e a perdite. Tutti i flaconi contenenti sostanze di rifiuto vanno posti in contenitori di sicurezza in polietilene a bassa densità, con il coperchio ben chiuso e le maniglie bloccate in posizione verticale. Durante la manipolazione dei flaconi dei reagenti e delle sostanze chimiche di rifiuto, indossare occhiali di protezione, guanti e indumenti protettivi. Linee guida di sicurezza chimica Per ridurre al minimo i pericoli relativi alle sostanze chimiche: Leggere con attenzione le informazioni contenute nelle MSDS fornite dalla ditta produttrice delle sostanze chimiche o dei materiali pericolosi, prima di riporli in magazzino, manipolarli o utilizzarli. (Vedere la sezione Schede di sicurezza dei materiali a pagina xv). Ridurre al minimo il contatto con le sostanze chimiche. Durante la manipolazione dei rifiuti chimici, indossare gli opportuni corredi di protezione personale (ad esempio occhiali di protezione, guanti o indumenti protettivi). Per ulteriori linee guida relative alla sicurezza, consultare le MSDS. Ridurre al minimo l'inalazione delle sostanze chimiche. Non lasciare aperti i contenitori delle sostanze chimiche e utilizzare tali sostanze solo in ambienti adeguatamente ventilati (ad esempio, cappa di aspirazione). Per ulteriori linee guida relative alla sicurezza, consultare le MSDS. xiv

17 Premessa Sicurezza dalle sostanze chimiche Verificare regolarmente l'eventuale presenza di perdite o versamenti. In caso di perdite o versamenti, attenersi alle procedure per la pulizia delineate dalla ditta produttrice della sostanza chimica in questione nella MSDS ad essa corrispondente. Rispettare tutte le leggi e le norme locali, regionali/provinciali e statali relative alla conservazione, alla manipolazione e allo smaltimento delle sostanze chimiche. Schede di sicurezza dei materiali Le ditte produttrici di sostanze chimiche forniscono le schede MSDS nelle spedizioni di sostanze chimiche pericolose ai nuovi clienti. Forniscono inoltre le MSDS al cliente alla prima spedizione di una sostanza chimica pericolosa di cui è stato sviluppato un aggiornamento delle MSDS. Le MSDS forniscono all'utente le informazioni di sicurezza necessarie per la conservazione, la manipolazione, il trasporto e lo smaltimento sicuri delle sostanze chimiche. Qualora, alla consegna di un lotto di sostanze chimiche pericolose si riceva una scheda MSDS aggiornata, accertarsi di sostituirla a quella in archivio. Come ottenere le schede MSDS Le MSDS per ogni sostanza chimica fornita da Applied Biosystems sono disponibili gratuitamente 24 ore al giorno. Per ottenere le MSDS: 1. Visitare il sito web https://docs.appliedbiosystems.com/msdssearch.html 2. Nel campo Search (Ricerca) della pagina MSDS Search (Ricerca MSDS): a. Digitare il nome, il numero di catalogo o altre informazioni relativi alla sostanza chimica che si pensa sia presente nel MSDS di interesse. b. Selezionare la lingua desiderata. c. Fare clic su Search (Ricerca). 3. Per visualizzare, scaricare o stampare il documento di interesse: a. Fare clic con il pulsante destro sul titolo del documento. b. Selezionare: Open (Apri) Per visualizzare il documento Save Target As (Salva oggetto con nome) Per scaricare una versione PDF del documento in una destinazione da scegliere Print Target (Stampa destinazione) Per stampare il documento 4. Per ottenere la copia di un MSDS inviata via fax o via , nella pagina Search Results (Risultati ricerca): a. Selezionare Fax o sotto al titolo del documento. b. Fare clic su RETRIEVE DOCUMENTS (RECUPERA DOCUMENTI) al termine dell'elenco dei documenti. c. Immettere le informazioni richieste. xv

18 Premessa Sicurezza dei rifiuti chimici d. Fare clic su View/Deliver Selected Documents Now (Visualizza/Consegna i documenti selezionati adesso). Nota: Per la MSDS di una sostanza chimica non distribuita da Applied Biosystems, contattare la ditte produttrice della sostanza. Sicurezza dei rifiuti chimici Pericolo rifiuti chimici RIFIUTI PERICOLOSI. Fare riferimento alle MSDS e ai regolamenti locali per la manipolazione e lo smaltimento. PERICOLO RIFIUTI CHIMICI. I rifiuti generati dagli strumenti Applied Biosystems sono potenzialmente pericolosi e possono provocare lesioni, malattie o morte. PERICOLO STOCCAGGIO CHIMICO. Non raccogliere o riporre mai i rifiuti chimici in contenitori di vetro, che potrebbero incrinarsi o frantumarsi. I flaconi dei reagenti e delle sostanze chimiche di rifiuto possono essere soggetti a incrinature e a perdite. Tutti i flaconi contenenti sostanze di rifiuto vanno posti in contenitori di sicurezza in polietilene a bassa densità, con il coperchio ben chiuso e le maniglie bloccate in posizione verticale. Durante la manipolazione dei flaconi dei reagenti e delle sostanze chimiche di rifiuto, indossare occhiali di protezione, guanti e indumenti protettivi. Linee guida di sicurezza per i rifiuti chimici Per ridurre al minimo i pericoli relativi ai rifiuti chimici: Prima di riporre in magazzino, manipolare o smaltire rifiuti chimici, leggere con attenzione le informazioni contenute nelle MSDS fornite dalle ditte produttrici delle sostanze chimiche presenti nel contenitore dei rifiuti. Procurare contenitori per rifiuti primari e secondari. (Un contenitore per rifiuti primario trattiene i rifiuti nell'immediato. Un contenitore secondario trattiene le eventuali perdite o versamenti provenienti dal contenitore primario. Ambedue i contenitori devono essere compatibili con i materiali di rifiuto e rispondere ai requisiti federali, regionali e locali per la conservazione in contenitori). Ridurre al minimo il contatto con le sostanze chimiche. Durante la manipolazione dei rifiuti chimici, indossare gli opportuni corredi di protezione personale (ad esempio occhiali di protezione, guanti o indumenti protettivi). Per ulteriori linee guida relative alla sicurezza, consultare le MSDS. Ridurre al minimo l'inalazione delle sostanze chimiche. Non lasciare aperti i contenitori delle sostanze chimiche e utilizzare tali sostanze solo in ambienti adeguatamente ventilati (ad esempio, cappa di aspirazione). Per ulteriori linee guida relative alla sicurezza, consultare le MSDS. Manipolare i rifiuti chimici all'interno di una cappa di aspirazione. Dopo avere svuotato un contenitore dei rifiuti, chiuderlo ermeticamente con il tappo in dotazione. xvi

19 Premessa Sicurezza elettrica Smaltire il contenuto della vaschetta e del flacone dei rifiuti in osservanza delle prassi di sicurezza di laboratorio e delle norme locali, regionali/provinciali e statali relative alla tutela dell'ambiente e della salute. Smaltimento dei rifiuti Nel caso durante il funzionamento dello strumento si sviluppino rifiuti potenzialmente pericolosi, è necessario: Caratterizzare (se necessario, anche tramite analisi) i rifiuti generati dalle applicazioni, dai reagenti e dai substrati utilizzati nel laboratorio. Tutelare la salute e la sicurezza di tutto il personale di laboratorio. Verificare che i rifiuti generati dallo strumento vengano conservati, trasferiti, trasportati e smaltiti in conformità a tutte le norme locali, regionali/provinciali e/o statali vigenti. IMPORTANTE! I materiali radioattivi o a rischio biologico possono richiedere speciali tecniche di manipolazione ed essere soggetti a limitazioni relative allo smaltimento. Sicurezza elettrica PERICOLO DI FOLGORAZIONE. Sono possibili gravi folgorazioni qualora si utilizzi il sistema StepOne senza i propri pannelli di copertura in posizione. Non rimuovere i pannelli di copertura dello strumento. Quando i pannelli dello strumento sono rimossi, vengono esposti contatti ad alta tensione. Fusibili PERICOLO DI INCENDIO. L'uso di fusibili non idonei o di un'alimentazione ad alta tensione non corretta può danneggiare il sistema di cablaggio dello strumento, provocando un incendio. Prima di accendere lo strumento, verificare che i fusibili siano installati correttamente e che la tensione dello strumento corrisponda all'alimentazione presente in laboratorio. PERICOLO DI INCENDIO. Per una protezione continua contro il rischio di incendio, sostituire i fusibili esclusivamente con fusibili del tipo e dell'amperaggio specifici per lo strumento. xvii

20 Premessa Sicurezza LED Alimentazione PERICOLO ELETTRICO. La continuità del circuito di messa a terra è vitale per il funzionamento in sicurezza dell'apparecchiatura. Non mettere mai in funzione l'apparecchiatura con il conduttore di messa a terra scollegato. PERICOLO ELETTRICO. Utilizzare cavi di alimentazione configurati in maniera corretta e approvati per la tensione fornita nella propria struttura. PERICOLO ELETTRICO. Collegare il sistema in una presa elettrica dotata di messa a terra con capacità di corrente adeguata. Classificazione sovraccarico di tensione Il sistema sistema StepOne fa parte della categoria di installazione (sovraccarico di tensione) II ed è classificato come apparecchiatura portatile Sicurezza LED Per garantire un funzionamento sicuro del LED: La manutenzione del sistema deve essere gestita da un Rappresentante tecnico Applied Biosystem. Tutti i pannelli di copertura dello strumento devono trovarsi in posizione durante il funzionamento. Quando tutti i pannelli sono installati, non sono presenti radiazioni rilevabili. In caso di rimozione di un pannello durante il funzionamento del LED (durante l'assistenza a interblocchi di sicurezza disabilitati), si potrebbe venire esposti ad emissioni LED che superano la Classe 3B. Non rimuovere le etichette di sicurezza né disabilitare gli interblocchi di sicurezza. xviii

21 Premessa Sicurezza rischio biologico Sicurezza rischio biologico Rischi biologici generici RISCHIO BIOLOGICO. Campioni biologici quali tessuti, fluidi corporei, agenti infettivi e sangue umano e di altri animali rappresentano un veicolo potenziale di trasmissione di malattie infettive. Rispettare tutte le norme locali, regionali/provinciali e/o statali. Indossare gli opportuni corredi di protezione, tra cui protezioni oculari, maschere di protezione, indumenti/camici da laboratorio e guanti. Condurre ogni lavoro in strutture ben equipaggiate, utilizzando la corretta apparecchiatura di sicurezza (ad esempio, dispositivi di contenimento fisico). Addestrare il personale in base alle normative applicabili e ai requisiti dell'azienda/ente prima di lavorare con materiali potenzialmente infettivi. Leggere e seguire le linee guida applicabili e/o i requisiti delle normative presenti in: Linee guida del U.S. Department of Health and Human Services pubblicate in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (N. stock ; Occupational Safety and Health Standards, Bloodborne Pathogens (29 CFR ; nara/cfr/waisidx_01/ 29cfr1910a_01.html). Protocolli del Programma di biosicurezza della propria azienda/ente per il lavoro a contatto con materiali potenzialmente infetti. Ulteriori informazioni sulle linee guida per il rischio biologico sono disponibili all'indirizzo: Sicurezza della stazione di lavoro Una configurazione ergonomicamente corretta della propria stazione di lavoro può ridurre o prevenire effetti quali l'affaticamento, il dolore e la tensione. Ridurre al minimo o eliminare tali effetti configurando la stazione di lavoro in maniera tale da favorire posizioni di lavoro neutre o rilassate. PERICOLO MUSCOLOSCHELETRICO E DA MOVIMENTI RIPETITIVI. Questi pericoli sono causati da potenziali fattori di rischio che includono, in modo non esclusivo, il movimento ripetitivo, una posizione scorretta, sforzi accentuati, il mantenimento di posizioni statiche non salutari, la pressione da contatto e altri fattori ambientali correlati alla stazione di lavoro. Per ridurre al minimo i rischi muscoloscheletrici e i movimenti ripetitivi: Utilizzare apparecchiature che sopportino in maniera comoda la posizione di lavoro neutra dell'utente e consentano un adeguato accesso a tastiera, monitor e mouse. Posizionare tastiera, mouse e monitor in una posizione tale da promuovere posture rilassate del busto e della testa. xix

22 Premessa Norme di sicurezza e di compatibilità elettromagnetica (EMC) Norme di sicurezza e di compatibilità elettromagnetica (EMC) Norme di sicurezza per U.S.A. e Canada Norme EMC per il Canada Norme di Safety e di EMC per l'europa Il sistema StepOne è stato testato ed è conforme a: UL 61010A-1/CAN/CSA C22.2 No , Safety Requirements for Electrical Equipment for Measurement, Control, and Laboratory Use, Part 1: General Requirements. UL 61010A-2-010/CAN/CSA , Particular Requirements for Laboratory Equipment for the Heating of Materials. FDA Radiation Control for Health and Safety Act of 1968 Performance Standard 21 CFR and , se applicabile. Lo strumento è stato testato ed è conforme alla norma ICES-001, Comma 3: Industrial, Scientific, and Medical Radio Frequency Generators.: Sicurezza Questo strumento soddisfa i requisiti europei per la sicurezza (Direttiva sulla bassa tensione 73/23/CEE). Questo strumento è stato testato ed è conforme alla norma EN :2001, Safety Requirements for Electrical Equipment for Measurement, Control, and Laboratory Use, Part 1: General Requirements. EN , Particular Requirements for Laboratory Equipment for the Heating of Materials. EN , Particular Requirements for Automatic and Semi-Automatic Laboratory Equipment for Analysis and Other Purposes. EMC Questo strumento soddisfa i requisiti europei per le emissioni e le immunità (Direttiva EMC 89/336/CEE). Questo strumento è stato testato ed è conforme alla norma EN (Gruppo 1, Classe B), Electrical Equipment for Measurement, Control and Laboratory Use EMC Requirements. Norme EMC per l'australia Questo strumento è stato testato ed è conforme alla norma AS/NZS 2064, Limits and Methods Measurement of Electromagnetic Disturbance Characteristics of Industrial, Scientific, and Medical (ISM) Radio-frequency Equipment. xx

23 Capitolo 1 Introduzione Questo capitolo comprende i paragrafi: Informazioni sul sistema StepOne Informazioni sugli esperimenti di Come utilizzare questa guida Informazioni sull'esperimento di esempio Flusso di lavoro dell'esperimento di esempio Nota: Per ulteriori informazioni sugli argomenti trattati in questa guida, accedere alla voce Help (Guida) del software del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System premendo F1 oppure facendo clic su nella barra degli strumenti oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 1

24 Capitolo 1 Introduzione Informazioni sul sistema StepOne Informazioni sul sistema StepOne Informazioni sul sistema Informazioni sull'acquisizione dei dati Il sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System (sistema StepOne ) utilizza chimiche PCR fluorescenti PCR per fornire: Rilevamento quantitativo delle sequenze target dell'acido nucleico utilizzando l'analisi PCR in tempo reale. Rilevamento qualitativo delle sequenze target dell'acido nucleico utilizzando analisi end-point e con curva di melting. Il sistema StepOne acquisisce dati di fluorescenza non elaborati in punti diversi durante una PCR, in dipendenza del tipo di esecuzione: Tipo di esecuzione Punto di acquisizione dati Sessioni di analisi in tempo reale Sessioni di analisi end-point Curva standard Curva standard relativa C T comparativo ( C T ) Genotipizzazione Presenza/assenza Lo strumento acquisisce dati dopo ogni fase di estensione della PCR. Lo strumento acquisisce dati prima e dopo la PCR. Per gli esperimenti di, il software StepOne è abilitato anche ad acquisire dati durante la sessione di analisi (in tempo reale), come aiuto nella risoluzione di eventuali problemi. Lo strumento acquisisce dati prima e dopo la PCR. Indipendentemente dal tipo di esecuzione, un punto di acquisizione dati o di lettura consiste in tre fasi: 1. Eccitazione Lo Strumento StepOne illumina tutti i pozzetti della piastra di reazione all'interno dello strumento, eccitando i fluorofori in ogni reazione. 2. Emissione L'ottica dello Strumento StepOne focalizza la fluorescenza residua emessa dai pozzetti della piastra di reazione. L'immagine risultante acquisita dal dispositivo consiste unicamente nella luce che corrisponde al range ridotto delle lunghezze d'onda. 3. Acquisizione Lo Strumento StepOne assembla una rappresentazione digitale della fluorescenza residua acquisita durante un intervallo dalla durata fissa. Il software StepOne memorizza l'immagine fluorescente non elaborata per l'analisi. Se necessario, il software esegue letture aggiuntive come richiesto dai reagenti fluorescenti utilizzati nell'esperimento. Dopo una sessione di analisi, il software StepOne utilizza i dati di calibrazione (spaziale, del colorante e di background) per determinare la posizione e l'intensità dei segnali fluorescenti in ogni lettura, il colorante associato a ogni segnale fluorescente e il significato del segnale. 2

25 Capitolo 1 Introduzione Informazioni sul sistema StepOne Saggi e materiali di consumo supportati Il sistema StepOne supporta gli esperimenti di utilizando reagenti e protocolli standard sia con piatre MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plates, MicroAmp Fast 8-Tube Strips, sia con provette MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps with MicroAmp Fast 48-Well Trays. IMPORTANTE! Utilizzare solo materiali di consumo fast (piastre di reazione, strisce con provette e provette) con il sistema StepOne, anche quando viene eseguito un esperimento con reagenti standard. Sebbene i saggi di SNP TaqMan non utilizzino Master Mix fast o protocolli veloci, è necessario utilizzare materiali di consumo fast per eseguire gli esperimenti di. G (o D) B C D # Materiale di consumo A B C D E F G MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plates MicroAmp Fast 48-Well Tray MicroAmp 96-well Splash-free Support Base MicroAmp Optical 8-Cap Strips MicroAmp Fast 8-Tube Strips MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film E B C F B C 3

