Distribuzione ed effetti di microinquinanti nell'area circostante il complesso industriale CHIMET basata sull'utilizzo di bioindicatori

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1 Università degli Studi di Siena DIPARTIMENTO DI SCIENZE AMBIENTALI G. Sarfatti Via Mattioli, 4, Siena, Italy Tel Fax Distribuzione ed effetti di microinquinanti nell'area circostante il complesso industriale CHIMET basata sull'utilizzo di bioindicatori Convenzione sottoscritta dall'azienda USL 8 di Arezzo e l'università degli Studi di Siena, Dipartimento di Scienze Ambientali G.Sarfatti in data 21 febbraio 2011, per attività di ricerca nel settore del biomonitoraggio ambientale mediante organismi animali e vegetali (approvata rispettivamente dalla Direzione Generale con deliberazione n. 572 del 06/12/2010 e dal Consiglio di Amministrazione del 21/12/2010) Relazione Tecnico Scientifica Gruppo di Ricerca Dr. Nicola Bianchi Dr.ssa Stefania Ancora Dr. Tommaso Campani Dr.ssa Ilaria Caliani Dr.ssa Silvia Casini Responsabile Scientifico Prof. Claudio Leonzio

2 Indice generale PREMESSA...2 INTRODUZIONE...3 Obbiettivi del progetto...6 MATERIALI E METODI...7 Campionamento...7 Attività analitiche...8 Determinazione degli elementi in tracce...8 Attività etossiresorufina-o-deetilasi (EROD)...9 Determinazione delle porfirine...10 Comet assay...11 ENA (Erythrocytes nuclear abnormalities) assay...11 Determinazione della DIOSSINA e dei PCB-DIOSSINA-simili in Podarcis sicula 12 Elaborazione statistica e cartografia...12 RISULTATI...14 ELEMENTI IN TRACCE FOGLIE di Quercus pubescens...14 ELEMENTI IN TRACCE (Podarcis sicula)...24 BIOMARKER - Attività MFO...27 BIOMARKER - Porfirine...29 BIOMARKER di genotossicità...31 CARTOGRAFIA Elementi in tracce...32 DIOSSINE e PCB-DIOSSINA-simili nelle carcasse di Podarcis sicula...34 CONCLUSIONI...38 BIBLIOGRAFIA...41 ALLEGATI

3 PREMESSA L'azienda USL 8 di Arezzo e l'università degli Studi di Siena, Dipartimento di Scienze Ambientali G.Sarfatti, in data 21 febbraio 2011, hanno sottoscritto una convenzione per attività di ricerca nel settore del biomonitoraggio ambientale mediante organismi animali e vegetali (approvata rispettivamente dalla Direzione Generale con deliberazione n. 572 del 06/12/2010 e dal Consiglio di Amministrazione del 21/12/2010). La ricerca oggetto della convenzione, intitolata Distribuzione ed effetti di microinquinanti nell'area circostante il complesso industriale CHIMET basata sull'utilizzo di bioindicatori, si è articolata nelle differenti fasi previste dal progetto: mappatura degli elementi in tracce mediante bioindicatori vegetali biomonitoraggio sugli organismi animali elaborazione statistica dei risultati, definizione della distribuzione dei contaminanti, degli effetti e del pericolo potenziale sull'ambiente. L'accordo per lo svolgimento della ricerca è stato integrato con un ADDENDUM che prevedeva: analisi delle diossine ad alta risoluzione nei campioni di Podarcis sicula, presso un laboratorio provvisto di certificazione europea UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005; una ulteriore verifica dei principali dati ottenuti nell anno 2010 con l aggiunta di una stazione integrativa nell area di Tegoleto. Lo stato avanzamento delle ricerche è stato periodicamente presentato dal referente scientifico Prof. Claudio Leonzio nelle riunioni del Gruppo Tecnico per lo studio mirato su Civitella ed Arezzo presso il Dipartimento di Prevenzione, nonché negli incontri con gli Amministratori con i Comitati locali che si sono susseguiti. La presente relazione conclusiva delle attività svolte si riferisce alle ricerche complessivamente effettuate comprensive, quindi, anche di quanto indicato nell'addendum. La ricerca è stata realizzata in collaborazione con il gruppo di lavoro del Dipartimento di Scienze Ambientali: Dr Nicola Bianchi, Dr.ssa Stefania Ancora, Dr. Tommaso Campani, Dr.ssa Ilaria Caliani, Dr.ssa Silvia Casini. 2

