Corso di Genetica per la Facoltà di Medicina e Chirurgia Alberto Piazza

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1 Rilevanza clinica delle malattie genetiche Caratteri monofattoriali Corso di Genetica per la Facoltà di Medicina e Chirurgia Alberto Piazza circa il 25% di tutti i pazienti in età pediatrica manifestano problemi associati a malattie genetiche ereditarie alcune malattie genetiche molto tempo dopo la nascita (vengono chiamate ad esordio tardivo, per esempio il morbo di Alzheimer, la malattia di Huntington) alcune malattie genetiche sono molto più frequenti in alcune popolazioni (per esempio: la fibrosi cistica tra gli Europei, l anemia falciforme nel Mediterraneo ed in Africa, il Tay-Sachs negli Ebrei askenaziti) Terminologia Locus: la posizione di un gene su un cromosoma es. sex determining gene, gene SRY SRY si trova sul cromosoma Y nella posizione p11 Alleli: forme alternative di un gene Per es. nel gene della beta globina, il codone (tripletta di nucleotidi) che codifica per il sesto aminoacido: Allele normale A....GAG... (acido glutammico) Allele della cellula falcemica S..GTG... (valine) mutazione Terminologia Omozigote: porta 2 alleli identici ad un locus, βa βa o βs βs Eterozigote: porta 2 alleli differenti ad un locus, βa βs Eterozigote composto: porta 2 alleli non normali (2 mutazioni diverse) ad un locus, βsβc Portatore (sano): eterozigote asintomatico Probando (Propositus): l individuo affetto attraverso il quale la famiglia di cui fa parte viene portata all esame Genotipo: costituzione genetica di un individuo, nella sua totalità o riferita ad un gene specifico, per es. anemia falciforme, βs βs Fenotipo: caratteristica osservabile di un individuo, o di una cellula Allele cristallino C. AAG... (lisina) mutazione 1

2 Trasmissione ereditaria dei caratteri mendeliani Dominante: ogni tratto o carattere che si esprima nell eterozigote, cioè, nel caso di malattia, in cui sia sufficiente una sola copia del gene difettoso per esprimere il fenotipo affetto Recessivo: ogni tratto o carattere che si esprima solo nell omozigote, cioè, nel caso di malattia, in cui entrambe le copie del gene difettoso devono essere presenti per esprimere un fenotipo affetto Codominante: nel caso in cui lo stato eterozigote esprima un fenotipo distinto da quello dei due stati omozigoti, per es. gruppi sanguigni, enzimi eritrocitari, etc. I fenotipi possono essere analizzati e misurati a differenti livelli. In molte malattie metaboliche gli eterozigoti sono sani (trasmissione recessiva), ma l enzima responsabile della malattia può manifestarsi nel siero con livelli di concentrazione intermedi rispetto a quelli dei due stati omozigoti. Malattie ereditarie dominanti Mutazioni che inducono un eccesso di funzione La mutazione produce una proteina con funzione o espressione alterata, nella maggior parte dei casi una sovra-espressione o una espressione scorretta (nel tessuto o nello stadio di sviluppo sbagliati) della proteina. Per es. nella malattia di Charcot-Marie-Tooth, una duplicazione errata del DNA (3 copie) -> sovra-espressione Insufficienza del corredo aploide (aploinsufficienza) La riduzione di una copia del gene (50% ) è dannosa. Per esempio la ipercolesterolemia, dovuta ad una mutazione nel recettore della lipoproteina a bassa densità (LDL) genera una diminuzione dei livelli di recettore da cui circa il doppio di colesterolo in circolo -> rischio maggiore di patologie cardiovascolari Mutazioni dominanti negative Mutazioni che generano un prodotto proteico che non solo non funziona, ma anche inibisce o interferisce con la funzione delle proteine normali, tipicamente proteine multimeriche. Un esempio è l osteogenesis imperfecta, collageno di tipo I composto da 3 polipeptidi Malattie ereditarie recessive Mutazioni che inducono una perdita di funzione Gli eterozigoti (portatori) sono normali, una riduzione del prodotto proteico del 50% viene tollerato se il rimanente 50% è sufficiente per una funzione normale Esempio: tratto falcemico, βa βs Gli omozigoti sono affetti perché non viene prodotta proteina o quella che è prodotta non funziona normalmente Esempio: anemia falciforme, βs βs Trasmissione ereditaria di un singolo gene (eredità monofattoriale) Mendeliana Autosomica Dominante (AD) (8544) Autosomica Recessiva (AR) (1730) X-linked Recessiva (X-linked R) (785) X-linked Dominante (X-linked D) Y-linked (41) Non-mendeliana Caratteri che sono famigliari ma non seguono una segregazione famigliare malattie mitocondriali (60) madri affette trasmettono il carattere a tutti i figli padri affetti non trasmettono il carattere GENI MAPPATI 8191 (al 2/11/2002, fonte OMIM) 2