26 Capitolo 1 Introduzione Informazioni sugli esperimenti di Informazioni sugli esperimenti di Esperimenti end-point Gli esperimenti di consistono in esperimenti end-point. Negli esperimenti end-point: I dati vengono acquisiti al termine del processo PCR. Le reazioni sono caratterizzate dalla quantità del target accumulata al termine della PCR (Saiki et al., 1985). Il datapoint rappresenta l'intensità normalizzata del colorante reporter oppure dell'r n. È possibile che alcuni esperimenti end-point includano datapoint pre-pcr. In caso affermativo, il sistema calcola il valore del delta R n ( R n ) attraverso la formula seguente: R n (post-pcr) R n (pre-pcr) = R n Nota: In questa guida, il termine esperimento si riferisce all'intero sviluppo dell'esperimento, dal disegno dell'esperimento all'analisi dei dati. Dati PCR in tempo reale per esperimenti end-point Il software StepOne fornisce l'opzione dell'acquisizione dei dati in tempo reale sia per gli esperimenti di presenza/assenza sia per quelli di. Nel caso un esperimento non riesca, i dati in tempo reale forniscono un aiuto importante nella determinazione delle cause. Informazioni sui saggi di SNP TaqMan Un saggio di rileva varianti di una sequenza singola di acido nucleico, senza quantificazione del target. La presenza di due sonde in ogni reazione consente la delle due possibili varianti all'area del polimorfismo singolo-nucleico (SNP) in una sequenza target. Ogni saggio di SNP TaqMan consiste in una provetta singola e pronta per l'utilizzo contenente: Due primer specifici per la sequenza per l'amplificazione del polimorfismo di interesse Due sonde MGB specifiche per l'allele TaqMan per il rilevamento degli alleli per il polimorfismo specifico di interesse 4

27 Capitolo 1 Introduzione Informazioni sugli esperimenti di Informazioni sulle sonde MGB TaqMan Ogni sonda MGB specifica per l'allele TaqMan presenta: Un colorante reporter alla sua estremità 5 Il colorante VIC è legato alla estremità 5 della sonda dell'allele 1 Il colorante FAM è legato alla estremità 5 della sonda dell'allele 2 La sonda etichettata con colorante VIC dell'allele 1 corrisponde al primo nucleotide interno alle parentesi quadre della sequenza di contesto nel file informazioni saggi (AIF) spedito con ogni ordine. La sonda etichettata con colorante FAM dell'allele 2 corrisponde al secondo nucleotide interno alle parentesi quadre della sequenza di contesto nel file informazioni saggi (AIF) spedito con ogni ordine. Per la sequenza di contesto ATCGATT[G/T]ATCC, la sonda etichettata con colorante VIC si legherà all'allele contenente G e la sonda etichettata con colorante FAM si legherà all'allele contenente T. Un minor groove binder (MGB), che aumenta la temperatura di melting (T m ) per una data lunghezza della sonda, consente il disegno di sonde più corte (Alfonina et al., 1997, Kutyavin et al., 1997). L'utilizzo di sonde più corte produce come risultato una maggiore differenza nei valori della T m tra le sonde abbinate non abbinate e una più robusta. Un quencher non fluorescente (NFQ) alla sua estremità 3, consentendo per il rilevamento della fluorescenza del colorante reporter una sensibilità maggiore rispetto a un quencher fluorescente. IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del colorante TAMRA come reporter o quencher con il sistema StepOne. 5 Saggio nucleasico La figura qui di seguito rappresenta una descrizione schematica del saggio nucleasico 5. Durante la PCR: Ogni sonda MGB TaqMan esegue un annealing specificamente alla sua sequenza complementare tra le regioni del forward primer e del reverse primer. Quando la sonda oligonucleotide è intatta, la vicinanza del colorante quencher al colorante reporter impedisce l'emissione del segnale del reporter. La polimerasi del DNA AmpliTaq Gold estende i primer legati al templato del DNA genomico. La polimerasi del DNA AmpliTaq Gold ( 5 nucleasica) separa le sonde che vengono ibridate alla sequenza del target. La scissione delle sonde ibridate alla sequenza del target separa il colorante quencher dal colorante reporter, con aumento della fluorescenza del reporter. Il segnale di fluorescenza generato dall'amplificazione PCR indica quali alleli siano presenti nel campione. 5

28 Capitolo 1 Introduzione Informazioni sugli esperimenti di Riduzione al minimo della fluorescenza non specifica Lettura e analisi delle piastre Nei saggi TaqMan, la fluorescenza delle sonde legate non specificamente viene ridotta, poiché i mancati abbinamenti dei nucleotidi tra una sonda e una sequenza riducono le possibilità di scissione della sonda. La lunghezza ridotta della sonda comporta il mancato abbinamento di una coppia di basi con un effetto negativo maggiore sul binding. La sonda non abbinata non si lega strettamente all'allele, consentendo alla polimerasi del DNA AmpliTaq Gold di spostare la sonda senza separare il colorante. Il software StepOne esegue la dei campioni di DNA simultaneamente dalla piastra di reazione. Primo, il software normalizza la fluorescenza dei coloranti reporter alla fluorescenza del colorante di riferimento passivo in ogni pozzetto. Quindi, il software visualizza le intensità normalizzate (R n ) dei coloranti reporter in ogni pozzetto del campione su un plot di discriminazione allelica, il che contrasta le intensità dei coloranti reporter delle sonde specifiche per l'allele. Infine, il software StepOne raggruppa in modo algoritmico i dati dei campioni e assegna una richiesta di genotipi ai campioni di ogni cluster in base alla loro posizione nel plot. Nota: L'algoritmo di clustering software StepOne non richiede genotipi quando in un esperimento è presente unicamente un genotipo. 6

29 Capitolo 1 Introduzione Informazioni sugli esperimenti di Il clustering dei datapoint può variare lungo l'asse orizzontale (allele 1), l'asse verticale (allele 2) oppure diagonale (allele 1/allele 2). Questa variazione produce come risultato differenze nel grado di intensità fluorescente del colorante reporter dopo l'amplificazione PCR. La tabella qui di seguito indica la correlazione tra le sequenze e i segnali di fluorescenza in un campione. Un aumento sostanziale di Indica Fluorescenza unicamente della sonda etichettata con Omozigosità per l'allele 1 colorante VIC Fluorescenza unicamente della sonda etichettata con Omozigosità per l'allele 2 colorante FAM Fluorescenza sia delle sonde etichettate con colorante Eterozigosità dell'allele 1 / allele 1 VIC sia con colorante FAM 7

30 Capitolo 1 Introduzione Come utilizzare questa guida Come utilizzare questa guida Utilizzo della guida come tutorial Utilizzando i dati dell'esperimento di esempio forniti con il software StepOne, è possibile utilizzare questa guida come tutorial per l'esecuzione di un esperimento di sul sistema StepOne Seguire le procedure indicate nei capitoli da 2 a 5: Capitolo 2 - Disegno dell'esperimento utilizzando il design wizard nel software. Capitolo 3 - Preparazione dell'esperimento, utilizzando i reagenti e i volumi calcolati dal design wizard nel Capitolo 2. Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento su uno Strumento StepOne. Capitolo 5 - Analisi dei risultati. Per ulteriori informazioni, vedere Informazioni sull'esperimento di esempio a pagina 10. Utilizzando i dati dell'esperimento di esempio forniti con il software StepOne, è possibile utilizzare questa guida come tutorial per l'esecuzione di un esperimento di sul sistema StepOne Seguire le procedure contenute nei capitoli appropriati: Capitolo Procedura 2 Disegnare l'esperimento utilizzando il Design Wizard nel software StepOne. 3 Preparare l'esperimento, utilizzando i reagenti e i volumi calcolati dal Design Wizard nel Capitolo 2. 4 Eseguire l'esperimento su uno Strumento StepOne. 5 Analizzare i risultati. Per ulteriori informazioni, vedere Informazioni sull'esperimento di esempio a pagina 10. 8

31 Capitolo 1 Introduzione Come utilizzare questa guida Utilizzo della guida per i propri esperimenti Dopo il completamento degli esercizi introduttivi nei capitoli da 2 a 5, è possibile utilizzare questo manuale come guida al flusso di lavoro del design wizard per i propri esperimenti di. Ogni procedura nei capitoli da 2 a 5 contiene un set di linee guida che fornisce informazioni sulle modalità di esecuzione dell'azione per i propri esperimenti. È anche possibile utilizzare uno degli altri flussi di lavoro forniti nel software StepOne per l'esecuzione degli esperimenti. La tabella qui di seguito fornisce un riepilogo di tutti i flussi di lavoro disponibili nel software StepOne. Flusso di lavoro Design Wizard Impostazione avanzata Avvio rapido Templato Esportazione/ Importazione Descrizione Immette i parametri dell'esperimento secondo le indicazioni del wizard. Imposta un nuovo esperimento sulla base del disegno del proprio esperimento. Consente flessibilità nel disegno per utenti esperti. Esegue un nuovo esperimento senza informazioni di impostazione della piastra. Imposta un nuovo esperimento utilizzando le informazioni di impostazione provenienti da un templato. Importa disegni di esperimento dai file di testo ASCII contenenti le informazioni di impostazione dell'esperimento. Vedere... Capitolo 2 pagina 98 pagina 103 pagina 108 pagina 109 9

32 Capitolo 1 Introduzione Informazioni sull'esperimento di esempio Informazioni sull'esperimento di esempio Per illustrare come eseguire gli esperimenti di, questa guida conduce l'utente attraverso i processi di disegno e analisi di un esperimento di esempio. L'esperimento di esempio rappresenta una tipica impostazione che è possibile utilizzare per familiarizzare rapidamente con il sistema StepOne. Descrizione Layout piastra di reazione L'obbiettivo dell'esperimento di di esempio è quello di indagare sull'snp rs8039, dove possibili genotipi sono AA, AC e CC. Nell'esempio, 20 campioni non noti di DNA genomico (gdna) sono stati sottoposti a utilizzando il saggio TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay con ID C _30. Le reazioni sono state impostate in modo tale che le sonde e i primer PCR, il target e entrambi gli alleli dell'snp rs8039 siano presenti nello stesso pozzetto. La PCR è stata eseguita utilizzando la Master Mix TaqMan Universal PCR e secondo il protocollo descritto nella scheda di riferimento rapido Performing a TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick Reference Card (n. di cat A). Il layout della piastra di reazione per l'esperimento di esempio è indicato qui di seguito. Informazioni sui dai dell'esempio L'esperimento di esempio descritto in questa guida è incluso nel software StepOne. È possibile trovare il file per l'esperimento (Genotyping Example.eds) sul proprio computer: <unità>:\applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples dove <unità> indica il disco rigido del computer sul quale è stato installato il software StepOne. L'unità predefinita di installazione è l'unità C. 10

33 Capitolo 1 Introduzione Flusso di lavoro dell'esperimento di esempio Flusso di lavoro dell'esperimento di esempio Informazioni sul flusso di lavoro dell'esperimento La figura seguente indica il flusso di lavoro dell'esperimento di esempio di. Avvio dell'esperimento Disegno dell'esperimento (Capitolo 2) 1. Creazione di un nuovo esperimento. 2. Definizione delle proprietà dell'esperimento. 3. Definizione dei metodi e dei materiali. 4. Impostazione dei saggi SNP. 5. Impostazione dei campioni e dei replicati. 6. Impostazione del metodo di esecuzione. 7. Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione. 8. Ordine dei materiali per l'esperimento. 9. Fine del flusso di lavoro del Design Wizard. Preparazione delle reazioni (Capitolo 3) 1. Preparazione delle diluizioni del campione. 2. Preparazione della miscela di reazione. 3. Preparazione della piastra di reazione. Esecuzione dell'esperimento (Capitolo 4) 1. Preparazione per l'esecuzione. 2. (Opzionale) Abilitazione delle notifiche. 3. Avvio dell'esecuzione. 4. Monitoraggio dell'esecuzione. 5. Scaricamento della piastra di reazione e trasferimento dei dati. Analisi dell'esperimento (Capitolo 5) 1. Visualizzazione del plot di discriminazione allelica. 2. Visualizzazione del layout di piastra. 3. Visualizzazione della tabella well (pozzetto). 4. Visualizzazione del riepilogo CQ. 5. Visualizzazione del plot dei dati non elaborati. 6. Visualizzazione del plot multicomponente. 7. Visualizzazione del plot di amplificazione. 8. Visualizzazione delle impostazioni di analisi. 9. Pubblicazione dei dati. Fine dell'esperimento 11

34 Capitolo 1 Introduzione Flusso di lavoro dell'esperimento di esempio 12

35 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Questo capitolo comprende i paragrafi: Descrizione generale Creazione di un nuovo esperimento Definizione delle proprietà dell'esperimento Definizione dei metodi e dei materiali Impostazione dei Saggi SNP Impostazione dei campioni e dei replicati Impostazione del metodo di esecuzione Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione Ordine dei materiali per l'esperimento Termine del flusso di lavoro del Design Wizard Nota: Per ulteriori informazioni sugli argomenti trattati in questa guida, accedere alla voce Help (Guida) nel software del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System premendo F1, facendo clic su nella barra degli strumenti oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 13

36 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Descrizione generale Descrizione generale Questo capitolo spiega come utilizzare il Design Wizard per l'impostazione dell'esperimento di esempio di. Il design wizard conduce l'utente attraverso le migliori scelte relativamente al disegno dell'esperimento. Flusso di lavoro Disegnare l'esperimento utilizzando il flusso di lavoro seguente: Avvio dell'esperimento Disegno dell'esperimento (Capitolo 2) 1. Creazione di un nuovo esperimento. 2. Definizione delle proprietà dell'esperimento. 3. Definizione dei metodi e dei materiali. 4. Impostazione dei saggi SNP. 5. Impostazione dei campioni e dei replicati. 6. Impostazione del metodo di esecuzione. 7. Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione. 8. Ordine dei materiali per l'esperimento. 9. Fine del flusso di lavoro del Design Wizard. Preparazione delle reazioni (Capitolo 3) Esecuzione dell'esperimento (Capitolo 4) Analisi dell'esperimento (Capitolo 5) Fine dell'esperimento Nota: Il flusso di lavoro di cui sopra rappresenta solo uno dei molteplici flussi di lavoro supportati dal software StepOne per l'impostazione degli esperimenti di. Vedere Utilizzo della guida per i propri esperimenti a pagina 9 per ulteriori informazioni. 14

37 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Creazione di un nuovo esperimento Creazione di un nuovo esperimento Avviare il software StepOne, quindi aprire il Design Wizard per creare un nuovo esperimento di. Creazione di un esperimento 1. Fare doppio clic su, oppure selezionare Start (Avvio) All Programs (Tutti i programmi) Applied Biosystems StepOne StepOne v1.0 per avviare il software StepOne. 2. Fare clic su Design Wizard nella schermata Home per aprire il Design Wizard. Nota: Per creare un nuovo esperimento utilizzando l'impostazione avanzata, un templato dell'esperimento oppure l'avvio rapido, vedere Appendice A, Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi, a pagina Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni, accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 15

38 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Definizione delle proprietà dell'esperimento Definizione delle proprietà dell'esperimento Nella schermata Experiment Properties (Proprietà dell'esperimento), immettere le informazioni di identificazione dell'esperimento, quindi selezionare il tipo di esperimento da disegnare. Completamento della schermata 1. Fare clic sul campo Experiment Name (Nome esperimento), quindi immettere Genotyping Example (Esempio ). 2. Fare clic sul campo Barcode (Codice a barre), quindi immettere Example (Esempio). 3. Fare clic sul campo User Name (Nome utente), quindi immettere Example User (Utente esempio). 4. Fare clic sul campo Comments (Commenti), quindi immettere Genotyping Getting Started Guide (Guida introduttiva ). 5. Selezionare Genotyping (Genotipizzazione) per il tipo di esperimento. 6. Fare clic su Next > (Avanti)

39 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Definizione dei metodi e dei materiali Linee guida disegno Per ulteriori informazioni Per disegnare il proprio esperimento: Immettere un nome dell'esperimento che sia descrittivo e facile da ricordare. (Opzionale) Immettere un codice a barre fino a 100 caratteri per identificare la piastra di reazione utilizzata nell'esperimento. (Opzionale) Immettere un nome utente fino a 100 caratteri per l'identificazione del titolare dell'esperimento. Selezionare Genotyping (Genotipizzazione) come tipo di esperimento. Per ulteriori informazioni sul completamento della schermata Experiment Properties (Proprietà dell'esperimento), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). Definizione dei metodi e dei materiali Nella schermata Methods and Materials (Metodi e materiali), definire: Reagenti utilizzati per la dei campioni Stato (umido o secco) del templato del DNA di cui è in atto la Velocità di rampa più adatta alle reazioni PCR Fasi da includere nel metodo Informazioni sul disegno di esempio Completamento della schermata L'esperimento di esempio utilizza reagenti TaqMan e templato di DNA genomico (gdna) nelle reazioni PCR. Poiché le reazioni non contengono reagenti TaqMan veloci, il Sistema StepOne esegue la sessione utilizzando la velocità di rampa standard. Inoltre, poiché il Sistema StepOne esegue il ciclo termico per la PCR, il metodo di esecuzione consiste nelle fasi di lettura pre-pcr, amplificazione e lettura post-pcr. 1. Selezionare TaqMan Reagents (Reagenti TaqMan) per i reagenti. 2. Selezionare Wet DNA (DNA umido) per il tipo di templato. 3. Selezionare Standard (~2 ore per il completamento di un'esecuzione) per la velocità di rampa. 4. Selezionare Pre-PCR Read and Amplification (Lettura e amplificazione pre- PCR) per aggiungere le fasi al metodo di esecuzione. Nota: La lettura post-pcr è necessaria. 5. Selezionare Next > (Avanti). 17