4 INTRODUZIONE Effetti dei microinquinanti sulle comunità naturali: bioindicatori e biomarker I contaminanti ambientali (naturali e di sintesi, quali IPA, diossine, metalli pesanti, PCBs) si distribuiscono nei vari comparti ambientali in funzione delle loro caratteristiche chimicofisiche, causando modificazioni che si ripercuotono sulla componente biologica. Attraverso l utilizzo di organismi animali e vegetali è possibile ottenere indicazioni sul livello di contaminazione di un determinata area. Questi organismi prendono il nome di bioindicatori che vengono definiti come tutti gli organismi che mediante reazioni identificabili (biochimiche, fisiologiche, morfologiche ecc.) forniscono informazioni sulla qualità dell ambiente (o di una parte di esso) mentre vengono definiti bioaccumulatori: tutti quegli organismi che assimilano dal suolo, dall acqua o dall atmosfera quantità misurabili di elementi chimici e/o composti xenobiotici (Bargagli, 1998). Gli organismi bioindicatori e bioaccumulatori, per descrivere quantitativamente lo stress ambientale a cui sono sottoposti, vengono selezionati in base al loro ruolo ecologico e alle caratteristiche dei contaminanti. In presenza di una fonte di contaminazione puntiforme, come nel caso di questo progetto, vengono selezionate specie con un home range limitato (scarsa mobilità), facile identificazione sistematica ed ampia distribuzione nell area di studio. I modelli diffusionali, basandosi sullo studio delle caratteristiche chimico-fisiche delle molecole inquinanti, permettono una valutazione delle concentrazione teoriche delle sostanze e indicano quali comparti saranno interessati dal trasporto e dall accumulo dei contaminanti. La valutazione dei contaminanti bioaccumulati dagli organismi bioindicatori, permette una validazione in vivo dei modelli diffusionali mostrando che le previsioni teoriche si riferiscono effettivamente ad un fenomeno reale, oltre a permettere una valutazione degli effetti biologici che si manifestano sugli organismi. La moderna tossicologia ambientale, per affrontare queste problematiche, ha gradualmente affiancato alle indagini di "biomonitoring", basate sulla stima dei livelli di residui negli organismi "bioindicatori, un nuovo approccio metodologico basato sulla valutazione delle risposte che possono essere date da un organismo, una popolazione o una comunità naturale in seguito ad uno stress chimico ambientale. Ciascuna di queste risposte, comunemente definite come "biomarker", rappresenta un segnale integrato del 3

5 livello di contaminazione di una determinata area e, di conseguenza, costituisce un indicatore del livello di rischio tossicologico a cui una determinata popolazione naturale può essere sottoposta (Bayne et al., 1976; Payne et al., 1977; McCarthy et al., 1990). Depledge & Fossi (1994) hanno definito i biomarker come quella variazione biochimica, cellulare, fisiologica, o comportamentale, che può essere misurata in un tessuto, in un fluido biologico o a livello dell intero organismo (individuo o popolazione) che da evidenza di esposizione e/o effetto ad uno o più composti inquinanti e/o radiazioni. Quando un composto tossico penetra in un ecosistema, sia questo terrestre, marino o di acqua dolce, può provocare una serie di alterazioni o danni a diversi livelli strutturali che, seguendo la complessità dell'organizzazione gerarchica, vanno dal danno molecolare alle alterazioni a livello di popolazione e comunità. La tossicità primaria di un contaminante si esercita, in linea generale, a livello biochimico e molecolare (modificazioni di attività enzimatiche, alterazioni a livello del DNA), successivamente gli effetti si possono riscontrare, con un meccanismo a cascata, ai livelli successivi dell'organizzazione gerarchica: cellula, tessuto, organismo, popolazione. Le diverse risposte che l'organismo genera nei confronti dell'insulto chimico rappresentano quindi potenziali biomarker utilizzabili in indagini ecotossicologiche. L'obiettivo di tale metodologia è quindi quello di prevedere e, di conseguenza, evitare eventi inaccettabili a livello ecologico. Infatti l'utilizzo di biomarker, attraverso lo studio di risposte immediate (induzione sistemi detossificanti, inibizioni enzimatiche, danni al DNA), permette di prevedere il verificarsi di effetti negativi a lungo termine (cancerogenesi, alterazioni patologiche, diminuzione delle capacità riproduttive) (McCarthy et al., 1990). I vantaggi dell'utilizzo di tale approccio metodologico rispetto ai convenzionali metodi di biomonitoraggio vengono riportati di seguito: i biomarker forniscono una risposta "integrata" dell'esposizione complessiva della specie bioindicatrice, considerando la sommatoria sia delle diverse vie di assunzione che dell'esposizione nel tempo entro un determinato range spaziale; i biomarker forniscono una risposta "integrata" dell'insieme delle interazioni tossicologiche e farmacologiche della miscela di composti a cui e' sottoposto l'organismo "sentinella"; i biomarker forniscono una risposta immediata all'esposizione al tossico; questo dato permette di prevedere l'effetto negativo a lungo termine; 4