3 Eredità autosomica dominante un individuo affetto ha comunemente almeno un genitore affetto, ma vi sono eccezioni si manifesta in uguale misura nei due sessi - la trasmissione non dipende dal sesso un figlio di una persona affetta e di una persona non affetta ha il 50% di probabilità di essere affetto individui non affetti non trasmettono la malattia Eredità autosomica recessiva gli individui affetti sono omozigoti nella maggior parte dei casi, entrambi i genitori sono portatori sani in media, 1 su 4 figli è affetto la trasmissione non dipende dal sesso matrimoni tra individui affetti e non affetti genera solo figli eterozigoti sani a meno che il partner non affetto sia eterozigote più è rara la malattia, più è probabile che l individuo affetto sia figlio di genitori consanguinei tra di loro (inglese inbreeding, italiano poco usato inincrocio) Eredità X-Linked recessiva l individuo affetto è più frequentemente un maschio i maschi affetti sono comunemente nati da genitori sani la malattia viene ereditata dalla madre che è portatrice sana (eterozigote) e può avere parenti maschi affetti le femmine portatrici sono fenotipicamente normali (asintomatiche) in media, 1 su 4 figli è affetto in media il 50% dei maschi di una fratria è affetto NON vi è trasmissione da padre a figlio maschio ma un matrimonio di un maschio affetto con una femmina portatrice può simulare una trasmissione da maschio a maschio Eredità X-Linked dominante (rara) generalmente le femmine sono affette il doppio delle volte dei maschi certe malattie sono letali nel maschio emizigote le femmine sono spesso affette più lievemente e con più variabilità dei maschi dovuto all inattivazione del cromosoma X (o Lyonizzazione) padri affetti possono avere solo figlie femmine affette ma non figli maschi affetti in media il 50% di tutti i figli di una madre affetta saranno affetti 3

4 Eredità Y-Linked (rara) solo gli individui maschi sono affetti trasmissione diretta da padre a figlio cromosoma Y i figli maschi affetti avranno sempre un padre affetto a meno che sia insorta una nuova mutazione per esempio nei geni che inducono la differenziazione di un embrione in un maschio, che esprimono fattori spermatogenetici, gli antigeni minori dell istocompatibilità (HY) Variabilità di trasmissione ed espressione genica Penetranza: frequenza (probabilità) che un genotipo esprima il fenotipo (clinico) la penetranza incompleta di un carattere si manifesta in una proporzione di figli affetti minore di quella attesa dalle proporzioni mendeliane (comunemente il 50% e 25% nei casi di caratteri autosomici rispettivamente dominanti e recessivi) molte malattie autosomiche dominanti sono a penetranza incompleta: vengono all osservazione come fenotipi che saltano una generazione si esprime come una percentuale o una frazione di uno Esempio: la sindrome dell X Fragile ha una penetranza del 80% (8 su 10 con il genotipo della malattia esprimono il fenotipo) Espressività: indicazione della natura e gravità del fenotipo a parità di genotipo individui differenti, pur avendo lo stesso genotipo, possono es sere affetti in misura più o meno grave Esempio: la sindrome di Marfan si manifesta con un ampio spettro di gravità clinica Variabilità di trasmissione ed espressione genica Pleiotropia: un gene si manifesta in una varietà di effetti fenotipici anomalie morfologiche, biochimiche, fisiologiche, o cliniche multiple Esempio: la sindrome di Marfan, si manifesta con difetti a carico dello scheletro, del cuore e degli occhi Eterogeneità genica: lo stesso fenotipo causato da mutazioni a geni diversi mutazioni in geni che codificano per diverse unità o subunità di una proteina, o per proteine che interagiscono con altre proteine, o che agiscono a stadi diversi di un processo metabolico Esempio della Osteogenesis Imperfecta (OI), La tripla elica del collagene di tipo I è formata da 2 catene α1 (codificate sul cromosoma 17) and 1 catena α2 (codificata sul cromosoma 7). Mutazioni nei geni che modificano la produzione o la struttura di queste catene danno luogo a diversi tipi clinici di OI. Variabilità di trasmissione ed espressione genica Eterogeneità allelica: lo stesso fenotipo causato da mutazioni diverse nello stesso gene comune perché molte malattie sono causate da mutazioni che inducono una perdita di funzione (ogni mutazione che impedisce la produzione o la funzione del prodotto genico) Esempi: ipercolesterolemia famigliare, varie mutazioni a livello del gene del recettore LDL provocano la perdita di recettori funzionali con conseguente accumulo di colesterolo β- talassemia, a produrre questo fenotipo sono molte mutazioni diverse nel gene della β-globina 4