40 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Definizione dei metodi e dei materiali Linee guida disegno Per disegnare il proprio esperimento: Selezionare Other (Altro) se non è in atto l'utilizzo di reagenti TaqMan per amplificare e rilevare le sequenze target nell'esperimento. Nota: La schermata Reaction Setup (Imposta reazione) non è disponibile se viene effettuata la selezione Other (Altro). Nel caso si utilizzi un templato diverso dal DNA genomico (gdna) o dal cdna, selezionare l'opzione (Wet DNA (DNA umido) o Dry DNA (DNA secco)) che descrive lo stato dei campioni. Selezionare la velocità di rampa Standard per l'esecuzione dello strumento. IMPORTANTE! I saggi di SNPTaqMan non supportano i reagenti fast. Di conseguenza, il Design Wizard non supporta la velocità di rampa rapida per gli esperimenti di. Nel caso si desideri utilizzare velocità di rampa rapide, utilizzare il flusso di lavoro impostazione avanzata per impostare l'esperimento. Nel caso ci si accinga ad eseguire l'amplificazione PCR su un termociclatore diverso dal Sistema StepOne, deselezionare l'opzione Amplification (Amplificazione). Nota: La lettura pre-pcr è opzionale, ma raccomandata. Il software StepOne utilizza la lettura pre-pcr per normalizzare i dati post-pcr. 18

41 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Impostazione dei Saggi SNP Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sulla schermata Materials & Methods (Materiali e Metodi), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). Impostazione dei Saggi SNP Nella schermata Set Up SNP Assays (Imposta saggi SNP), immettere il numero dei saggi SNP nell'esperimento, quindi definire le proprietà per ogni saggio SNP. Informazioni sul disegno di esempio Completamento della schermata SNP Assays (Saggi SNP) L'esperimento di esempio valuta i campioni per l'rs8039 SNP. Poiché il saggio è un saggio di del metabolismo di farmaci TaqMan (ID saggio C _30), è possibile importare le informazioni del saggio SNP dal file informazioni del saggio (AIF) spedito con il saggio oppure scaricato dal sito web Applied Biosystems. 1. Per il numero di saggi SNP oggetto di studio, immettere Fare clic su Yes (Sì) (Selezionare SNP Assay (Saggio SNP) dal SNP Assay Manager (Gestore saggio SNP)). 3. Fare clic su Select SNP Assay(s) (Seleziona saggi SNP) dalla libreria. 4. Fare clic su Import AIF (Importa AIF), quindi utilizzare l'import SNP Assays (Importa saggi SNP) dalla finestra di dialogo AIF per importare il saggio SNP dall'aif: a. Andare alla: <unità>:\applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples b. Selezionare Text Files (File di testo) (*.txt) dall'elenco a discesa Files of type(file di tipo). c. Selezionare DME_SNP_ _ txt. d. Fare clic su Import (Importa). 19

42 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Impostazione dei Saggi SNP 4a 4c 4d 5. Nella finestra di dialogo SNP Import Properties (Proprietà importazione SNP), fare clic su OK. 6. Selezionare il saggio SNP C _ Fare clic su Use Selected Marker(s) (Utilizza indicatori selezionati). 8. Selezionare Next > (Avanti). 4b 20

43 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Impostazione dei Saggi SNP Linee guida disegno Per disegnare i propri esperimenti: Applied Biosystems raccomanda di valutare non più di 6 SNP su una piastra di reazione. Nota: Il Design Wizard consente non più di due SNP per piastra. I flussi di lavoro impostazione avanzata o avvio rapido non restringono il numero degli SNP che è possibile valutare. Identificare ogni saggio SNP con un nome e un colore univoci. Qualora i saggi non vengano scelti manualmente, verificare che i coloranti repoter assegnati a ogni allele siano corretti. IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'utilizzo del colorante TAMRA come reporter o quencher con il Sistema StepOne. 21

44 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Impostazione dei campioni e dei replicati Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sulla schermata Targets SNP Assays (Saggi SNP target), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). Impostazione dei campioni e dei replicati Nella schermata Set Up Samples and Replicates (Imposta campioni e replicati), immettere il numero di campioni nell'esperimento, immettere i nomi dei campioni, quindi immettere il numero dei controlli negativi e positivi. Informazioni sul disegno di esempio Completamento della schermata Samples and Replictes (Campioni e replicati) L'esperimento di esempio valuta: 20 campioni non noti 2 controlli negativi 2 controlli positivi (un eterozigote e un omozigote allele 2). 1. Per il numero di saggi, immettere Per il numero dei replicati, immettere Fare clic su All Sample/ SNP Assay Reactions (Tutte le reazioni del campione/saggio SNP). 4. Per il numero dei controlli negativi (pozzetti che non contengono templato), immettere Per il numero dei controlli positivi (pozzetti che contengono campioni di genotipi noti), immettere Per il Controllo positivo 1, selezionare Allele 1/Allele 2 Heterozygous (Eterozigote allele 1/allele 2). 7. Per il Controllo positivo 2, selezionare Allele 2 Homozygous (Omozigote allele 2). 8. Selezionare Next > (Avanti). 22

45 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Impostazione dei campioni e dei replicati Linee guida disegno Per ulteriori informazioni Per disegnare il proprio esperimento: Utilizzare tra 1 e 48 campioni. Assegnare ad ogni campione un nome e un colore univoci. Applied Biosystems raccomanda l'utilizzo di almeno un controllo negativo per ogni saggio SNP. Limitare il numero delle reazioni totali in ogni esperimento a 48 o meno. Qualora il numero delle reazioni totali richieste sia maggiore di 48, ridurre il numero dei saggi SNP, dei campioni, dei replicati oppure dei controlli positivi e negativi oppure suddividere le reazioni tra due o più piastre di reazione. Per ulteriori informazioni sulla schermata Samples & Replicates (Campioni e Replicati), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 23

46 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Impostazione del metodo di esecuzione Impostazione del metodo di esecuzione Nella schermata Run Method (Metodo di esecuzione), rivedere il volume di reazione e il metodo di esecuzione predefinito. Se necessario, modificare il volume di reazione e il metodo di esecuzione oppure sostituirli caricando un metodo di esecuzione dalla libreria. Informazioni sul disegno di esempio L'esperimento di esempio esegue reazioni da 25-µl utilizzando il metodo del saggio di del metabolismo di farmaci TaqMan indicato qui di seguito. Poiché il Sistema StepOne viene utilizzato per l'esecuzione del ciclo termico, il metodo di esecuzione contiene una fase ciclica per la PCR. Lettura pre-pcr Ciclo termico Lettura post-pcr Fase/Passaggio Fase di attesa Fase di attesa Denaturazio ne Cicli (50 cicli) Annealing/ Estensione Fase di attesa Temperatura 60 C 95 C 92 C 60 C 60 C Tempo (hh:mm:ss) 00:00:30 00:10:00 00:00:15 00:01:00 00:00:30 Acquisizione dati Sì No No Sì Sì Nota: Nel metodo di cui sopra, l'acquisizione dei dati viene attivata per la fase di annealing/estensione consentendo al Sistema StepOne l'acquisizione dei dati in tempo reale durante la PCR. Sebbene i dati in tempo reale siano non necessari per la, i dati sono utili in caso di mancata riuscita della risoluzione problemi PCR. Rivisualizzazione della schermata Run Method (Metodo di esecuzione) 1. Fare clic sul campo Reaction Volume Per Well (Volume di reazione per pozzetto), quindi immettere Fare clic sul campo Number of Cycles (Numero di cicli) della fase ciclica, quindi immettere Fare clic sull'impostazione della temperatura del primo passaggio della fase ciclica (95 C/00:20), quindi immettere 10: Regolare il primo passaggio della fase ciclica: a. Fare clic sull'impostazione della temperatura del primo passaggio (95 C), quindi immettere 92 C. b. Fare clic sull'impostazione della temperatura del primo passaggio (92 C), quindi immettere 00: Fare clic sull'impostazione della temperatura del secondo passaggio (60 C) della fase ciclica, quindi immettere 01:30. 24

47 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Impostazione del metodo di esecuzione 6. Fare clic su Next > (Avanti) Linee guida disegno Per ulteriori informazioni Per disegnare il proprio esperimento: Immettere un volume/pozzetto di reazione da 10 a 30 µl. Applied Biosystems raccomanda un volume di reazione di 25 µl per gli esperimenti di. Rivedere il metodo di esecuzione predefinito. Qualora l'esperimento richieda impostazioni differenti, modificare il metodo predefinito come necessario. Fare clic su Open Run Method (Apri metodo di esecuzione) per visualizzare una libreria di metodi di esecuzione. È possibile che la libreria contenga il metodo di esecuzione per l'esperimento. Valutare l'inclusione dell'amplificazione nel metodo di esecuzione. I dati in tempo reale sono utili nella risoluzione problemi relativamente a un esperimento di. Per ulteriori informazioni sulla schermata Run Method (Metodo di esecuzione), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 25

48 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione Nella schermata Reaction Setup (Impostazione reazione), immettere il volume di reazione e il numero di reazioni in eccesso da preparare, quindi rivedere le impostazioni di concentrazione per la Master Mix PCR, per l'assay Mix, il target campione diluito e gli stock di campioni ed effettuare le modifiche necessarie. Informazioni sul disegno di esempio L'esperimento di esempio richiede una miscela di reazione sufficiente per 24 reazioni e un volume del 10 per cento per errori di pipettaggio. Ogni reazione da 25-µl consiste in: Componente µl/pozzetto 2 TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay 1.25 Genomic DNA template (3 to 20 ng) + DNAse-free water Volume totale Completamento della schermata Reaction Setup (Imposta reazione) 1. Fare clic sul campo Reaction Volume Per Well (Volume di reazione per pozzetto), quindi immettere 25 µl. 2. Fare clic sul campo Excess Reaction Volume (Volume di reazione in eccesso), immettere 10%. 3. Verificare che la concentrazione della Master Mix sia Verificare che la concentrazione dell'assay Mix TaqMan sia Selezionare la scheda Sample Dilution Calculations (Calcoli diluizione del campione). 26

49 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione 6. Fare clic sul campo Diluted Sample Concentration (Concentrazione campione diluito) (10 per miscela di reazione), quindi immettere 30 ng/µl. 7. Verificare che le concentrazioni di stock di tutti i campioni siano 100ng/µl. 8. Stampare un rapporto del layout di piastra per riferimento: a. Fare clic su Print Reaction Setup (Stampa impostazione reazione). b. Nella finestra di dialogo, selezionare: Istruzioni dettagliate di pipettaggio Includi il layout di piastra nelle istruzioni Utilizza il colore del campione come colore del pozzetto c. Fare clic su Print (Stampa). d. Nella finestra di dialogo Print (Stampa), selezionare le opzioni della stampante e di stampa, quindi fare clic su OK. 9. Fare clic su Next > (Avanti). 8a b 8b 27

50 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Ordine dei materiali per l'esperimento Linee guida disegno Per ulteriori informazioni Per disegnare il proprio esperimento: Immettere un volume/pozzetto di reazione da 10 a 30 µl. Applied Biosystems raccomanda un volume di reazione di 25 µl per gli esperimenti di. Immettere un volume di reazione in eccesso di almeno il 10 per cento per tenere conto di eventuali errori da pipettaggio non accurato e di altri errori sperimentali. Nel caso venga utilizzato templato DNA secco, i componenti e i volumi vengono calcolati nuovamente. Per ulteriori informazioni sulla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). Ordine dei materiali per l'esperimento Nella schermata Order Materials List (Ordine elenco materiali), rivedere l'elenco di materiali raccomandati per la preparazione della piastra di reazione, aggiungere gli articoli che si desidera ordinare al proprio ordine, quindi ordinare i materiali. Completamento della schermata Ordering Materials (Ordine materiali) 1. Fare clic sul campo Gene Name (Nome gene) o RS Number (Numero RS), immettere rs8039, quindi fare clic su Find Assay (Trova saggio) per ottenere il saggio sul Applied Biosystems sito web: a. Nella finestra di dialogo Find Assay Results (Risultati ricerca saggio), selezionare il saggio C _30. b. Fare clic su Apply Assay Selection (Applica selezione saggio). 1a 1b 28

51 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Ordine dei materiali per l'esperimento 2. Nell'elenco dei materiali dell'esperimento, selezionare: C _30 MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plates TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG 3. Fare clic su Add Selected Items to Shopping List (Aggiungi gli articoli selezionati all'elenco acquisti). 4. Fare clic sul campo Shopping Basket Name (Nome carrello acquisti), quindi immettere Example Experiment (Esperimento di esempio). 5. Verificare che l'elenco acquisti dell'esperimento contenga i materiali desiderati e che le quantità siano corrette. 6. Fare clic su Order Materials in List (Ordina i materiali presenti nell'elenco). 7. Immettere le proprie Applied Biosystems informazioni di login dello Store, quindi fare clic su Login and Submit (Entra e inoltra) oppure fare clic su Register Now (Registrati subito) e completare il processo di registrazione. 8. Dopo aver effettuato l ordine, fare clic su Finish Designing Experiment (Termina il disegno dell'esperimento)

52 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Ordine dei materiali per l'esperimento Linee guida disegno Per disegnare il proprio esperimento: Verificare che il proprio computer abbia una connessione Internet senza restrizioni. Selezionare tutti i materiali necessari per l'esperimento e aggiungerli all'elenco acquisti. IMPORTANTE! Il Sistema StepOne esegue solo materiali di consumo veloci (piastre di reazione, strisce con provette e provette). Quando viene eseguito un esperimento di, eseguire le reazioni preparate con Master Mix TaqMan Universal PCR standard su un materiale di consumo veloce utilizzando condizioni PCR standard. Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sulla schermata Materials List (Elenco materiali), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 30

53 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Termine del flusso di lavoro del Design Wizard Termine del flusso di lavoro del Design Wizard Nella finestra di dialogo Review Plate Layout (Rivisualizzazione layout di piastra), selezionare una opzione per terminare l'impostazione del design wizard, rivedere il layout di piastra e avviare l'esecuzione. Termine del Design Wizard 1. Rivedere il layout di piastra. Se il layout di piastra non è corretto, selezionare Return to the Wizard (Ritorna al Wizard) e verificare i valori immessi. 2. Selezionare Save Experiment (Salva esperimento). 3. Nella finestra di dialogo Save Experiment (Salva esperimento), fare clic su Save (Salva)per salvare l'esperimento con nome Genotyping Example.eds

54 Capitolo 2 Disegno dell'esperimento Termine del flusso di lavoro del Design Wizard Linee guida disegno Nel disegno dell'esperimento, esso viene salvato in <unità>:\applied Biosystems\StepOne System\experiments dove <unità> rappresenta la directory di installazione del software StepOne. Nota: Per modificare la cartella predefinita, selezionare Tools (Strumenti) Preferences (Preferenze), modificare la collocazione desiderata per il salvataggio, quindi fare clic su OK. 32

55 Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Questo capitolo comprende i paragrafi: Descrizione generale Preparazione delle diluizioni del campione Preparazione della miscela di reazione Preparazione della piastra di reazione Nota: Per ulteriori informazioni sugli argomenti trattati in questa guida, accedere alla voce Help (Guida) nel software del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System premendo F1, facendo clic su nella barra degli strumenti oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 33

56 Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Descrizione generale Descrizione generale Questo capitolo spiega come preparare le reazioni PCR per l'esperimento di di esempio e fornisce le linee guida per la preparazione delle reazioni PCR relativamente al proprio esperimento. Flusso di lavoro Preparare le reazioni PCR utilizzando il flusso di lavoro seguente: Avvio dell'esperimento Disegno dell'esperimento (Capitolo 2) Preparazione delle reazioni (Capitolo 3) 1. Preparazione delle diluizioni del campione. 2. Preparazione della miscela di reazione. 3. Preparazione della piastra di reazione. Esecuzione dell'esperimento (Capitolo 4) Analisi dell'esperimento (Capitolo 5) Fine dell'esperimento Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sulla preparazione dei saggi di SNP TaqMan, vedere: Protocollo Custom TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol (N. di cat ) Protocollo Custom TaqMan Genomic Assays Protocol (N. di cat B) Protocollo TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol (N. di cat C) Protocollo TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol (N. di cat A) Scheda di riferimento rapido Performing a Custom TaqMan SNP Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick Reference Card (N. di cat A) Scheda di riferimento rapido Performing a TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick Reference Card (N. di cat A) Protocollo Pre-Developed TaqMan Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol (N. di cat C) Scheda di riferimento rapido Allelic Discrimination Pre-Developed TaqMan Assay Reagents Quick Reference Card (N. di cat C) Nota: Le procedure del presente capitolo sono focalizzate sull'utilizzo di campioni di DNA umidi. Nel caso venga utilizzato DNA secco, consultare il protocollo della chimica che viene fornito con il kit PCR per i dettagli sulla ricostituzione e sulla preparazione per la piastra dei campioni da utilizzare. 34