6 i biomarker possono potenzialmente indicare l'effetto ecologico a lungo termine di un contaminante a seconda che l'organismo risulti esposto oppure no. In sintesi un organismo bioindicatore: - permette di misurare i livelli dei contaminanti persistenti bioaccumulati negli organismi, fornendo un dato integrato in termini spazio-temporali dell input tossicologico dell area oggetto di studio. - fornisce, attraverso l applicazione di biomarker, dati relativi alle attività enzimatiche attivate o inibite da gruppi specifici di inquinanti, alla formazione di metaboliti, allo sviluppo di danni più o meno reversibili a livello di DNA, cellulare o istologico. Per questo studio pilota sullo stato di contaminazione dell area circostante il complesso industriale CHIMET, è stato scelto un set di biomarkers che investigasse i possibili effetti dal livello molecolare fino a livello cellulare: - per la valutazione della presenza e biotrasformazione di composti liposolubili (ad esempio IPA, TCDDs, PCB) è stata scelta l attività del CYP1A1, misurata tramite il test della etossiresorufina-o-deetilasi (EROD). - Le concentrazioni delle porfirine epatiche sono state utilizzate come biomarker di esposizione a diversi contaminanti ambientali come PCB (policlorobifenili), pesticidi organoclorurati e organofosforici, diossine, metalli pesanti e IPA. - i biomarker di genotossicità sono stati utilizzati (Comet assay ed ENA assay) per permettere la valutazione del danno al DNA a livello molecolare e/o cromosomico che può essere causato da IPA, PCB, diossine, metalli pesanti, dai ROS, dalle radiazioni UV provenienti dal sole e dai raggi X e gamma. In ogni comparto ambientale interessato da un fenomeno di contaminazione è quindi possibile reperire specie adatte alla bioindicazione e su di questi quantificare i livelli di contaminazione (bioaccumulo) e le risposte precoci (biomarker) ai vari livelli di complessità, da quello molecolare fino agli effetti sulle comunità. 5

7 Obbiettivi del progetto L area di studio di questo progetto è costituita dalla zona circostante il complesso industriale CHIMET situato nel comune di Civitella val di Chiana a meno di 1 km dalla frazione di Badia al Pino. La CHIMET realizza processi di recupero ed affinazione di metalli preziosi da materiale di risulta delle attività industriali, principalmente nel settore orafo, ma anche provenienti da altre attività (marmitte catalitiche, catalizzatori esausti, bagni galvanici, radiografie ecc.,). L impianto con le sue varie fasi di recupero, in particolare il processo pirometallurgico, rappresenta la fonte puntiforme potenziale di diffusione di gruppi di microinquinanti (diossine, idrocarburi clorurati, metalli pesanti). Obiettivo della ricerca è stato quindi la realizzazione in questa area di una serie di indagini preliminari, basate sull utilizzo di organismi bioindicatori, per verificare: la distribuzione dei contaminanti negli organismi scelti come bioindicatori (Podarcis sicula e Quercus pubescens) al fine valutare possibili fenomeni di accumulo ed individuare elementi traccianti della fonte potenziale di emissione; gli effetti degli stessi contaminanti in specie selezionate (Podarcis sicula) attraverso l utilizzo di biomarker di esposizione e di effetto; la magnitudine degli effetti in funzione della distanza dalla fonte potenziale di emissione ed eventualmente identificare altre origini degli effetti registrati (traffico veicolare, industrie limitrofe, centri abitati). 6