57 Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Preparazione delle diluizioni del campione Preparazione delle diluizioni del campione Diluire lo stock del campione alle concentrazioni operative utilizzando i volumi calcolati dal software StepOne (vedere Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione a pagina 26). Informazioni sull'esperimento di esempio I volumi calcolati per l'esperimento di esempio di sono elencati qui di seguito. La concentrazione finale è 30.0 ng/µl. Provetta Nome campione Concentrazione stock campione (ng/µl) Stock campione (µl) Volume (µl) Acqua priva di DNAse (µl) Totale campione diluito (µl) 1 Campione Campione Campione Materiali necessari Preparazione dei campioni Acqua priva di DNAse per la diluizione del campione Provette per microcentrifuga Pipettatori e puntali per pipette Stock campione Vortexer Centrifuga 1. Etichettare una provetta per microcentrifuga separata per ogni campione: Campione 1, Campione 2, fino al Campione Aggiungere 1.54 µl di acqua priva di DNAse a ogni provetta vuota. 3. Aggiungere 0.66 µl dello stock campione appropriato a ogni provetta. 4. Agitare su Vortex ogni campione diluito da 3 a 5 secondi, quindi centrifugare brevemente le provette. Linee guida per la preparazione Per ulteriori informazioni Per preparare i campioni per il proprio esperimento: Utilizzare acqua priva di DNAse per la diluizione dei campioni. Utilizzare la stessa quantità di DNA per pozzetto per ogni esperimento. Non riscaldare i campioni di DNA. Per ulteriori informazioni sulla preparazione dei saggi di SNP TaqMan, fare riferimento al protocollo appropriato per i reagenti utilizzati nelle reazioni PCR (vedere Per ulteriori informazioni a pagina 34). 35

58 Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Preparazione della miscela di reazione Preparazione della miscela di reazione Preparare la miscela di reazione per l'esperimento utilizzando i volumi calcolati dal software StepOne. Il software StepOne determina quali componenti della miscela di reazione utilizzare sulla base delle selezioni effettuate nella schermata Methods and Materials (Metodi e Materiali) (vedere Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione a pagina 26). Per gli esperimenti di, la miscela di reazione contiene tutti i componenti eccetto il campione, il buffer o il controllo positivo. Materiali necessari Preparazione della miscela di reazione Master Mix TaqMan Universal PCR veloce (2 ), No AmpErase UNG Saggio di del metabolismo di farmacitaqman (20 ) Acqua priva di DNAse Provette per microcentrifuga Pipettatori Puntali per pipette Centrifuga PERICOLO CHIMICO. La Master Mix TaqMan 2 Universal PCR, No AmpErase UNG può provocare irritazione degli occhi e della pelle. L'esposizione può provocare problemi in caso di ingestione o inalazione. Leggere la scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) e attenersi rigorosamente alle istruzioni relative alla manipolazione di questa sostanza. Indossare un'adeguata protezione oculare, indumenti e guanti di protezione. 1. Per il saggio SNP, aggiungere i volumi richiesti di ogni componente in una provetta dalle dimensioni appropriate: Volume di reazione Componente Per pozzetto(µl) 24 Rxns. incluso 10% in eccesso (µl) Secco Umido Secco Umido TaqMan Universal PCR Master Mix (2 ) SNP Assay Mix (20 ) H 2 O, priva di DNase Volume totale della miscela di reazione Pipettare la miscela di reazione con cautela su e giù, quindi tappare la provetta. 3. Centrifugare brevemente la provetta. 36

59 Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Preparazione della miscela di reazione Linee guida per la preparazione Per preparare la miscela di reazione per il proprio esperimento, verificare che siano state eseguite le seguenti azioni: Preparare le reazioni per ogni SNP separatamente. Includere volume in eccesso nei propri calcoli allo scopo di compensare le perdite che si verificano durante il trasferimento dei reagenti. Includere tutti i componenti necessari. Preparare i reagenti secondo le istruzioni del produttore. Proteggere l'assay Mix dalla luce, nel congelatore, fino al momento dell'utilizzo. Una eccessiva esposizione alla luce può provocare effetti non desiderati sulle sonde fluorescenti. Prima dell'utilizzo: Mescolare bene la Master Mix agitando la bottiglia. Riportare l'assay Mix in sospensione agitando su Vortex, quindi centrifugare brevemente la provetta. Scongelare eventuali campioni congelati collocandoli su ghiaccio. Una volta scongelati, riportare in sospensione i campioni agitandoli su Vortex, quindi centrifugare brevemente le provette. Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sulla preparazione della miscela di reazione, fare riferimento al protocollo appropriato per i reagenti utilizzati nelle reazioni PCR (vedere Per ulteriori informazioni a pagina 34). 37

60 Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Preparazione della piastra di reazione Preparazione della piastra di reazione Caricare la piastra di reazione con la miscela di reazione riportata a pagina 36 e i campioni diluiti riportati a pagina 35. Le reazioni vengono aggiunte secondo il layout di piastra generato nel software StepOne (vedere Impostazione dei campioni e dei replicati a pagina 22). Materiali necessari Centrifuga Piastra di reazione MicroAmp Fast Optical 48-Well Pellicola adesiva MicroAmp Optical 48-Well Pipettatori e puntali per pipette Nota: Il Sistema StepOne esegue unicamente materiali di consumo veloci MicroAmp. Preparazione della piastra di reazione: gdna seccato 1. Pipettare 1 µl del campione appropriato (da 3 a 20 ng di DNA genomico purificato) in ciascun pozzetto di una piastra di reazione ottica a 48 pozzetti. È necessario che tutti i pozzetti appartenenti allo stesso saggio di contengano la stessa quantità del campione o del controllo. 2. Asciugare i campioni per evaporazione a temperatura ambiente in ambiente privo di luce e privo di ampliconi. (Mentre è in atto la fase di asciugaggio coprire la piastra di reazione con un tessuto privo di lanugine.) 3. Trasferire 25 µl della miscela di reazione in ogni pozzetto. IMPORTANTE! Controllare che non si verifichi contaminazione incrociata da pozzetto a pozzetto. 4. Sigillare la piastra di reazione utilizzando una pellicola adesiva. 5. Agitare su Vortex la piastra di reazione da 3 a 5 sec. 6. Centrifugare brevemente la piastra di reazione. 7. Verificare che il liquido si trovi sul fondo di ogni pozzetto della piastra di reazione. In caso contrario, centrifugare nuovamente la piastra a una velocità maggiore e per un tempo maggiore. IMPORTANTE! Non far sporcare il fondo della piastra di reazione. I fluidi e gli altri contaminanti che aderiscono al fondo della piastra di reazione possono contaminare il blocco campione, provocando un segnale di background esageratamente elevato. 38

61 Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Preparazione della piastra di reazione Corretto Non corretto Liquido sul fondo del pozzetto. Non centrifugato con forza sufficiente, oppure Non centrifugato per un periodo di tempo sufficiente Preparazione della piastra di reazione: gdna umido 1. Diluire ogni campione purificato di DNA genomico con acqua priva di DNase per ottenere una massa finale di DNA contenuta nel range da 3 a 20 ng per pozzetto di reazione. Il volume del campione di DNA e dell'acqua priva di DNase per reazione dovrebbe essere di 11,25 µl. 2. In ogni pozzetto della piastra di reazione, pipettare una aliquota del controllo o del campione del volume (indicato nel passaggio 1) appropriato per il tipo di piastra di reazione: a. Per ogni reazione non nota, aggiungere 11,25 µl del campione nei pozzetti appropriati. b. Per ogni reazione di controllo negativo, aggiungere 11,25 µl di acqua priva di DNAse nei pozzetti appropriati. c. Per ogni reazione di controllo positivo, aggiungere 11,25 µl del controllo positivo nei pozzetti appropriati. IMPORTANTE! Verificare che il genotipo per il templato di controllo positivo aggiunto sia conforme al genotipo assegnato al pozzetto. 3. Trasferire 13,75 µl della miscela di reazione nei pozzetti appropriati. 4. Sigillare la piastra di reazione utilizzando una pellicola ottica adesiva. 5. Agitare su Vortex la piastra di reazione da 3 a 5 sec, quindi centrifugarla brevemente. 6. Centrifugare brevemente la piastra di reazione. IMPORTANTE! Non far sporcare il fondo della piastra di reazione. I fluidi e gli altri contaminanti che aderiscono al fondo della piastra di reazione possono contaminare il blocco campione, provocando un segnale di background esageratamente elevato. 39

62 Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Preparazione della piastra di reazione Corretto Non corretto Liquido sul fondo del pozzetto. Non centrifugato con forza sufficiente, oppure Non centrifugato per un periodo di tempo sufficiente Linee guida per la preparazione Per preparare la piastra di reazione per il proprio esperimento: Accertarsi di utilizzare i materiali di consumo appropriati. Verificare che le posizioni delle reazioni siano conformi al layout di piastra nel software StepOne. Nel caso siano in esecuzione meno di 40 reazioni, utilizzare strisce con provetta e non una piastra di reazione. Caricare da 3 a 20 ng di DNA genomico purificato per reazione È necessario che tutti i pozzetti appartenenti allo stesso saggio di contengano la stessa quantità del campione o del controllo. È possibile eseguire saggi multipli su una sola piastra di reazione, ma è necessario analizzarli separatamente. 40

63 Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Preparazione della piastra di reazione Nel caso venga utilizzata pellicola adesiva ottica per sigillare le piastre, sigillare ogni piastra come segue: Azione Esempio 1. Posizionare la piastra di reazione ottica a 48 pozzetti sulla parte centrale della base di supporto splash free a 96 pozzetti. Verificare che la piastra sia aderente alla superficie superiore della base di supporto. 2. Caricare la piastra di reazione ottica a 48 pozzetti come desiderato. 3. Rimuovere una pellicola adesiva ottica singola dalla scatola. Flettere verso l'alto entrambe le linguette terminali. Tenere la pellicola adesiva ottica col lato posteriore verso l'alto. 4. Con un solo rapido movimento, staccare la protezione dalla superficie centrale sigillante. Non toccare la superficie centrale sigillante. 5. Tenendo la pellicola adesiva ottica per le alette terminali, adagiare la pellicola ottica sulla piastra di reazione a 48 pozzetti (con il lato adesivo posto a contatto con la piastra). Verficare che la pellicola ricopra completamente tutti i pozzetti della piastra. 6. Muovere l'applicatore lentamente su tutta la pellicola adesiva, esercitando una ferma pressione, orizzontalmente e verticalmente, per garantire un contatto ottimale tra la pellicola e la piastra su tutta la superficie della piastra di reazione. 7. Mentre è in atto l'utilizzo dell'applicatore per mantenere il bordo della pellicola in posizione, afferrare una estremità dell'aletta e tirare verso l'alto e strappare bruscamente. Ripetere per l'altra aletta. 8. Ripetere il passaggio 7. Muovere l'applicatore orizzontalmente e verticalmente, con ferma pressione, sulla pellicola adesiva ottica per ottenere una sigillatura ermetica, a prova di evaporazione. 9. Per garantire una sigillatura ermetica, passare la estremità dell'applicatore con ferma pressione sui quattro lati del bordo esterno della pellicola adesiva ottica. Ispezionare la piastra per verificare che tutti i pozzetti siano sigillati (controllare che sia presente una impronta di tutti i pozzetti sulla superficie della pellicola adesiva ottica). IMPORTANTE! Una azione impropria di rimozione della protezione dalla pellicola può provocare un effetto di appannamento sulla pellicola stessa, ma non influenza i risultati. L'appannamento scompare quando la pellicola entra in contatto con il pannello di copertura riscaldato nello strumento. Nota: Le pellicole adesive ottiche non aderiscono al semplice contatto. È necessaria l'applicazione di pressione per garantire una sigillatura ermetica, a prova di evaporazione. 41

64 Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Preparazione della piastra di reazione Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sulla preparazione della piastra di reazione, fare riferimento al protocollo appropriato per i reagenti utilizzati nelle reazioni PCR (vedere Per ulteriori informazioni a pagina 34). 42

65 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Questo capitolo comprende i paragrafi: Descrizione generale Preparazione per l'esecuzione (Opzionale) Abilitazione delle notifiche Avvio dell'esecuzione Monitoraggio dell'esecuzione Rimozione della piastra di reazione e trasferimento dei dati Nota: Per ulteriori informazioni sugli argomenti trattati in questa guida, accedere alla voce Help (Guida) nel software del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System premendo F1, facendo clic su nella barra degli strumenti oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 43

66 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Descrizione generale Descrizione generale Questo capitolo spiega come eseguire una sessione di analisi sullo strumento Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. Flusso di lavoro Eseguire l'esperimento utilizzando il flusso di lavoro seguente: Avvio dell'esperimento Disegno dell'esperimento (Capitolo 2) Preparazione delle reazioni (Capitolo 3) Esecuzione dell'esperimento (Capitolo 4) 1. Preparazione per l'esecuzione. 2. (Opzionale) Abilitazione delle notifiche. 3. Avvio dell'esecuzione. 4. Monitoraggio dell'esecuzione. 5. Rimozione della piastra di reazione e trasferimento dei dati. Analisi dell'esperimento (Capitolo 5) Fine dell'esperimento 44

67 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Preparazione per l'esecuzione Preparazione per l'esecuzione Prepararsi all'esecuzione aprendo l'esperimento e caricando la MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plate a chiusura ermetica nello Strumento StepOne. Apertura dell'esperimento 1. Nel software StepOne, fare clic su Open (Apri). 2. Selezionare Genotyping Example.eds. 3. Fare clic su Open (Apri)

68 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Preparazione per l'esecuzione Caricamento della piastra di reazione PERICOLO DI INFORTUNIO. Durante il funzionamento dello strumento, la temperatura del blocco campione può superare i 100 C. Se lo strumento è stato utilizzato di recente, tenere le mani lontane fino a quando il blocco campione non raggiunge la temperatura ambiente. IMPORTANTE! Indossare guanti privi di polvere per manipolare la piastra di reazione. 1. Aprire il cassetto dello strumento. 2. Posizionare le reazioni nel blocco campione. L'orientamento della piastra di reazione dipende dal tipo dei materiali di consumo utilizzati: In caso di utilizzo di una piastra di reazione, posizionare il blocco campione con il pozzetto A1 nell'angolo posteriore sinistro. In caso di utilizzo di strisce con provette di reazione, posizionare le strisce nel blocco campione. A1 3. Chiudere con attenzione il cassetto dello strumento. 46 Guida introduttiva al sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di

69 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento (Opzionale) Abilitazione delle notifiche Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sul caricamento della piastra di reazione, accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). (Opzionale) Abilitazione delle notifiche Abilitare le impostazioni delle notifiche in modo tale che il software StepOne invii un avviso tramite quando lo Strumento StepOne inizia l'esecuzione e quando questa viene completata, oppure nel caso si verifichi un errore durante l'esecuzione. L'abilitazione della funzione delle impostazioni delle notifiche è opzionale e non influenza le prestazioni del Sistema StepOne o la durata dell'esecuzione. IMPORTANTE! La funzione delle impostazioni di notifica è disponibile solo se il computer utilizzato per la sessione con Strumento StepOne è collegato a una rete Ethernet. Nota: Il sistema di notifica è disponibile anche per computer che eseguono il monitoraggio dello Strumento StepOne da remoto. Per ulteriori informazioni sul monitoraggio remoto, vedere Monitoraggio remoto a pagina 59. Informazioni sul disegno di esempio Regolazione delle impostazioni di notifica Nell'esperimento di esempio, il software StepOne è impostato per inviare notifiche a tre utenti (ricercatore, supervisore e tecnico presso nomeazienda.com) quando il Sistema StepOne termina l'esecuzione e nel caso in cui si verifichino errori durante il funzionamento. Il server SMTP dell'esempio (www.nomeazienda.com) è impostato per la criptazione Secure Sockets Layers (SSL) e richiede l'autenticazione per l'uso. 1. Nel software StepOne, fare clic su Run (Esegui) nella colonna di navigazione. 2. Fare clic su Notification Settings (Impostazioni di notifica). 3. Selezionare Enable Notifications (Abilita notifiche). 4. Selezionare gli eventi che attiveranno le notifiche: a. Selezionare Instrument Error (Errore dello strumento). b. Selezionare Run Completed (Esecuzione completata). 5. Fare clic sul campo Enter addresses for notifications (Immetti indirizzi e- mail per le notifiche), quindi immettere 6. Fare clic sul campo Outgoing Mail Server (Server posta in uscita) (SMTP), quindi immettere smtp.nomeazienda.com. 47

70 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento (Opzionale) Abilitazione delle notifiche 7. Specificare le impostazioni di autenticazione: a. Selezionare No per Server requires authentication (Autenticazione del server necessaria). b. Fare clic sul campo User Name (Nome utente), quindi immettere supervisor (supervisore). c. Fare clic sul campo Password, quindi immettere password a 7b 7c Linee guida esecuzione Quando il Sistema StepOne viene impostato per la notifica automatica: È necessario che il Sistema StepOne sia impostato per l'utilizzo in rete. Vedere la Guida per installazione, collegamento in rete e manutenzione del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. Determinare gli eventi da notificare tra: Instrument Error (Errore dello strumento) Induce il Sistema StepOne a notificare tramite ai destinatari tutti gli errori occorsi allo Strumento StepOne durante ogni esecuzione. Run Started (Esecuzione avviata) Induce il Sistema StepOne a notificare tramite ai destinatari tutte le volte che lo strumento avvia una esecuzione. Run Completed (Esecuzione completata) Induce il Sistema StepOne a notificare tramite ai destinatari tutte le volte che lo strumento completa una esecuzione. Acquisire gli indirizzi per la ricezione delle notifiche. IMPORTANTE! Separare gli indirizzi con una virgola (, ). 48

71 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Avvio dell'esecuzione Contattare l'amministratore dei sistemi oppure il reparto di Information Technology per L'indirizzo di rete di un server simple mail transfer protocol (SMTP) Un nome utente e una password per il server, qualora siano richiesti per l'accesso L'impostazione Secure Sockets Layer (SSL) del server (on oppure off) Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sulla schermata Notification Settings (Impostazioni di notifica), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). Avvio dell'esecuzione Avviare l'esecuzione in base al layout dello Strumento StepOne. La modalità di avvio dell'esecuzione dipende dal layout del Sistema StepOne : Layout Descrizione Vedere... Co-locato Il cavo giallo del Sistema StepOne collega il computer allo Strumento StepOne Avvio co-locato qui di seguito Indipendente Il computer e lo Strumento StepOne non sono collegati, oppure Il computer e lo Strumento StepOne sono collegati alla stessa rete. Avvio indipendente a pagina 50 Avvio co-locato Eseguire la procedura seguente se il computer è collegato direttamente allo Strumento StepOne attraverso il cavo del Sistema StepOne. 1. Nel software StepOne, fare clic su Temperature Plot (Plot di temperatura). 2. Fare clic su START RUN (AVVIA ESECUZIONE). 49

72 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Avvio dell'esecuzione 2 1 Avvio indipendente Eseguire la procedura seguente se il computer e lo Strumento StepOne non sono collegati direttamente attraverso il cavo giallo del Sistema StepOne. 1. Se il computer e lo Strumento StepOne sono collegati alla stessa rete, eseguire i passaggi 1a fino a 1f. In caso contrario, andare al passaggio 2. a. Nel software StepOne, fare clic su Send Experiment to Instrument (Invia esperimento allo strumento). b. Nella finestra di dialogo Send Experiment to Instrument (Invia esperimento allo strumento), fare clic su Browse (Sfoglia), selezionare il file Genotyping Example.eds, quindi fare clic su Open (Apri). c. Selezionare lo Strumento StepOne dal menu a discesa Select Instrument (Seleziona strumento). Nel caso lo strumento non sia elencato Strumento StepOne, impostare lo strumento per il monitoraggio come spiegato nella Guida per installazione, collegamento in rete e manutenzione del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. 50

73 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Avvio dell'esecuzione d. Fare clic su Send Experiment (Invia esperimento) per inviare l'esperimento allo Strumento StepOne attraverso la rete. 1b 1c 1d e. Quando segnalato, fare clic su OK per chiudere la verifica. f. Andare al passaggio Se lo Strumento StepOne non è collegato al computer, eseguire i passaggi 2a a 2d per utilizzare una unità USB per il trasferimento dell'esperimento. a. Collegare l'unità USB a una delle porte USB del computer. b. Nel software StepOne, selezionare Save (Salva) Save As (Salva con nome). c. Nella finestra di dialogo Save (Salva), individuare l'unità USB, quindi fare clic su Save (Salva). d. Rimuovere l'unità USB dal computer, quindi collegarla alla porta USB dello Strumento StepOne. o 3. Sfiorare il touchscreen dello Strumento StepOne, quindi sfiorare. 4. Nel Main Menu (Menu principale), sfiorare Browse Experiments (Sfoglia esperimenti). 5. Nella schermata Browse Methods (Metodi per sfogliare), sfiorare (Cartelle). 6. Nella schermata Choose an Experiment Category (Scegli una categoria di esperimento): Sfiorare USB se il trasferimento dell'esperimento è stato eseguito attraverso una unità USB. Sfiorare Default (Predefinito) se l'invio dell'esperimento è stato eseguito attraverso il collegamento a una rete. 51

74 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Avvio dell'esecuzione 7. Nella schermata Browse USB/Default Experiments (Sfoglia esperimenti USB/predefiniti): a. Sfiorare Example Genotyping Experiment (Esperimento di esempio di ) per selezionare l'esperimento. b. Sfiorare Start Run (Avvia esecuzione). 5 7a 7b 8. Nella schermata Run Parameters (Esegui parametri): a. Sfiorare il campo Reaction Volume (Volume reazione), utilizzare il tastierino per immettere 25 µl, quindi sfiorare Done (Fatto). b. Sfiorare Start Run (Avvia esecuzione). 8a 8b 52

75 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Monitoraggio dell'esecuzione Monitoraggio dell'esecuzione Monitorare lo sviluppo dell'esecuzione da un computer su cui è attivo il software StepOne oppure dal touchscreen dello Strumento StepOne. La modalità di monitoraggio dell'esecuzione dipende dal layout del Sistema StepOne : Layout Descrizione Vedere... Co-locato Indipendente (collegato in rete) Indipendente (di base) Il cavo del Sistema StepOne collega il computer allo Strumento StepOne. Il computer e lo Strumento StepOne sono collegati alla stessa rete. Il computer e lo Strumento StepOne non sono collegati. Monitoraggio colocato qui di seguito Monitoraggio remoto a pagina 59 Monitoraggio indipendente a pagina 62 Monitoraggio colocato Se il computer è collegato direttamente allo Strumento StepOne attraverso il cavo del Sistema StepOne, è possibile visualizzare lo sviluppo dell'esecuzione in tempo reale come descritto qui di seguito. Durante l'esecuzione, visualizzare periodicamente tutti i tre plot disponibili nel software StepOne per potenziali problemi. # Per Azione A Arrestare l'esecuzione 1. Nel software StepOne, fare clic su STOP RUN (ARRESTA ESECUZIONE). 2. Nella casella di dialogo Stop Run (Arresta esecuzione), fare clic su una delle seguenti opzioni: Stop Immediately (Arresta immediatamente) per arrestare l'esecuzione immediatamente. Stop after Current Cycle/Hold (Arresta dopo il ciclo corrente/attendi) per arrestare l'esecuzione dopo il ciclo corrente oppure attendere. Cancel (Annulla) per continuare l'esecuzione. B C D E Visualizzare i dati di amplificazione in tempo reale Visualizzare i dati della temperatura per l'esecuzione in tempo reale Visualizzare lo sviluppo dell'esecuzione nel metodo di esecuzione Abilitare/disabilitare le impostazioni di notifica. Selezionare Amplification Plot (Plot di amplificazione). Vedere Informazioni sul Plot di amplificazione a pagina 55 per ulteriori informazioni sul plot. Selezionare Temperature Plot (Plot di temperatura). Vedere Informazioni sul Plot di temperatura a pagina 56 per ulteriori informazioni sul plot. Selezionare Run Method View (Visualizzazione metodo di esecuzione). Vedere Informazioni sulla visualizzazione del metodo di esecuzione a pagina 57 per ulteriori informazioni sulla visualizzazione. Selezionare o deselezionare Enable Notifications (Abilita notifiche). 53

76 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Monitoraggio dell'esecuzione A B E C D 54

77 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Monitoraggio dell'esecuzione Informazioni sul Plot di amplificazione Il Plot di amplificazione consente di visualizzare l'amplificazione del campione in seguito all'acquisizione da parte dello Strumento StepOne dei dati di fluorescenza durante una sessione di analisi. Qualora un metodo sia impostato per acquisire i dati in tempo reale, il Plot di amplificazione visualizza i dati per i pozzetti selezionati nella scheda View Plate Layout (Visualizza layout di piastra). Il plot evidenzia la fluorescenza del colorante normalizzata ( R n ) e il numero di ciclo. La figura qui di seguito mostra il Plot di amplificazione come appare durante l'esperimento di esempio. Il Plot di amplificazione è utile per l'identificazione e l'esame dell'amplificazione anomala. L'amplificazione anomala può includere: Fluorescenza aumentata nei pozzetti di controllo negativi. Nessun aumento di fluorescenza nei pozzetti di controllo positivo. Assenza di fluorescenza rilevabile per un determinato ciclo (dovuta all'utilizzo degli stessi reagenti sotto le stesse condizioni in esperimenti precedenti simili). Nel caso si noti amplificazione anomala o una completa assenza di segnale, risolvere il problema come spiegato nella Guida del software StepOne (fare clic su nella barra degli strumenti oppure selezionare Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). Nota: Per visualizzare i dati nel Plot di amplificazione, selezionare i pozzetti da visualizzare nella scheda View Plate Layout (Visualizza layout di piastra). Per ulteriori informazioni sulla schermata Amplification Plot (Plot di amplificazione), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 55

78 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Monitoraggio dell'esecuzione Informazioni sul Plot di temperatura Durante una sessione di analisi, il Plot temperatura visualizza le temperature del blocco campione, del pannello di copertura riscaldato e dei campioni (calcolate) in tempo reale. La figura qui di seguito mostra il Plot della temperatura come appare durante l'esperimento di esempio. A B Per Aggiungere/Rimuovere i plot della temperatura Modificare il tempo visualizzato dal plot Azione Selezionare Sample (Campione), Heated Cover (Pannello di copertura riscaldato)oppure Sample Block (Blocco campione) per alternare la presenza dei dati associati nel plot. Selezionare View (Visualizza) (durata temporale). C Restringere l'asse Y del plot Selezionare Fixed View (Visualizzazione fissa). A B C Il Plot della temperatura è spesso utile per l'identificazione di guasti hardware. Durante il monitoraggio del Plot della temperatura, osservare il campione, il pannello di copertura riscaldato e il blocco campione per rilevare eventuali comportamenti anomali. In generale, i plot del campione e quello del blocco si rispecchiano approssimativamente l'uno con l'altro. Una deviazione significativa dei plot potrebbe indicare un problema. Il pannello di copertura riscaldato deve mantenere costantemente la temperatura specificata nel metodo. Uno scostamento da tale temperatura uniforme potrebbe indicare un problema. 56

79 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Monitoraggio dell'esecuzione Nel caso si noti un plot di temperatura anomalo, risolvere il problema come spiegato nella Guida del software StepOne (fare clic su nella barra degli strumenti oppure selezionare Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne)). Per ulteriori informazioni sulla schermata Temperature Plot (Plot della temperatura), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). Informazioni sulla visualizzazione del metodo di esecuzione Dopo l'avvio dell'esecuzione, il Sistema StepOne visualizza lo sviluppo dell'esecuzione nella visualizzazione del metodo di esecuzione. La visualizzazione riporta lo sviluppo dell'esecuzione in riferimento al profilo termico del metodo. La figura qui di seguito indica la visualizzazione del metodo di esecuzione come appare nell'esperimento di esempio. A Per Modificare il metodo di esecuzione (aggiungere cicli, una fase di attesa o una curva di melting) Azione 1. Nel pannello di navigazione, fare clic su Run Method (Metodo di esecuzione). 2. Nella schermata Run Method (Metodo di esecuzione), effettuare alcune delle seguenti azioni: Immettere il numero di cicli da applicare alla fase ciclica. Selezionare Add Melt Curve Stage to End (Aggiungi fase curva melt alla fine) nel caso si desideri aggiungere una fase di curva di melting alla fine dell'esecuzione. Selezionare Add Holding Stage to End (Aggiungi fase di attesa alla fine) nel caso si desideri aggiungere una fase di attesa alla fine dell'esecuzione. 3. Fare clic su Send to Instrument (Invia allo strumento). 57

80 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Monitoraggio dell'esecuzione A Nota: Nel caso compaia un avviso, fare clic sull'errore per ulteriori informazioni e per risolvere il problema come spiegato nella Guida del software StepOne (fare clic su nella barra degli strumenti oppure selezionare Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne)). Per ulteriori informazioni sulla schermata Run Method (Metodo di esecuzione), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 58

81 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Monitoraggio dell'esecuzione Monitoraggio remoto Se lo Strumento StepOne è collegato a una rete, è possibile utilizzare la funzione di monitoraggio remoto del software StepOne per visualizzare lo sviluppo dell'esecuzione in tempo reale da qualunque computer in rete. IMPORTANTE! I computer in rete non sono abilitati a controllare lo Strumento StepOne ma solo a monitorarlo. # Per Azione A B C D Visualizzare i dati di amplificazione in tempo reale Visualizzare i dati della temperatura per l'esecuzione in tempo reale Visualizzare lo sviluppo dell'esecuzione nel metodo di esecuzione Abilitare/disabilitare le impostazioni di notifica. Fare clic su Amplification Plot (Plot di amplificazione). Vedere Informazioni sul Plot di amplificazione a pagina 55 per ulteriori informazioni sul plot. Fare clic su Temperature Plot (Plot temperatura). Vedere Informazioni sul Plot di temperatura a pagina 56 per ulteriori informazioni sul plot. Fare clic su Run Method View (Visualizzazione metodo di esecuzione). Vedere Informazioni sulla visualizzazione del metodo di esecuzione a pagina 57 per ulteriori informazioni sulla visualizzazione. Selezionare o deselezionare Enable Notifications (Abilita notifiche). Vedere (Opzionale) Abilitazione delle notifiche a pagina 47 per ulteriori informazioni sulle impostazioni di notifica. D A B C Per monitorare lo Strumento StepOne da remoto: 1. Nel software StepOne, selezionareinstrument (Strumento) Remote Monitor (Monitoraggio Remoto). 59

82 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Monitoraggio dell'esecuzione 2. Nella barra di navigazione, selezionare lo Strumento StepOne. Se lo Strumento StepOne non è elencato nella barra di navigazione: a. Fare clic su Add Instrument (Aggiungi strumento). b. Fare clic sul campo Instrument Name (Nome strumento), quindi immettere il nome dello strumento. c. Fare clic sul campo Host Name (Nome host), quindi immettere l'indirizzo IP dello strumento. d. Fare clic su Save & Exit (Salva ed Esci). 2b 2c 2d Nota: Per ulteriori informazioni sulla configurazione dello Strumento StepOne per l'utilizzo di rete o per il monitoraggio remoto, vedere la Guida per installazione, collegamento in rete e manutenzione del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. 60

83 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Monitoraggio dell'esecuzione 3. Fare clic su (Start monitoring this instrument (Avvia monitoraggio di questo strumento)) per lo strumento stesso

84 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Monitoraggio dell'esecuzione Monitoraggio indipendente Nel caso sia stata avviata l'esecuzione dallo Strumento StepOne, è possibile visualizzare lo sviluppo dell'esecuzione dal touchscreen. La schermata Run Method (Metodo di esecuzione) visualizza il metodo per l'esperimento ed evidenzia le fasi del profilo termico nel modo in cui lo strumento le esegue. # Per Azione A B Aggiungere una curva di melting all'esecuzione Visualizzare il tempo residuo dell'esecuzione Sfiorare (Add Melt Curve (Aggiungi curva di melting)), quindi sfiorare OK. Sfiorare Display Experiment Time (Visualizza tempo esperimento), quindi sfiorare per ritornare alla schermata Run Method (Metodo di esecuzione). C Arrestare l'esecuzione Sfiorare STOP (ARRESTA), quindi sfiorare: Stop (Arresta) per arrestare l'esecuzione dopo il completamento da parte dello Strumento StepOne del ciclo corrente o per metterla in fase di attesa. Abort (Interrompi) per arrestare l'esecuzione immediatamente. per continuare l'esecuzione senza alcuna modifica. D E Visualizzare le informazioni dell'esperimento Visualizzare il log di errore Sfiorare View Experiment Information (Visualizza informazioni esperimento), quindi sfiorare per ritornare alla schermata Run Method (Metodo di esecuzione). Sfiorare la barra di stato per visualizzare il log di errore. D A B C E 62

85 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Rimozione della piastra di reazione e trasferimento dei dati Rimozione della piastra di reazione e trasferimento dei dati Quando lo Strumento StepOne visualizza il Main Menu (Menu principale), rimuovere la piastra di reazione dallo Strumento StepOne e trasferire i dati dell'esperimento al computer per l'analisi degli stessi. Scaricamento della piastra di reazione PERICOLO DI INFORTUNIO. Durante il funzionamento dello strumento, la temperatura del blocco campione può superare i 100 C. Tenere le mani a distanza fino a quando il blocco campione non raggiunge la temperatura ambiente. Nota: Quando lo Strumento StepOne completa una sessione di analisi, il sistema salva i dettagli dell'esecuzione nello storico dell'esecuzione, che resta nel sistema fino al completamento di un'altra sessione. 1. Quando appare il Main Menu (Menu principale) nel touchscreen dello Strumento StepOne, sfiorare. 2. Aprire il cassetto dello strumento. 3. Rimuovere la piastra di reazione dal blocco campione. 4. Chiudere il cassetto dello strumento con attenzione. IMPORTANTE! Non spegnere lo Strumento StepOne dopo una sessione. Lo strumento entra automaticamente in una modalità di ibernazione quando non è in uso. Per ulteriori informazioni sullo scaricamento dello Strumento StepOne, accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 63