8 MATERIALI E METODI Campionamento Il campionamento dei lacertidi (Podarcis sicula) e delle foglie di quercia (Quercus pubescens) è stato effettuato nell area compresa da nord e sud tra Fusatone Molin Bianco e Monte San Savino e da est a ovest tra Civitella Val di Chiana e Cellaio, nei mesi di ottobre e novembre 2010; inoltre, a seguito di quanto stabilito nell'addendum, è stato realizzato un secondo campionamento nel 2011 (Figura 1). Figura - 1. Punti di campionamento della Qurcus pubescens e stazioni di campionamento della Podarcis sicula. Il 60% dei campioni di foglie di quercia (n=23) sono stati prelevati nell area limitrofa allo stabilimento CHIMET compresa tra i centri abitati di Badia al Pino, Tegoleto, Pieve al Toppo e Viciomaggio. La distribuzione delle stazioni dei campioni di foglie risulta descritta da una ellisse più esterna, ed un altra prossima all impianto ed orientata secondo i venti 7

9 dominanti. Gli altri punti più vicini allo stabilimento CHIMET sono gli stessi utilizzati precedentemente da ARPAT per le analisi del suolo. I lacertidi sono stati campionati in cinque stazioni, due in prossimità dello stabilimento nei pressi dei centri abitati di Badia al Pino e Tegoleto, gli altri 3 in diverse tipologie di aree (collina e pianura) a diverse distanze dallo stabilimento, presso Civitella Val di Chiana, Monte San Savino e Frassineto. Inoltre è stato effettuato un campionamento di lacertidi all interno della Montagnola senese (Eremo di Lecceto - Siena) utilizzati come individui di controllo. Le foglie venivano campionate mediante forbici per potatura ad asta telescopica ad una altezza di 4m dalla superficie del suolo, e conservate in buste di polietilene. Le lucertole venivano catturate vive mediante aste con cappio a lenza, trasferite in contenitori frigo ad una temperatura di 7-8 C e trasportate in laboratorio. Successivamente gli animali venivano anestetizzati con dietiletere, e, dopo aver rilevato i parametri morfometrici, venivano sacrificati tramite decapitazione. Due gocce di sangue venivano immediatamente raccolte in una provetta Eppendorf e mantenute a 4 C con eparina mentre una goccia veniva stesa su di un vetrino per la valutazione del test ENA. Dopo queste operazioni veniva effettuata la dissezione: immediatamente veniva asportato e pesato, siglato il fegato e posto in azoto liquido per la conservazione. La carcassa dell animale opportunamente siglata è stata posta in congelatore a -20 C per l analisi degli elementi in tracce e delle diossine. Attività analitiche Determinazione degli elementi in tracce Mineralizzazione del campione Metodo EPA 3052 (modificato) - Mineralizzazione in forno a microonde Aliquote di circa 0,4 g di campioni (carcasse di Podarcis sicula e foglie di Quercus pubescens) liofilizzati ed omogenizzati, vengono poste all interno di contenitori in teflon. In seguito si aggiungono 8 ml di acido nitrico (HNO 3 ) ed 2 ml di perossido di idrogeno (H 2 O 2 ) per la mineralizzazione, i contenitori con controllo della temperatura vengono poi caricati in appositi rotori in teflon e trasferiti in forno a microonde. Si ottengono così soluzioni limpide che vengono trasferite in Falcon (50ml) e portate ad un volume finale di 40 ml. Su 8

10 queste soluzioni si effettuavano le analisi di Oro, Argento, Mercurio, Rame, Cadmio, Piombo, Zinco, Palladio, Platino, Molibdeno, Cobalto, Nichel, Cromo, Vanadio, Alluminio, Ferro, e Manganese. In ogni serie di analisi veniva inserita una prova in bianco (blank) per poter verificare la purezza dei reagenti e sei prove di materiali standard di riferimento vegetali (Tomato, n. 1573, Apple, n e Peach n. 1547) e animali (Mussel TissueSRM 2976 e Bovine Liver SRM 1577b) con concentrazioni certificate dal Community Bureau of Reference per verificare il grado di accuratezza delle analisi. Per il calcolo delle concentrazioni dei metalli è stato utilizzato il metodo delle aggiunte interne: ad uguali aliquote dello stesso campione venivano aggiunte quantità crescenti di una soluzione contenente i metalli da analizzare in concentrazioni note. Strumenti utilizzati nell analisi degli elementi in tracce: fornetto di grafite (spettrofotometro ad assorbimento atomico Analytik Jena Contra 700) per oro, argento, cadmio, piombo, zinco, palladio, platino, molibdeno, cobalto, nichel, cromo e vanadio. tecnica del vapore freddo (spettrofotometro ad assorbimento atomico Perkin Elmer Fims 400) per il mercurio. spettrometro ad emissione (ICP-Plasma Perkin Elmer Plasma 5100DV) per rame, manganese, ferro e alluminio. Attività etossiresorufina-o-deetilasi (EROD) Per ogni campione di fegato è stata pesata un aliquota di 50 mg di tessuto a cui è stata aggiunta una quantità di tampone saccarosio 0,25 M (ph 7,5), corrispondente a 4 ml di tampone/g tessuto. Ciascuna aliquota, mantenuta in ghiaccio, è stata omogenata in Potter (10 passaggi a 440 giri/min). L omogenato ottenuto è stato quindi centrifugato per 20 minuti a 9000 giri a 4 C; il pellet ottenuto (frazione mitocondriale e nucleare) è stato eliminato, mentre il sovranatante (frazione S9) utilizzato per l EROD. La valutazione dell attività EROD è stata misurata nella frazione S9 (fegato di spigola o omogenato di gambusia), in accordo con la metodica elaborata da Lubet et al. (1985) che quantifica, tramite lettura fluorimetrica, la trasformazione dell etossiresorufina (substrato specifico) in resorufina. In cuvette di quarzo è stata posta la seguente miscela di incubazione: - 2,13 ml di tampone TRIS HCl 50 mm, MgCl 2 25 mm (ph 7,5) 9