86 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Rimozione della piastra di reazione e trasferimento dei dati Selezione di un metodo di trasferimento dei dati Trasferire l'esperimento al computer per l'analisi secondo il layout del Sistema StepOne : Layout Descrizione Vedere... Co-locato Indipendente (collegato in rete) Indipendente (di base) Il cavo del Sistema StepOne collega il computer allo Strumento StepOne. Il computer e lo Strumento StepOne sono collegati alla stessa rete. Il computer e lo Strumento StepOne non sono collegati. Trasferimento dati colocati qui di seguito Monitoraggio remoto a pagina 59 Monitoraggio indipendente a pagina 62 Trasferimento dati co-locati Trasferimento dati da remoto Se il computer è collegato direttamente allo Strumento StepOne attraverso il cavo del Sistema StepOne, non è necessaria alcuna azione. Il software StepOne trasferisce automaticamente i dati dell'esperimento allo Strumento StepOne dopo l'esecuzione. Se il computer e lo Strumento StepOne sono collegati alla stessa rete Ethernet, scaricare l'esperimento dallo Strumento StepOne attraverso la rete: 1. Nel software StepOne, fare clic su Download Experiment from Instrument (Scarica l'esperimento dallo strumento). 2. Nella finestra di dialogo Download Experiment from Instrument (Scarica l'esperimento dallo strumento), selezionare Select Instrument (Seleziona strumento) <NomeStrumento>. 3. Selezionare Experiment (Esperimento) Genotyping_Example (Esempio di ). 4. Nel campo Download File To (Scarica file su), fare clic su Browse (Sfoglia), selezionare una cartella per ricevere i dati dell'esperimento, quindi fare clic su Select (Seleziona). 5. Fare clic su Download Experiment (Scarica esperimento) per scaricare l'esperimento dallo Strumento StepOne al computer attraverso la rete

87 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Rimozione della piastra di reazione e trasferimento dei dati 6. Quando segnalato, fare clic su OK per chiudere la verifica. 6 Trasferimento dati indipendente Se il computer non è collegato allo Strumento StepOne, utilizzare l'unità USB per trasferire l'esperimento allo Strumento StepOne : 1. Qualora non sia già stato fatto, collegare una unità USB alla porta USB. o 2. Sfiorare il touchscreen dello Strumento StepOne per attivarlo, quindi sfiorare. 3. Nel Main Menu (Menu principale), sfiorare Collect Results (Acquisisci risultati) per salvare i dati in una unità USB. Se lo Strumento StepOne non riconosce l'unità USB, sfiorare OK, attendere 30 sec, quindi sfiorare nuovamente Collect Results (Acquisisci risultati). 4. Una volta eseguito il trasferimento dei dati, sfiorare OK. 5. Rimuovere l'unità USB dallo Strumento StepOne, quindi collegarla alla porta USB del computer. 6. Nel desktop del computer, utilizzare Esplora risorse di Windows per aprire l'unità USB. 65

88 Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento Rimozione della piastra di reazione e trasferimento dei dati 7. Copiare il file Genotyping Example.eds in <unità>:\applied Biosystems\StepOne System\experiments dove <unità> rappresenta la directory di installazione del software StepOne. 66

89 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Questo capitolo comprende i paragrafi: Descrizione generale Apertura dell'esperimento per l'analisi Visulizzazione del Plot di discriminazione allelica Visualizzazione del layout di piastra Visualizzazione tabella Well (Pozzetto) Visualizzazione del riepilogo CQ Visualizzazione del Plot dei dati non elaborati Visualizzazione del Plot multicomponente Visualizzazione Plot di amplificazione Visualizzazione delle impostazioni di analisi Pubblicazione dei dati Nota: Per ulteriori informazioni sugli argomenti trattati in questa guida, accedere alla voce Help (Guida) nel software del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System premendo F1, facendo clic su nella barra degli strumenti oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 67

90 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Descrizione generale Descrizione generale Questo capitolo spiega come visualizzare, analizzare e pubblicare l'esperimento analizzato. Flusso di lavoro Come valutare i risultati Avvio dell'esperimento Disegno dell'esperimento (Capitolo 2) Preparazione delle reazioni (Capitolo 3) Esecuzione dell'esperimento (Capitolo 4) Analisi dell'esperimento (Capitolo 5) 1. Visulizzazione del Plot di discriminazione all elica. 2. Visualizzazione del layout di piastra. 3. Visualizzazione della tabella Well (Pozzetto). 4. Visualizzazione del riepilogo CQ. 5. Visualizzazione del Plot dei dati non elaborati. 6. Visualizzazione del Plot multicomponente. 7. Visualizzazione del Plot di amplificazione. 8. Visualizzazione delle impostazioni di analisi. 9. Pubblicazione dei dati. Fine dell'esperimento La rivisualizzazione dei risultati avviene in tre passaggi: 1. Eseguire una rivisualizzazione iniziale del Plot di discriminazione allelica (vedere pagina 70), del layout di piastra (vedere pagina 74) e della tabella pozzetto (vedere pagina 77) per valutare le richieste di genotipi da parte del software StepOne. 2. Eseguire una revisione accurata del riepilogo CQ (vedere pagina 80) per valutare i campioni che hanno attivato gli indicatori CQ. Rivedere i dati non elaborati (vedere pagina 82) e i dati di amplificazione (vedere pagina 86) per i campioni che mostrano amplificazione anormale. 3. Se necessario, definire le impostazioni di analisi (vedere pagina 91) oppure modificare le richieste manualmente (vedere pagina 95). Dopo aver valutato i risultati, è possibile pubblicare i risultati come spiegato in Pubblicazione dei dati a pagina

91 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Apertura dell'esperimento per l'analisi Apertura dell'esperimento per l'analisi Prepararsi per l'analisi aprendo l'esperimento. Informazioni sui dai dell'esempio Apertura dell'esperimento L'esperimento di esempio si trova in: <unità>:\applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples dove <unità> indica il disco rigido del computer sul quale è stato installato il software StepOne. L'unità predefinita di installazione è l'unità C. 1. Nel software StepOne, fare clic su Open (Apri). 2. Selezionare Genotyping Example.eds. 3. Fare clic su Open (Apri) Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni, accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 69

92 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visulizzazione del Plot di discriminazione allelica Visulizzazione del Plot di discriminazione allelica Eseguire una rivisualizzazione iniziale dei risultati nel Plot di discriminazione allelica, che contrasta la fluorescenza normalizzata del colorante reporter (R n ) per le sonde specifiche per l'allele del saggio SNP. Vedere Lettura e analisi delle piastre a pagina 6 per una descrizione completa del plot. Informazioni sui dai dell'esempio Rivisualizzazione del plot Per l'esperimento di esempio, verificare che il Plot di discriminazione allelica visualizzi: Cluster per i tre possibili genotipi (omozigote allele 1, omozigote allele 2 ed eterozigote allele 1/2) Un cluster per i controlli negativi 1. Nel pannello di navigazione, selezionare Allelic Discrimination Plot (Plot di discriminazione allelica). 2. Selezionare C _30 dal menu SNP Assay (Saggio SNP). Se viene abilitato l'autocaller, il Plot di discriminazione allelica visualizza i simboli degli alleli per ogni campione valutato per l'snp selezionato. I campioni vengono raggruppati nel plot come segue: Simbolo Vengono raggruppati sul I genotipi dei campioni sono (rosso) Asse X del plot Omozigote per l'allele 1 del saggio SNP selezionato. (blu) Asse Y del plot Omozigote per l'allele 2 del saggio SNP selezionato. (verde) (nero) Nel mezzo tra i cluster omozigoti Angolo in basso a sinistra del plot Eterozigoti per entrambi gli alleli del saggio SNP selezionato (allele 1 e allele 2). Un controllo negativo. (nero) Dovunque nel plot Indeterminati. Qualora l'autocaller sia non abilitato, il Plot di discriminazione allelica visualizza un simbolo a forma di X ( Indeterminato) per ogni campione. 3. Per ogni cluster nel plot: a. Fare clic e trascinare una casella intorno al cluster per selezionare i pozzetti assocati nel layout di piastra e nella tabella pozzetto. b. Verificare che i pozzetti voluti vengano selezionati nella tabella pozzetto. Ad esempio, nel caso venga selezionato il cluster nell'angolo in basso a sinistra del plot, è possibile selezionare unicamente i controlli negativi. La presenza tra i controlli negativi di un controllo negativo non noto può indicare la mancata riuscita dell'amplificazione del campione. 70

93 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visulizzazione del Plot di discriminazione allelica c. Ripetere i passaggi 3a e 3b per tutti gli altri cluster nel plot. Elemento Menu a discesa SNP Assay (Saggio SNP) Menu a discesa Plot Type (Tipo di plot) Menu a discesa Apply Call (Applica richiesta) Barra degli strumenti Legenda Descrizione Determina i dati del saggio SNP che il software StepOne visualizza nel plot. Determina il tipo di plot (cartesiano o polare) che il software StepOne utilizzerà per la visualizzazione dei dati. Quando un datapoint viene selezionato, questo menu consente l'assegnazione di una richiesta di un allele al datapoint all'interno dello scatterplot. Contiene strumenti per intervenire sullo scatterplot: Seleziona i datapoint facendo clic sui singoli datapoint oppure facendo clic e trascinando una casella intorno a un gruppo di datapoint. Seleziona i datapoint racchiudendoli in una circonferenza. Riposiziona lo scatterplot. Ingrandisce lo scatterplot. Rimpicciolisce lo scatterplot. Un chiarimento sui simboli presenti nello scatterplot. La figura qui di seguito indica il Plot di discriminazione allelica dell'esperimento di esempio. 71

94 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visulizzazione del Plot di discriminazione allelica 2 3b 3a Linee guida analisi Per analizzare il proprio esperimento: Verificare che tutti i controlli presentino il genotipo corretto. Nel caso si utilizzino controlli positivi, verificare le richieste per i controlli positivi: a. Nella tabella pozzetti, selezionare i pozzetti contenenti un controllo positivo per evidenziare i datapoint corrispondenti nel Plot di discriminazione allelica. b. Verificare che i datapoint per i controlli positivi siano raggruppati lungo l'asse appropriato del plot. Ad esempio, se viene selezionato l'allele 1 controllo positivo/allele 1, i controlli si raggrupperanno lungo l'asse X. c. Ripetere i passaggi a e b per i pozzetti contenenti gli altri controlli positivi. Visualizzare il cluster dei controlli negativi per i campioni non noti la cui amplificazione sia non riuscita: a. Selezionare i datapoint del cluster nell'angolo in basso a sinistra del Plot di discriminazione allelica per selezionare le righe corrispondenti della tabella pozzetti. b. Verificare che i pozzetti selezionati nella tabella pozzetti siano controlli negativi e non campioni non noti. 72

95 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visulizzazione del Plot di discriminazione allelica È possibile che i campioni raggruppati con i controlli negativi: Non contengano DNA Contengano inibitori della PCR Siano omozigotici per una soppressione di sequenza Verificare i risultati dei campioni non raggruppati in senso stretto o raggruppati con controlli negativi sottoponendoli nuovamente al test. Se viene selezionato di eseguire reazioni di replicati, rivedere con cautela i gruppi di dati per gli outlier per verificare l'accuratezza delle richieste di genotipi. Se sono presenti outlier, verificare i risultati dei campioni associati sottoponendoli nuovamente al test. Osservare il numero dei cluster nel plot. Se il Plot di discriminazione allelica contiene meno dei tre cluster di genotipi rappresentativi (eterozigotico, allele 1 omozigotico e allele 2 omozigotico), è possibile che il software StepOne non abbia la capacità di eseguire la dei campioni fino all'abilitazione della funzione 2-Cluster Calling. Se il plot contiene meno di tre cluster: a. Fare clic su Analysis Settings (Impostazioni di analisi). b. Fare clic su Edit Default SNP Assay Settings (Impostazioni modifica saggio SNP predefinito). c. Selezionare 2-Cluster Calling Enabled (2-Cluster Calling abilitata), quindi fare clic su Save Changes (Salva modifiche). d. Fare clic su Apply Analysis Settings (Applica impostazioni di analisi). e. Fare clic su Reanalyze (Rianalizza) per rianalizzare l'esperimento utilizzando la funzione 2-Cluster Calling. Nota: Le visualizzazioni dei risultati sono sincronizzate. Ad esempio, selezionando un pozzetto nel layout di piastra vengono selezionati i dati corrispondenti nella tabella pozzetti e nel Plot di discriminazione allelica. Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sul Plot di discriminazione allelica, accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 73

96 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione del layout di piastra Visualizzazione del layout di piastra Rivedere i risultati dell'esperimento nel layout di piastra. Il layout di piastra visualizza l'impostazione specifica per il saggio e le proprietà di analisi per l'esperimento in un formato dei pozzetti corrispondente al tipo di piastra di reazione utilizzata per l'esecuzione. Informazioni sui dai dell'esempio Per l'esperimento di esempio, verificare che il software StepOne abbia richiesto: 6 campioni come omozigotici allele 1 ( ) 4 campioni come omozigotici allele 2 ( ) 12 campioni come eterozigotici ( ) 2 campioni come controlli negativi ( ) Verificare che nessun pozzetto della piastra di reazione abbia attivato indicatori CQ. Visualizzazione del layout 1. Fare clic sulla icona accanto al plot di discriminazione allelica per aumentare al massimo il layout di piastra. 2. Fare clic su Show in Wells (Visualizza nei pozzetti), quindi selezionare o deselezionare un parametro da visualizzare con i pozzetti. 3. Ripetere il passaggio 2 fino a quando il layout di piastra contenga tutti i parametri desiderati. Parametro Nome campione Operazione Nome saggio SNP ID saggio Allele 1 / Allele 2 Coloranti allele 1 / Coloranti allele 2 Colore saggio SNP Colore campione / Colore operazione Descrizione Il nome del campione applicato al pozzetto. L'operazione assegnata al pozzetto: Non nota Controllo negativo Controllo positivo Il nome dell'snp valutato per il pozzetto. Il numero di ID del saggio dell'snp valutato per il pozzetto. Il nome dell'allele associato per l'snp valutato per il pozzetto. Il nome dei coloranti reporter e quencher dell'allele associato per l'snp valutato per il pozzetto. Il colore dell'snp valutato per il pozzetto. Il colore del campione o dell'operazione applicato al pozzetto. 74

97 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione del layout di piastra Parametro Richiesta genotipo La richiesta di allele assegnata al campione: Omozigotico 1/1 Omozigotico 2/2 Eterozigotico 1/2 Controllo negativo Indeterminata Descrizione Indicatore Il numero di indicatori attivati dal pozzetto come elencato nel simbolo. La figura seguente indica il layout di piastra dell'esperimento di esempio di Linee guida analisi Per analizzare il proprio esperimento: Il layout di piastra visualizza nell'angolo in basso a sinistra dei pozzetti omessi dall'utente; visualizza inoltre nell'angolo dei pozzetti omessi dalle impostazioni degli indicatori CQ. Notare la posizione di alcuni campioni che attivano gli indicatori CQ ( ). La comprensione della posizione degli errori è di aiuto nella diagnosi di eventuali attività non riuscite. 75

98 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione del layout di piastra È possibile selezionare l'intera piastra di reazione, alcune aree della piasra di reazione oppure pozzetti specifici: Fare clic sull'angolo superiore sinistro della piastra di reazione per selezionare tutti i 48 pozzetti. Fare clic sul tasto sinistro del mouse e trascinare attraverso l'area per effettuare la selezione. Selezionare Sample (Campione), Target (Target) oppure Task (Operazione), dal menu Select Items (Seleziona voci) nella scheda View Plate (Visualizza piastra). Quindi selezionare il nome del campione, del target o dell'attività nel secondo menu Select Items (Seleziona voci) per selezionare pozzetti di un tipo specifico utilizzando lo strumento di selezione pozzetti. È possibile regolare il layout di piastra: Utilizzare i bottoni (Ingrandire), (Rimpicciolire) e (Adattare tutti) per aumentare o diminuire i pozzetti visualizzati. Utilizzare le schede con freccia per espandere il layout di piastra fino a occupare l'intera schermata. Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sul layout di piastra accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 76

99 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione tabella Well (Pozzetto) Visualizzazione tabella Well (Pozzetto) Rivedere i dettagli dei risultati dell'esperimento nella tabella pozzetti e identificare eventuali pozzetti con indicatori. La tabella pozzetti visualizza l'impostazione specifica per il saggio e le proprietà di analisi per l'esperimento in un formato tabella. Informazioni sui dai dell'esempio Rivisualizzazione della tabella Per l'esperimento di esempio, verificare che nessun pozzetto della piastra di reazione abbia attivato indicatori CQ. 1. Selezionare la scheda View Well Table (Visualizza tabella pozzetto). 2. Fare clic sull'intestazione della colonna Flag (Indicatore) per ordinare i dati in modo che i pozzetti che hanno attivato indicatori vengano visualizzati nella parte superiore della tabella. 3. Verificare l'integrità dei controlli: a. Nel menu Group By (Raggruppa per), selezionare Task (Operazione) per organizzare le righe della tabella in base alla loro funzione sulla piastra di reazione. b. Verificare che ogni controllo non visualizzi indicatori ( ). c. Fare clic sulle icone per eliminare i controlli negativi e positivi. 4. Fare clic su > accanto alla tabella View Well (Visualizza pozzetto) per visualizzare il Plot di discriminazione allelica e la tabella pozzetti simultaneamente. La figura qui di seguito indica la tabella pozzetti dell'esperimento di esempio di a 2 3c 3c 3c 3b Pozzetto Omissione Colonna La posizione del pozzetto sulla piastra di reazione. Descrizione Un check mark indica che il pozzetto è stato rimosso dall'analisi. Indicatore Un indica che il pozzetto ha attivato il numero di indicatori elencati all'interno del simbolo. Nome campione Il nome del campione. 77

100 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione tabella Well (Pozzetto) Colonna Nome saggio SNP ID saggio Operazione Allele 1 / 2 Colranti allele 1 / 2 Allele 1 / 2 R n Rif pass Richiesta Qualità(%) Metodo Commenti Allele 1 / 2 C T Il nome del saggio SNP valutato per il pozzetto. Descrizione Il numero di ID del saggio dell'snp valutato per il pozzetto. L'operazione assegnata al pozzetto (Non noto, controllo negativo o controllo positivo). Il nome dell'allele associato per l'snp valutato per il pozzetto. Il nome dei coloranti reporter e quencher dell'allele associato per l'snp valutato per il pozzetto. Segnale normalizzato (R n ) del colorante reporter dell'allele associato per l'snp valutato per il pozzetto. Il segnale del colorante di riferimento passivo per il pozzetto. La richiesta di allele assegnata al campione, dove possibili richieste sono: Omozigotico 1/1 Omozigotico per l'allele 1 Omozigotico 2/2 Omozigotico per l'allele 2 Eterozigotico 1/2 - Eterozigotico Controllo negativo Indeterminata Il valore di qualità calcolato per la richiesta di genotipo. Il metodo utilizzato per assegnare la richiesta al campione (Auto se assegnato dal software StepOne oppure Manual se applicato da un utente). Commenti immessi per il pozzetto del campione associato. Ciclo soglia (C T ) del campione per l'allele associato per l'snp valutato per il pozzetto. Colonne indicatori CQ La tabella pozzetti visualizza le colonne per gli indicatori CQ che sono attivati dai dati sperimentali. Se i dati dell'esperimento non attivano un indicatore CQ, il software StepOne non visualizza una colonna corrispondente per l'indicatore. Un in una delle seguenti colonne indica che il pozzetto associato ha attivato l'indicatore. BADROX Il pozzetto ha prodotto un segnale di riferimento passivo maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi. OFFSCALE Il pozzetto ha prodotto un livello di fluorescenza maggiore di quello misurabile dal Sistema StepOne. NOSIGNAL CLUSTER# PCFAIL SMCLUSTER AMPNC NOAMP Il pozzetto non ha prodotto un livello rilevabile di fluorescenza. Per l'snp valutato per il pozzetto, il numero di cluster generati dai dati dell'esperimento è maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi. Il controllo positivo non produce un R n per l'allele associato maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi il che indica che l'amplificazione non è riuscita. Il numero dei datapoint nel cluster associato è minore del limite definito nelle impostazioni di analisi. Il pozzetto ha prodotto un R n maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi il che indica possibile amplificazione. Il pozzetto non ha prodotto un R n per l'allele maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi il che indica possibile mancata amplificazione. 78

101 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione tabella Well (Pozzetto) Colonna Descrizione NOISE SPIKE EXPFAIL BLFAIL THOLDFAIL CTFAIL La fluorescenza di background (noise) prodotta dal pozzetto è maggiore di quella prodotta dagli altri pozzetti sulla piastra di reazione di un fattore maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi. Il Plot di amplificazione per il pozzetto contiene uno o più datapoint incompatibili con gli altri punti nel plot. Il software non è in grado di identificare la regione esponenziale del Plot di amplificazione per il pozzetto. Il software non è in grado di calcolare la linea di base più appropriata per i dati per il pozzetto. Il software non è in grado di calcolare una soglia per il pozzetto associato. Il software non è in grado di calcolare un ciclo soglia (C T ) per il pozzetto associato. Linee guida analisi Per analizzare il proprio esperimento: Nel caso si utilizzino controlli positivi, verificare anche l'integrità dei controlli positivi: a. Nel menu Group By (Raggruppa per), selezionare Task (Operazione) per organizzare le righe della tabella in base alla loro funzione sulla piastra di reazione b. Verificare che i controlli positivi non visualizzino indicatori ( ) e che la loro fluorescenza normalizzata del colorante reporter (R n ) sia appropriata per il genotipo (ad esempio, se si valuta l'allele 1/allele 1 di controllo positivo, è lecito attendere un aumento significativo dell'r n per la sonda dell'allele 1 e un aumento molto modesto per la sonda dell'allele 2). c. Ripetere il passaggio b per ogni controllo positivo. Rivedere i dati per i campioni non noti. Per ogni riga che visualizza nella colonna indicatori, osservare i dati e gli indicatori attivati dal pozzetto associato. Selezionare le aree della tabella o i pozzetti di un tipo specifico: Facendo clic sul tasto sinistro del mouse e trascinando attraverso l'area per effettuare la selezione. Selezionando Sample (Campione), Target o Task (Operazione) nel menu Select Items (Seleziona voci) nella scheda View Table (Visualizza tabella), quindi selezionando il nome del campione, del target o dell'operazione dal secondo menu Select Items (Seleziona voci) per selezionare i pozzetti di un tipo specifico utilizzando lo strumento di selezione pozzetti. Raggruppare le righe del layout di piastra selezionando una opzione dal menu Group By (Raggruppa per). È possibile restringere o espandere l'elenco sia facendo clic sull'icona +/- posta accanto ai singoli elenchi sia facendo clic su Collapse All (Restringi tutti) o Expand All (Espandi tutti). 79

102 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione del riepilogo CQ Omettere un pozzetto dall'analisi selezionando la casella di controllo Omit (Ometti) relativa a quel pozzetto. Per includere il pozzetto nell'analisi, deselezionare la casella di controllo Omit (Ometti). Nota: È necessario rianalizzare l'esperimento ogni volta si ometta o si includa un pozzetto. Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sulla tabella pozzetti accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). Visualizzazione del riepilogo CQ Rivedere il riepilogo degli indicatori CQ attivati dai dati dell'esperimento e risolvere i problemi relativi agli indicatori. Il riepilogo CQ visualizza una frequenza e una posizione per tutti gli indicatori CQ. Se un indicatore non compare nell'esperimento, la sua frequenza è 0. Se la frequenza non è 0, l'indicatore compare nella posizione del pozzetto elencata nella colonna posizioni. Facendo clic su un indicatore vengono visualizzati i dettagli relativi all'indicatore stesso, incluso un elenco di tutti i pozzetti con indicatori. Informazioni sui dati dell'esempio Rivisualizzazione del riepilogo Poichè l'esperimento di esempio non attiva alcun indicatore CQ ( ), la figura qui di seguito si riferisce a un esperimento diverso in cui i pozzetti che hanno attivato l'indicatore NOREPORTER. 1. Nella colonna di navigazione, selezionare QC Summary (Riepilogo CQ). 2. Rivedere il riepilogo indicatori e osservare il numero dei pozzetti che hanno attivato indicatori.. 3. Nel riepilogo Flag Details (Dettagli indicatori), selezionare l'indicatore NOREPORTER. 4. Rivedere le informazioni dettagliate visualizzate per l'indicatore NOREPORTER. 5. Fare clic su View NOREPORTER Troubleshooting Information (Visualizza informazioni risoluzione problemi NOREPORTER) per visualizzare le informazioni relative alla risoluzione problemi per l'indicatore. La figura qui di seguito indica il riepilogo CQ per un esperimento di con indicatori. 80

103 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione del riepilogo CQ Linee guida analisi Per analizzare il proprio esperimento: Selezionare ogni indicatore CQ nei Dettagli Indicatori con frequenza maggiore di 0, rivedere la frequenza e la posizione dei pozzetti che hanno attivato l'indicatore CQ, quindi fare clic sul link per la risoluzione problemi relativa all'indicatore. Nota: Quando viene selezionato un indicatore nella tabella Flag Details (Dettagli indicatori), la tabella pozzetti evidenzia i pozzetti che hanno attivato l'indicatore. Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sugli indicatori CQ, accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 81

104 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione del Plot dei dati non elaborati Visualizzazione del Plot dei dati non elaborati Se necessario, rivedere il Plot dei dati non elaborate per rilevare le irregolarità negli spettri non elaborati acquisite dallo Strumento StepOne. Il Plot dei dati non elaborati visualizza l'ampiezza della fluorescenza non elaborata acquisita in ogni canale (da 1 a 3) durante il ciclo di esecuzione indicato dal cursore Show Cycle (Indica ciclo). Il plot visualizza gli spettri non elaborati per i pozzetti selezionati nel layout di piastra o nella tabella pozzetti. Informazioni sui dati dell'esempio Rivisualizzazione del plot Nell'esperimento di esempio, rivedere la schermata Raw Data Plot (Plot dati non elaborati) per osservare un aumento stabile del segnale (nessun cambiamento brusco o flessione) dal filtro appropriato. 1. Nel pannello di navigazione, selezionare Raw Data Plot (Plot dati non elaborati). 2. Nella tabella pozzetti, selezionare i pozzetti che si desidera ispezionare. 3. Trascinare il cursore Show Cycle (Indica ciclo) per visualizzare modifiche temporali in ogni filtro del profilo dei dati non elaborati. I filtri del sistema StepOne sono: Filtro Colorante Colorante FAM Colorante SYBR Green Colorante JOE Colorante ROX Colorante VIC 82

105 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione del Plot dei dati non elaborati La figura qui di seguito indica i dati non elaborati dell'esperimento di esempio di Linee guida analisi Per ulteriori informazioni Per analizzare il proprio esperimento, ricercare in ogni filtro: Crescita caratteristica del segnale Assenza di cambiamenti bruschi o flessioni Per ulteriori informazioni sul Plot dei dati non elaborati, accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 83

106 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione del Plot multicomponente Visualizzazione del Plot multicomponente Il Plot multicomponente visualizza il contributo spettrale completo di ogni colorante in un pozzetto selezionato per tutta la durata della sessione di analisi PCR. Informazioni sui dati dell'esempio Visualizzazione del Plot multicomponente Nell'esperimento di esempio, rivedere il Plot multicomponente per: Colorante ROX (riferimento passivo) Colorante FAM (reporter) Picchi, flessioni e/o cambiamenti repentini Amplificazione nei pozzetti di controllo negativo 1. Nella colonna di navigazione, selezionare Multicomponent Plot (Plot multicomponente). 2. Selezionare un solo pozzetto nel layout di piastra per visualizzare i dati corrispondenti nel Plot multicomponente. 3. Nel menu a discesa Plot Color (Colore plot), selezionare Dye (Colorante). 4. Fare clic su Show/Hide the plot legend (Mostra/Nascondi la legenda del plot). 5. Controllare i segnali dei coloranti FAM e VIC. Nell'esperimento di esempio, i segnali dei coloranti FAM e VIC aumentano durante il processo PCR, il che indica una amplificazione normale. 6. Controllare il segnale del colorante ROX. Nell'esperimento di esempio, il segnale del colorante ROX si mantiene costante durante il processo PCR, il che indica dati tipici. 7. Selezionare i pozzetti di controllo negativo uno alla volta e controllare l'amplificazione. Nell'esperimento di esempio, non è presente amplificazione nei pozzetti di controllo negativo. 84

107 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione del Plot multicomponente Linee guida analisi Per ulteriori informazioni Per analizzare il proprio esperimento, ricercare: Riferimento passivo Il livello di fluorescenza del colorante di riferimento passivo deve mantenersi relativamente costante durante il processo PCR. Colorante reporter Il livello di fluorescenza del colorante reporter deve visualizzare un'area piana in corrispondenza della linea di base, seguita da un rapido aumento della fluorescenza con il procedere dell'amplificazione. Eventuali irregolarità nel segnale Non devono essere presenti picchi, flessioni e/o cambiamenti repentini nel segnale fluorescente. Pozzetti di controllo negativi Non deve essere presente amplificazione nei pozzetti di controllo negativo. Per ulteriori informazioni sul Plot multicomponente accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 85

108 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione Plot di amplificazione Visualizzazione Plot di amplificazione Nel caso siano stati acquisiti dati in tempo reale per l'esperimento, rivedere i dati di amplificazione per comprendere con maggiore chiarezza gli indicatori attivati dai dati dell'esperimento. La schermata Amplification Plot (Plot di amplificazione) visualizza l'amplificazione di tutti i campioni nei pozzetti selezionati. Utilizzare i plot di amplificazione per verificare i risultati dell'esperimento. Rn rispetto al ciclo Il R n è la grandezza del segnale di fluorescenza normalizzato generato dalla sessione di analisi PCR e dai dati relativi a esso viene calcolato il C T. Questo plot visualizza il R n come funzione del numero di cicli. È possibile utilizzare questo plot per identificare ed esaminare l'amplificazione non regolare e per visualizzare i valori soglia e linea di base per la sessione di analisi. Rn rispetto al ciclo L'R n rappresenta la fluorescenza del colorante reporter normalizzata. Questo plot visualizza il R n come funzione del numero di cicli. È possibile utilizzare questo plot per l'identificazione e l'esame dell'amplificazione non regolare. C T rispetto al pozzetto Il ciclo soglia (C T ) è il numero di cicli PCR al quale il livello di fluorescenza raggiunge la soglia. Questo plot visualizza C T come funzione della posizione del pozzetto. È possibile utilizzare questo plot per localizzare l'amplificazione anomala (outlier). È possibile visualizzare ciascun plot con le seguenti modalità grafiche: lineare oppure log10. Nota: Per ulteriori informazioni sui Plot di amplificazione, fare riferimento alla Guida della chimica Real-Time PCR Systems Chemistry Guide oppure alla Guida software StepOne software Help. Informazioni sui dati dell'esempio Rivisualizzazione dei risultati Nell'esperimento di esempio, rivedere il Plot di amplificazione per: Valori corretti della linea di base e della soglia Outlier 1. Nella colonna di navigazione, selezionare Amplification Plot (Plot di amplificazione). 2. Nel Plot di amplificazione: a. Nel menu a discesa Plot Type (Tipo plot), selezionare Rn rispetto al ciclo. b. Nel menu a discesa Color Plot By (Plot colore da), selezionare Well (Pozzetto). c. Fare clic su Show/Hide the plot legend (Mostra/Nascondi la legenda del plot). 86

109 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione Plot di amplificazione 3. Visualizzare i valori della linea di base: a. Nel menu a discesa Graph Type (Tipo grafico), selezionare Linear (Lineare). b. Selezionare Baseline (Linea di base) per visualizzare il ciclo di avvio e quello finale. c. Verificare che la linea di base sia impostata correttamente. 4. Visualizzare i valori soglia: a. Nel menu a discesa Graph Type (Tipo grafico), selezionare Log (Logaritmico). b. Nel menu a discesa Target, selezionare C _30-A. c. Selezionare Threshold (Soglia) per visualizzare la soglia. d. Verificare che la soglia sia impostata correttamente. Nell'esperimento di esempio, la soglia si trova nella fase esponenziale. 5. Localizzare eventuali outlier: a. Nel menu a discesa Plot Type (Tipo plot), selezionare C T vs Well (Ct rispetto al pozzetto). b. Verificare che i pozzetti dei replicati presentino amplificazioni simili. L'esperimento di esempio non utilizza i pozzetti dei replicati. 87

110 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione Plot di amplificazione 2 1 Linee guida analisi Per analizzare il proprio esperimento, ricercare: Valori linea di base e soglia corretti Il software StepOne calcola automaticamente i valori della linea di base e della soglia ipotizzando che i dati presentino una curva di amplificazione tipica. Una curva di amplificazione tipica presenta: Fase di plateau (a) Fase lineare (b) Fase esponenziale (geometrica) (c) Background (d) Linea di base (le linee di base non indicate vengono calcolate per ogni singola curva) 88

111 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione Plot di amplificazione a b Soglie c R n d IMPORTANTE! È possibile che l'errore sperimentale (come contaminazione oppure errori di pipettaggio) possa produrre curve di amplificazione atipiche che generano calcoli errati dei valori della linea di base e della soglia eseguiti dal software StepOne. Quindi, dopo il completamento dell'analisi, Applied Biosystems raccomanda l'esame della schermata Amplification Plot (Plot di amplificazione) e la rivisualizzazione dei valori di linea di base e di soglia per ogni pozzetto. Per ulteriori informazioni, vedere la Guida software StepOne software Help. Outlier Nel caso l'esperimento non sia conforme alle linee guida di cui sopra, risolvere il problema come segue: Regolare manualmente la linea di base e/o la soglia (vedere la Guida software StepOne software Help). oppure Omettere un pozzetto facendo clic sul pulsante destro sul pozzetto nel layout di piastra e selezionando Omit (Ometti). 89

112 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione Plot di amplificazione Come visualizzare plot multipli simultaneamente I plot multipli visualizzano fino a quattro plot per una analisi simultanea. È possibile visualizzare ogni plot singolarmente, due plot come righe o colonne oppure tutti i plot in una matrice 2 2. Per rivedere i risultati nei plot multipli: 1. Nella colonna di navigazione, selezionare Multiple Plots View (Visualizza plot multipli). 2. Fare clic su per visualizzare due plot in parallelo. 3. Nel plot superiore, selezionare Amplification Plot (Plot di amplificazione) ( R n rispetto al ciclo) per visualizzare i risultati della sessione di amplificazione per ogni pozzetto selezionato nel layout di piastra. 4. Nel plot inferiore, selezionare Raw Data Plot (Plot dei dati non elaborati) per visualizzare i dati non elaborati per ogni pozzetto selezionato nel layout di piastra