11 - 10 µl etossiresorufina (0,1 mg/ml) - 40 µl S9. La cuvetta di quarzo, contenente la miscela, è stata alloggiata nella cella di lettura (mantenuta a temperatura costante di 30 C) del fluorimetro (Perkin Elmer LS 50B: eccitazione 522 nm; emissione 586 nm). Dopo un intervallo di tempo variabile fra i 20 e i 40 sec, alla miscela sono stati aggiunti 10 µl di NADPH 125 µm che, essendo un donatore di elettroni, funge da start per la reazione enzimatica. Lo strumento registra la cinetica di reazione per i successivi 240 sec, e successivamente, calcola il delta di fluorescenza/min. I campioni sono stati analizzati in doppio e l attività EROD è stata espressa come pmol substrato min -1 mg prot -1, in relazione ad una curva standard di resorufina. Determinazione delle porfirine Per l analisi fluorimetrica delle porfirine è stato utilizzato il metodo di Grandchamp et al. (1980), che consente di misurare le concentrazioni singole di coproporfirine uroporfirine, e protoporfirine. I campioni (30-40 mg di tessuto epatico) sono stati pesati in provette in plastica ed aggiunta acqua distillata nel rapporto 1:10 (p/v). I campioni così diluiti sono stati omogenati con un Ultra Turrax T25 per 1 minuto ciascuno, mantenendoli in ghiaccio. Dopo tale operazione, 200 µl di ciascun campione sono stati trasferiti in provette da centrifuga insieme con 1,6 ml di una soluzione metanolo/acido perclorico 1N 50:50 ed agitati in vortex per 4 passaggi di 10 secondi ciascuno. I campioni, così trattati, sono stati lasciati al buio per 10 minuti, quindi centrifugati ad un basso numero di giri e il sovranatante ottenuto dalla centrifugazione pronto per la lettura fluorimetrica. Metodo di lettura di Grandchamp Il metodo di lettura di Grandchamp è basato sull utilizzo delle tre diverse coppie di lunghezza d onda di eccitazione e di emissione specifiche per ogni porfirina (coproporfirina , uroporfirina , protoporfirina ). Misurando l emissione di fluorescenza del sovrananante, tramite elaborazione con un software specifico che contiene le curve di calibrazione delle tre porfirine alle tre coppie di valori, è possibile calcolare le concentrazioni di ogni porfirina nella miscela. Il sovranatante è stato posto in una microcuvetta e misurato fluorimetricamente (Perkin-Elmer LS 50B). Prima dell inizio di questa operazione, è stato letto il bianco e gli standard delle porfirine. Gli standard delle porfirine sono stati acquistati presso la Porphyrin Product Inc (Logan, Utah, USA). Dopo il calcolo finale, le concentrazioni delle porfirine vengono espresse in pmol g tessuto