113 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione delle impostazioni di analisi Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sul Plot di amplificazione o sulla visualizzazione dei plot multipli accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). Visualizzazione delle impostazioni di analisi Nel caso non si sia soddisfatti della modalità con la quale il software StepOne richiede i genotipi o le soglie degli indicatori CQ, rivedere e regolare le impostazioni di analisi e/o le richieste come necessario. Informazioni sui dati dell'esempio Modifica delle impostazioni di analisi Nell'esperimento di esempio, rivedere e regolare le impostazioni di analisi come desiderato per imparare le modalità in cui le impostazioni di richiesta, del C T e degli indicatori contribuiscono all'analisi dei dati di. 1. Nell'esperimento, fare clic su Analysis Settings (Impostazioni di analisi). 2. Selezionare C _30 dalla tabella Select a SNP Assay (Seleziona un saggio SNP). 3. Fare clic su Edit Default Settings (Modifica impostazioni predefinite). 4. Nel caso siano state eseguite richieste manuali, selezionare Keep Manual Calls from Previous Analysis (Mantieni richieste manuali dall'analisi precedente) nella casella di dialogo Edit Default SNP Assay Settings (Modifica impostazioni saggi SNP predefinite). 5. Nel campo Quality Value (Valore qualità), immettere un valore percentuale per applicarlo come intervallo di qualità per i campioni autocalling. A un valore maggiore corrisponde una richiesta di alleli più rigorosa. 6. Fare clic su Save Changes (Salva modifiche) per salvare le impostazioni. 7. Regolare le impostazioni del C T : a. Selezionare la scheda Ct Settings (Impostazioni Ct). b. Selezionare l'allele A dalla tabella Select an Allele (Seleziona un allele), quindi deselezionare Use Default Settings (Utilizza impostazioni predefinite), c. Deselezionare Automatic Threshold (Soglia automatica), quindi immettere un nuovo valore di soglia. d. Deselezionare Automatic Baseline (Linea di base automatica), quindi immettere nuovi valori della linea di base. e. Ripetere i passaggi 7b fino a 7d per l'allele C. Nota: Per ulteriori informazioni sull'impostazione dei cicli soglia per le esecuzioni di, vedere la Guida software StepOne software Help. 91

114 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione delle impostazioni di analisi 8. Regolare le impostazioni degli indicatori: a. Selezionare la scheda Flag Settings (Impostazioni indicatori). b. Nella colonna Use (Utilizza), selezionare la casella di controllo di ogni indicatore che si vuole abilitare. c. Regolare i valori per gli indicatori abilitati come necessario. d. Nel caso si desideri un indicatore CQ abilitato per omettere automaticamente i pozzetti che risultino positivi per le condizioni definite, selezionare la casella di controllo Reject Well (Rifiuta pozzetto) per l'indicatore. Nota: Gli indicatori CQ consentono di segnalare condizioni e omettere pozzetti in base a criteri ben definiti (ad esempio, quando un pozzetto presenta dati mancanti). Per ulteriori informazioni, vedere la Guida software StepOne software Help. 9. Fare clic su Apply Analysis Settings (Applica impostazioni di analisi). 10. Fare clic su Reanalyze (Rianalizza) per analizzare i dati utilizzando le nuove impostazioni. La figura qui di seguito indica le impostazioni di analisi per l'esperimento di esempio di. 92

115 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione delle impostazioni di analisi Linee guida analisi Per ulteriori informazioni Per analizzare il proprio esperimento: Nel caso l'esperimento consista in due soli cluster, attivare l'algoritmo di richiesta 2- Cluster selezionando 2-Cluster Calling Enabled (Richiesta 2-Cluster abilitata) dalla finestra di dialogo Edit Default SNP Assay Settings (Modifica impostazioni SNP predefinite). Le impostazioni C T sono disponibili solo per esperimenti che includono dati di amplificazione. Gli esperimenti che consistono unicamente in letture pre-pcr e post-pcr non utilizzano il sistema del ciclo soglia (C T ) per l'analisi. È possibile richiedere i dati dei campioni: Automaticamente, utilizzando l'autocaller (vedere pagina 94) Manualmente, utilizzando la barra degli strumenti e lo scatterplot (vedere pagina 95) Per ulteriori informazioni sulle impostazioni di analisi, accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 93

116 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione delle impostazioni di analisi Assegnazione richieste automatica 1. Nell'esperimento, fare clic su Analysis Settings (Impostazioni di analisi). 2. Selezionare il saggio SNP desiderato dalla tabella Select a SNP Assay (Seleziona un saggio SNP). 3. Fare clic su Edit Default SNP Assay Settings (Modifica impostazioni saggio SNP predefinito). 4. Nel caso siano state eseguite richieste automatiche, selezionare Keep Manual Calls from Previous Analysis (Mantieni le richieste manuali dalla precedente analisi). 5. Selezionare Autocaller Enabled (Autocaller abilitato) per attivare l'analisi automatica. 6. Se si prevede che i dati analizzati consistano unicamente in due cluster, selezionare Richiesta 2-Cluster abilitata. 7. Nel campo Quality Value (Valore qualità), immettere un valore percentuale per applicarlo come intervallo di qualità per i campioni autocalling. (A un valore maggiore corrisponde una richiesta di alleli più rigorosa.) 8. Fare clic su Save Changes (Salva modifiche) per salvare le impostazioni. 9. (Opzionale) Assegnare gli indicatori: a. Selezionare la scheda Flag Settings (Impostazioni indicatori). b. Assegnare gli indicatori come desiderato. Nota: Nella assegnazione degli indicatori, è possibile segnalare condizioni e omettere pozzetti in base a criteri ben definiti (ad esempio, quando un pozzetto presenta dati mancanti). Per ulteriori informazioni, vedere la Guida software StepOne software Help. c. Fare clic su Apply Analysis Settings (Applica impostazioni di analisi) per chiudere la finestra di dialogo Analysis Settings (Impostazioni di analisi). 10. Fare clic su Reanalyze (Rianalizza) per analizzare i dati utilizzando le nuove impostazioni. 94

117 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione delle impostazioni di analisi Assegnazione richieste manuale 1. Nell'esperimento, fare clic su Analysis Settings (Impostazioni di analisi). 2. Selezionare il saggio SNP desiderato dalla tabella Select a SNP Assay (Seleziona un saggio SNP). 3. Specificare le impostazioni di analisi dell'evidenziatore: a. Fare clic su Edit Default SNP Assay Settings (Modifica impostazioni saggio SNP predefinito). b. Deselezionare l'autocaller abilitato. c. Fare clic su Save Changes (Salva modifiche) per salvare le impostazioni. 4. (Opzionale) Assegnare gli indicatori: a. Selezionare la scheda Flag Settings (Impostazioni indicatori). b. Assegnare gli indicatori come desiderato. Nota: Nella assegnazione degli indicatori, è possibile segnalare condizioni e omettere pozzetti in base a criteri ben definiti (ad esempio, quando un pozzetto presenta dati mancanti). Per ulteriori informazioni, vedere la Guida software StepOne software Help. c. Fare clic su Apply Analysis Settings (Applica impostazioni di analisi). 5. Fare clic su Reanalyze (Rianalizza) per analizzare i dati utilizzando le nuove impostazioni. 6. Nella colonna di navigazione, selezionare Allelic Discrimination Plot (Plot di discriminazione allelica). 7. Selezionare un evidenziatore dal menu saggi SNP. Simboli a forma di X ( Indeterminato) che rappresentano l'evidenziatore selezionato vengono visualizzati nel Plot di discriminazione allelica. 8. Per assegnare richieste: a. Fare clic su (strumento di selezione). b. Fare clic-trascinare una casella intorno ai datapoint desiderati nel plot. c. Nel menu Apply Call (Applica richiesta), selezionare la richiesta desiderata. d. Ripetere i passaggi 8b e 8c per applicare le richieste ai datapoint rimanenti. 9. Nel caso siano in atto richieste di assegnazione per SNP multipli, selezionare un evidenziatore differente dal menu a discesa dei saggi SNP e ripetere il passaggio 8. 95

118 Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Pubblicazione dei dati Pubblicazione dei dati È possibile pubblicare i dati dell'esperimento in numerosi modi: Salvare il plot come un file immagine Stampare il plot Stampare il layout di piastra Creare diapositive Stampare un rapporto Esportare i dati Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sulla pubblicazione dei dati, accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 96

119 Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi L'appendice comprende: Flusso di lavoro impostazione avanzata Flusso di lavoro avvio rapido Flusso di lavoro del templato Flusso di lavoro esportazione/importazione Nota: Per ulteriori informazioni sugli argomenti trattati in questa guida, accedere alla voce Help (Guida) nel software del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System premendo F1, facendo clic nella barra degli strumenti oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne). 97

120 Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi Flusso di lavoro impostazione avanzata Flusso di lavoro impostazione avanzata Una volta acquisita familiarità con l'utilizzo del software StepOne, è possibile utilizzare il flusso di lavoro avanzato per creare esperimenti di senza l'aiuto del Design Wizard. Informazioni sull'impostazione avanzata Come creare un esperimento L'impostazione avanzata consolida la maggior parte delle operazioni eseguite dal Design Wizard. L'impostazione avanzata consente di oltrepasare la maggior parte del Capitolo 2, che spiega come creare un esperimento utilizzando il Design Wizard. 1. Nella schermata home del software StepOne, fare clic su sotto la colonna Setup (Imposta) 2. Fare clic su Advanced Setup (Impostazione avanzata). 3. Immettere le proprietà per l'esperimento di esempio: a. Fare clic sul campo Experiment Name (Nome esperimento), quindi immettere Genotyping Example (Esempio ). b. Fare clic sul campo Barcode (Codice a barre), quindi immettere Example (Esempio). c. Fare clic sul campo User Name (Nome utente), quindi immettere Example User (Utente esempio). d. Fare clic sul campo Comments (Commenti), quindi immettere Genotyping Getting Started Guide (Guida introduttiva ). e. Selezionare Genotyping (Genotipizzazione) per il tipo di esperimento. f. Selezionare TaqMan Reagents (Reagenti TaqMan) per i reagenti. g. Selezionare Standard (~2 ore per il completamento di un'esecuzione) per la velocità di rampa. h. Selezionare Pre-PCR Read and Amplification (Lettura e amplificazione pre-pcr) per aggiungere le fasi al metodo di esecuzione. 98

121 Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi Flusso di lavoro impostazione avanzata 3a 3b 3c 3d 3e 3f 3g 3h 4. Nella colonna di nvigazione, fare clic su Plate Setup (Imposta piastra). 5. Creare il saggio rs8039 SNP al layout di piastra: a. Fare clic su Create New SNP Assay (Crea nuovo saggio SNP). b. Fare clic sul campo SNP Assay Name (Nome saggio SNP), immettere rs8039. c. Fare clic su OK. 99

122 Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi Flusso di lavoro impostazione avanzata 6. Impostare i non noti: a. Nel layout di piastra, selezionare le righe A e B. b. Nell'elenco SNP Assays (Saggi SNP), selezionare la casella di controllo Assign (Assegna) per il saggio SNP rs8039 per applicare il saggio ai pozzetti selezionati. c. Fare clic sul menu a discesa Task (Attività) per il saggio SNP rs8039, quindi selezionare Unknown (Non nota) per applicare l'attività ai pozzetti selezionati. 7. Nel layout di piastra, selezionare i pozzetti A1 e A2. 8. Fare clic sul menu a discesa Task (Attività) per il saggio SNP rs8039, quindi selezionare Negative Control (Controllo negativo) per applicare l'attività ai pozzetti selezionati. 9. Creare e applicare i campioni al layout di piastra: a. Fare clic su Create New Sample (Crea nuovo campione) ripetutamente fino a quando l'elenco Samples (Campioni) contenga 20 campioni. b. Nel layout di piastra, selezionare il pozzetto A4. c. Selezionare la casella di controllo Assign (Assegna) per il campione 1 per applicare il saggio al campione nel pozzetto selezionato. d. Ripetere i passaggi da 9b a 9c per applicare i campioni come mostrato qui di seguito. 100

123 Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi Flusso di lavoro impostazione avanzata 5 7 6b 6c/8 9b 9a 9c 10. Nella colonna di navigazione, fare clic su Run Method (Metodo di esecuzione), quindi impostare il metodo di esecuzione: a. Fare clic sul volume/pozzetto di reazione, quindi immettere 25. b. Fare clic sulla lettura Pre-PCR (Fase di attesa), fare clic su Add Stage (Aggiungi fase), quindi selezionare Holding (Attesa). c. Selezionare la prima fase (50 C/00:02:00) della nuova attesa, quindi fare clic su Delete Selected (Cancella selezionate) per cancellare la fase extra. d. Fare clic sul campo Number of Cycles (Numero di cicli) della fase ciclica, quindi immettere 50. e. Fare clic sull'impostazione della temperatura del primo passaggio della fase ciclica (95 C/00:00:15), quindi immettere 92 C. 101

124 Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi Flusso di lavoro impostazione avanzata 10a 10b 10c 10d 10e 11. Fare clic su Save (Salva), quindi fare clic su Save (Salva) nella finestra di dialogo Save Experiment (Salva esperimento) per salvare l'esperimento col nome di Genotyping Example.eds. 12. Preparare le reazioni come spiegato nel Capitolo 3, "Preparazione delle reazioni," a pagina Eseguire l'esperimento come spiegato nel Capitolo 4, "Esecuzione dell'esperimento," a pagina Analizzare l'esperimento come spiegato nel Capitolo 5, "Analisi dell'esperimento," a pagina

125 Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi Flusso di lavoro avvio rapido Flusso di lavoro avvio rapido Quando viene creato un esperimento di utilizzando l'avvio rapido, è possibile eseguire le reazioni sullo strumento senza immettere alcuna informazione di impostazione della piastra di reazione. Infomazioni sull'impostazione di avvio rapido Come creare un esperimento Il software StepOne include una modalità di avvio rapido che consente di oltrepassare gran parte del Capitolo 2. Nel caso le attività richieste per l'impostazione di un esperimento siano adeguate alle proprie esigenze, considerare l'utilizzo dell'avvio rapido per eseguire gli esperimenti immediatamente e modificare tali attività in seguito. 1. Preparare le reazioni come spiegato nel Capitolo 3, "Preparazione delle reazioni," a pagina Nella schermata Home, fare clic su QuickStart (Avvio rapido). 3. Immettere le proprietà per l'esperimento di esempio: a. Fare clic sul campo Enter Experiment Name (Immetti nome esperimento), quindi immettere Genotyping Example (Esempio ). b. Selezionare Genotyping (Genotipizzazione) per il tipo di esperimento. c. Selezionare TaqMan Reagents (Reagenti TaqMan) per i reagenti. d. Selezionare Standard (~2 ore per il completamento di un'esecuzione) per la velocità di rampa. e. Selezionare Pre-PCR Read and Amplification (Lettura e amplificazione pre-pcr) per aggiungere le fasi al metodo di esecuzione. 103

126 Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi Flusso di lavoro avvio rapido 3a 3b 3c 3d 3e 4. Selezionare la scheda Run Method (Metodo di esecuzione), quindi impostare il metodo di esecuzione: a. Fare clic sul volume/pozzetto di reazione, quindi immettere 25. b. Fare clic sulla lettura Pre-PCR (Fase di attesa), fare clic su Add Stage (Aggiungi fase), quindi selezionare Holding (Attesa). c. Selezionare la prima fase (50 C/00:02:00) della nuova attesa, quindi fare clic su Delete Selected (Cancella selezionate) per cancellare la fase extra. d. Fare clic sul campo Number of Cycles (Numero di cicli) della fase ciclica, quindi immettere 50. e. Fare clic sull'impostazione della temperatura del primo passaggio della fase ciclica (95 C/00:00:15), quindi immettere 92 C. 104

127 Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi Flusso di lavoro avvio rapido 4a 4b 4c 4d 4e 5. Preparare le reazioni come spiegato nel Capitolo 3, "Preparazione delle reazioni," a pagina Caricare le reazioni nel Sistema StepOne come spiegato in Caricamento della piastra di reazione a pagina Nel software StepOne, fare clic su START RUN (AVVIA ESECUZIONE). Mentre è in atto l'esecuzione da parte del Sistema StepOne, impostare il layout di piastra come spiegato nei passaggi 8 attraverso Mentre è in atto l'esecuzione della piastra da parte del Sistema StepOne, fare clic su Plate Layout (Layout piastra) nella colonna di navigazione. 9. Creare il saggio SNP rs8039 al layout di piastra: a. Fare clic su Create New SNP Assay (Crea nuovo saggio SNP). b. Fare clic sul campo SNP Assay Name (Nome saggio SNP), immettere rs8039. c. Fare clic su OK. 105

128 Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi Flusso di lavoro avvio rapido 10. Impostare i non noti: a. Nel layout di piastra, selezionare le righe A e B. b. Nell'elenco SNP Assays (Saggi SNP), selezionare la casella di controllo Assign (Assegna) per il saggio SNP rs8039 per applicare il saggio ai pozzetti selezionati. c. Fare clic sul menu a discesa Task (Attività) per il saggio SNP rs8039, quindi selezionare Unknown (Non nota) per applicare l'attività ai pozzetti selezionati. 11. Nel layout di piastra, selezionare i pozzetti A1 e A Fare clic sul menu a discesa Task (Attività) per il saggio SNP rs8039, quindi selezionare Negative Control (Controllo negativo) per applicare l'attività ai pozzetti selezionati. 13. Creare e applicare i campioni al layout di piastra: a. Fare clic su Create New Sample (Crea nuovo campione) ripetutamente fino a quando l'elenco Samples (Campioni) contenga 20 campioni. b. Nel layout di piastra, selezionare il pozzetto A4. c. Selezionare la casella di controllo Assign (Assegna) per il campione 1 per applicare il saggio al campione nel pozzetto selezionato. d. Ripetere i passaggi da 13a a 13c per applicare i campioni come mostrato qui di seguito. 106

129 Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi Flusso di lavoro avvio rapido 9a 11 10b 10c/ 12 13b 13a 13c 14. Mentre è in atto il completamento dell'esecuzione da parte del Sistema StepOne, analizzare l'esperimento come spiegato nel Capitolo 5, "Analisi dell'esperimento," a pagina

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