12 Comet assay Il test è stato eseguito seguendo il protocollo messo a punto da Caliani et al. (2009). I campioni di sangue sono stati centrifugati a 1000 giri per 10 min e il pellet ottenuto risospeso in agarosio (0,5% low-melting point agarosio, LMA) e disposto fra altri due strati di agarosio, uno inferiore di normal-melting point agarosio all 1% (NMA), e uno superiore di low-melting point agarosio (LMA) allo 0,5% su un vetrino da microscopio. I vetrini così preparati sono stati immersi in una soluzione di lisi (NaCl 2,5 M, Tris 10 mm, EDTA 0,1 M, DMSO 10%, Triton X-100 1%) per 1 h a 4 C. Al termine della lisi, i vetrini sono stati posizionati in una vasca elettroforetica orizzontale e immersi nel buffer freddo per elettroforesi alcalina (NaOH 10 N, EDTA 200 mm ph>12,1). I vetrini sono stati inizialmente lasciati nella soluzione di corsa per 10 min per favorire lo svolgimento del DNA (processo di unwinding), e dopo effettuata una corsa elettroforetica per 10 min, a 25 V e 300 ma. Dopo la corsa, i vetrini sono stati lavati tre volte con una soluzione neutralizzante (Tris-HCl 0,4 M), fissati in metanolo freddo per 3 min e lasciati asciugare all aria. Al momento della lettura, i vetrini sono stati colorati con una soluzione di Syber safe diluito 1:10000 in tampone TE (10mM Tris HCl ph 7.5 e 1mM EDTA ph 8.0) ed esaminati al microscopio a fluorescenza (Olympus BX41). Sono stati preparati due vetrini per ogni campione e analizzate 100 cellule per campione a 40 ingrandimenti. Il danno al DNA, quantificato come % di DNA nella coda, è stato misurato tramite un sistema computerizzato di analisi dell immagine (Komet 6.0 software, Kinetic Imaging Ltd.). ENA (Erythrocytes nuclear abnormalities) assay Come previsto dal metodo elaborato da Pacheco & Santos (1997), i vetrini sono stati fissati in metanolo per 10 min, subito dopo lo striscio di sangue e lasciati asciugare all aria. Poi sono stati immersi per 30 min in una soluzione contenente il colorante Giemsa diluito al 5% in tampone Sorensen (Na 2 HPO 4 H 2 O; KH 2 PO 4 50:50), quindi lavati per tre volte con acqua deionizzata e lasciati asciugare all'aria, pronti per la lettura. Alla lettura al microscopio ottico ad immersione (Olympus BX41), sono stati considerati solo gli eritrociti maturi, ossia le cellule dai contorni ben definiti, non sovrapposte ad altre, e con citoplasma non granuloso e non frammentato. Inoltre, per il conteggio dei micronuclei, nucleo e micronucleo dovevano essere ben separati. Sono state contate 1000 cellule per campione. La frequenza totale di anomalie è data dalla somma delle 4 tipologie di anomalie (espressa come frequenza ). 11

13 Le 4 anomalie sono mostrate nella figura accanto: 1. Nucleo kidney (piccola depressione da una parte del nucleo) 2. nucleo lobato (nucleo a forma di ameba o di cuore) 3. nucleo segmentato (nucleo strizzato in due parti connesse) 4. micronucleo. Eritrociti maturi con micronuclei e anomalie nucleari: nuclei kidney-shaped (A e B), nuclei lobati (C e D), nuclei segmentati e micronuclei (E ed F). Determinazione della DIOSSINA e dei PCB-DIOSSINA-simili in Podarcis sicula L'indagine preliminare sulle diossine e sui policlorobifenili, come previsto nell'addendum, ha interessato un numero di 6 campioni di pool di lacertidi relativi ad ognuna delle 6 stazioni utilizzate nel presente studio. Le analisi sono state effettuate dal Laboratorio CHELAB (TV) accreditato in conformità alla Norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005, che applica un sistema di gestione per la qualità secondo la Norma UNI EN ISO 9001:2008 e un sistema di gestione ambientale certificato UNI EN ISO 14001:2004. Per le determinazioni analitiche delle diossine e PCB-diossina-simili è stato utilizzato il metodo EPA 1668 C Per le dibenzodiossine/furani policlorurati (PCDD/PCDF) è stato utilizzato il metodo EPA 1613 B Elaborazione statistica e cartografia Per quanto riguarda queste attività sono stati inizialmente organizzati i dati in fogli elettronici e si è poi proceduto alla elaborazione grafica e di statistica descrittiva (grafici con valore medio e deviazione standard su barra di errore). L elaborazione complessiva dei dati è stata eseguita senza effettuare ipotesi a priori e basandosi sulle tecniche 12

14 statistiche esplorative (analisi chemiometrica) facendo particolare riferimento alla analisi multivariata (analisi delle componenti principali PCA). I dati ottenuti dall indagine esplorativa sono serviti per valutare le possibili associazioni tra i livelli degli elementi in tracce ed altre variabili mediante test di statistica inferenziale. L'elaborazione statistica inferenziale ha riguardato l'utilizzo della statistica non parametrica: Test U di Mann Whitney, analisi della varianza di Kruskal Wallis, correlazione per ranghi di Spearman e regressione lineare. Per quanto riguarda la cartografia si è proceduto inizialmente alla individuazione delle tipologie di informazione (geometriche, topologiche e informative), alla strutturazione del database relazionale ed inserimento dei dati prodotti. E' stato infine scelto l algoritmo per la creazione delle carte tematiche (metodo deterministico IDW) e si è proceduto alla produzione delle carte sulla distribuzione degli elementi di interesse nell'area di studio. Le elaborazioni statistiche sono state effettuate mediante i software Statistica 7 (StatSoft Inc.) e Graph Pad Prism 5 ( Software. Inc). Le elaborazioni cartografiche sono state realizzate mediante il software dedicato ArcGis versione 9.0 (ESRI) (Tipo licenza: ArcInfo ESRI Inc.) 13

15 RISULTATI ELEMENTI IN TRACCE FOGLIE di Quercus pubescens In Tabella 1 sono riportati per ciascun punto di campionamento i risultati relativi ai livelli degli elementi in tracce determinati nelle foglie di Quercus pubescens espressi in mg/kg di sostanza secca. Sono stati, in aggiunta, riportati i dati relativi alle distanze dei punti di campionamento dal camino dell impianto CHIMET, le quote (metri sul livello del mare) e le coordinate piane (UTM- Gaus Boaga). Nella suddetta Tabella non sono riportati i livelli di Mo, Au e Pt in quanto risultati al di sotto dei limiti di rilevabilità strumentale. Alcune considerazioni possono scaturire dal confronto tra i risultati ottenuti nelle foglie della roverella per il presente studio (Tabella 1) con i dati disponibili in letteratura. I livelli medi di Al, Cd, Cu, Fe, Ni, Pb, Zn, Cr e V concordano con quanto indicato nella stessa specie per un sito di controllo in Toscana non soggetto quindi a contaminazione da elementi in tracce (Bargagli et al., 2003). Questi livelli sono inoltre nello stesso range di quelli determinati nelle foglie di altre specie di quercia come il leccio (Q. cerris), la farnia (Q. robur), il rovere (Q. petrea), la quercia rossa (Q. rubra) e il leccio (Q. ilex) provenienti da aree scarsamente soggette a deposizione atmosferica da elementi in tracce (Bussotti et al. 1992; Kovàcs et al. 1994; Monaci e Bargagli 1997; Santamaria e Martin 1998; Monaci et al, 2000). I livelli di Mn (328 ± 224 mg/kg p.s.), sono molto variabili e, pur rimanendo nello stesso ordine di grandezza, risultano più elevati rispetto a quelli considerati come bakground nella roverella (260 ± 135 mg/kg p.s., Bargagli et al, 2003) e nella farnia (277 mg/kg p.s., Aboal et al, 2004). I livelli di Hg nelle stazioni di campionamento di Badia al Pino e Tegoleto sono circa 4 volte maggiori rispetto alle altre stazioni ed a quanto riportato in letteratura per la stessa specie come valori di background (Bargagli et al, 2003; Bussotti et al. 1992; Kovàcs et al. 1994; Monaci e Bargagli 1997; Santamaria e Martin 1998, Monaci et al 2000). Per quanto riguarda l'argento si può osservare un andamento simile a quello riscontrato per il mercurio, con i livelli più elevati nelle stazioni di Badia al Pino e Tegoleto. Per questo elemento non è stato possibile reperire dati di confronto per la roverella, ne per altre specie di quercia. I valori rilevati nelle suddette stazioni sono comunque particolarmente elevati se comparati con specie diverse dalla roverella come pino, frassino e betulla, riportate in alcuni lavori (Bargagli,1998; Reimann et al., 2007). 14

16 Tabella 1 - Livelli di litio, argento, cadmio, piombo, cromo, nichel, cobalto, vanadio, mercurio, zinco, alluminio, ferro, manganese e rame in mg/kg di sostanza secca in foglie di Quercus pubescens. Coordinate piane (UTM - Gaus Boaga), distanza del punto di campionamento dall impianto CHIMET e quote in metri. 15

17 La interpretazione dei dati, riportata di seguito, mira all individuazione delle possibili relazioni tra i livelli di elementi in tracce determinati nelle foglie e le fonti di emissione che coesistono nell area industriale della piana dell alta Val di Chiana, con particolare attenzione all impianto di recupero dei metalli preziosi CHIMET, un tipo di impianto industriale che prevede il trattamento e recupero di metalli preziosi oltre all'incenerimento di rifiuti provenienti da altre lavorazioni industriali. Nella interpretazione delle associazioni tra gli elementi in tracce in un area come questa, in cui coesistono zone agricole, industriali e urbane, il riferimento alle associazioni significative tra elementi e le varie fonti di inquinamento che si riscontrano in numerosi studi in letteratura, deve essere valutato con cautela. Molti elementi sono presenti in più sorgenti e, quindi, non tutti possono essere considerati traccianti univoci di una specifica fonte di inquinamento. Inoltre la concentrazione di alcuni elementi misurati nelle foglie non sono attribuibili esclusivamente ai fenomeni di deposizione atmosferica ma anche alla frazione dovuta al bioaccumulo della pianta nonché ai livelli degli elementi essenziali presenti nei tessuti vegetali. L esplorazione dell intera popolazione di dati mediante l analisi multivariata (analisi delle componenti principali PCA) ha evidenziato alcune associazioni tra gli elementi in esame (Figura 2). 16

18 A B C Figura 2 - Proiezione delle variabili (livelli degli elementi in tracce) sul piano dei fattori. Il gruppo delle componenti A è rappresentato da Zn, Ni, e Cr, elementi che generalmente in ambiente urbano derivano per lo più dal traffico veicolare. Il nichel ed il cromo vengono emessi soprattutto dai processi di combustione dei derivati del petrolio, mentre lo zinco deriva per la maggior parte dall abrasione degli pneumatici (Morawska and Zhang, 2002; Hjortenkrans et al., 2006). Il gruppo delle componenti del gruppo B (Fe, V, e Al), è formato da elementi caratteristici della litosfera e potrebbero derivare soprattutto dalle polveri che originano dal suolo. Il gruppo C è costituito dalle componenti del manganese, rame, cadmio, mercurio argento e piombo che mostrano una forte associazione (Figura 3). All interno di quest ultimo gruppo sono presenti elementi come il cadmio, il mercurio ed il rame che sono considerati traccianti dei processi di incenerimento dei rifiuti (Law e Gordon, 1979; Linak e Wendt, 1993; Morawska and Zhang, 2002; British Society for 17

19 Ecological Medicine, 2008). Per questo motivo su questo gruppo si sono effettuati approfondimenti per verificare l ipotesi di una origine da incenerimento. Figura 3 - Proiezione delle variabili (livelli degli elementi in tracce) sul piano dei fattori del gruppo C in Figura 2. La matrice di correlazione tra i livelli di questi elementi ha mostrato associazioni altamente significative che rafforzano l ipotesi di una origine comune (Tabella 2). Tabella 2 - Correlazioni significative (p<0.05) tra gli elementi appartenenti al gruppo C rappresentato in Figura 3. Spearman Rank Order Correlations N Spearman - R t(n-2) p-level Ag & Cd p<0.01 Ag & Pb p<0.01 Ag & Cu p<0.05 Cd & Pb p<0.01 Cd & Hg p<0.01 Pb & Hg p<0.01 Pb & Cu p<0.05 Hg & Ag p<

20 In particolare si è riscontrata una correlazione altamente significativa tra mercurio e argento (Correlazione di Spearman r=0.75; p<0.01). Considerando che tra i metalli preziosi l argento è quantitativamente più presente in natura e maggiormente utilizzato nelle varie applicazioni antropiche, si può ipotizzare che, nonostante i processi industriali di recupero dei metalli abbiano rendimenti molto elevati, esista comunque un fenomeno di emissione di questo elemento. Per verificare se effettivamente la sorgente emissiva sia l impianto CHIMET si è indagato sulla possibile esistenza di una relazione tra i livelli degli elementi indagati e la distanza dal punto di emissione dell impianto. Il risultato mostra correlazioni negative significative tra la distanza e i livelli di mercurio (Spearman Test r= -0.57; p<0.01), argento (Spearman Test r= ; p<0.01) e rame (Spearman Test r= -0.40; p<0.05). I test di regressione lineare multipla indicano associazioni significative tra la distanza e i livelli di argento (beta = -0.5; p<0.05) (Figura 4) e di mercurio (beta = -0.55; p<0.01) (Figura 5) ma non risultano significativi per quanto riguarda il rame. Figura 4 - Regressione multipla dei livelli di argento sulla distanza. Scatterplot-Polinomiale con limiti di confidenza al 95% 19

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