5 Variabilità di trasmissione ed espressione genica Anticipazione: il fenomeno per cui l età di insorgenza di una malattia diminuisce e/o la gravità del fenotipo aumenta da una generazione all altra Esempi: malattia di Huntington s, distrofia muscolare miotonica, sindrome da X fragile (nella maggior parte dei casi è il risultato della espansione da ripetizione di triplette nucleotidiche) Imprinting: espressione del carattere genetico che è diversa a seconda se sia stato trasmesso l allele materno o paterno determinato soprattutto da una diversa metilazione del DNA nella linea germinale Esempi: le sindromi di Prader-Willi e Angelman Variabilità di trasmissione ed espressione genica Patologie da geni contigui: microdelezioni che coinvolgono molti geni contigui, combinando cos+ i segni di due o più malattie ereditarie monofattoriali Esempi: WAGR (Wilms tumor, Aniridia, anomalie del tratto Genitorurinario, Ritardo mentale, microdelezione in 11p) CATCH22 (Cardiac defect, Abnormal facies, Thymic hypoplasia, Cleft palate, Hypocalcemia, una delezione in 22q11, incidenza 1/5000, ~5% di tutti i difetti cardiaci congeniti) Fenocopie: fenotipi simili a malattie genetiche ma causati da fattori non genetici Esempio: sordità causata da infezione di rosolia in utero Variabilità di trasmissione ed espressione genica Mutazioni nuove o de novo : generalmente identificate nelle malattie dominanti o recessive X-linked, molto raramente producono malattie autosomiche recessive (entrambe le copie del gene devono essere mutate) il rischio di ricorrenza è basso, ma leggermente superiore all incidenza della malattia nella popolazione a causa del mosaicismo della linea germinale Analisi di alberi genealogici (1) Trasmissione verticale o orizzontale: criterio indicativo, ma non è una regola assoluta 1. Trasmissione verticale, cioè generazioni successive con individui affetti, trasmissione ereditaria potenzialmente DOMINANTE 2. Trasmissione orizzontale, cioè presenza di molti individui affetti all interno di una generazione, ma pochi nella generazione precedente o successiva (salto di una generazione), trasmissione ereditaria potenzialmente RECESSIVA 5

6 Analisi di alberi genealogici (2) Rapporto maschi affetti su femmine affette più maschi affetti nelle malattie recessive X-linked solo maschi affetti nelle malattie Y-linked Dall individuo affetto si esamini l albero verso le generazioni precedenti e seguenti femmine non affette che trasmettono la malattia al 50% dei maschi, sono probabili portatori: la trasmissione è verosimilmente X-linked recessiva maschi affetti che trasmettono la malattia a tutte le figlie femmine: la trasmissione è verosimilmente X-linked dominante maschi che trasmettono la malattia a tutti i figli maschi e non alle figlie femmine: la trasmissione è verosimilmente Y-linked Analisi di alberi genealogici: eredità autosomica dominante se un genitore è affetto, in media il 50% dei figli sarà affetto se la penetranza del carattere è completa (100%), i figli di genitori non affetti non sono a rischio di essere affetti se un individuo affetto non ha genitori affetti e la penetranza del carattere è completa, l individuo ha una nuova mutazione, i suoi figli avranno un rischio del 50% di essere affetti se la mutazione è nella linea germinale, ma i figli successivi avranno un basso rischio di ricorrenza gli individui affetti sono generalmente eterozigoti, in quanto gli omozigoti affetti sono molto più rari Eredità autosomica dominante Se un genitore è normale (bb) e l altro è affetto (Bb) da una malattia autosomica dominante, il 50% dei figli sarà eterozigote affetto (Bb), ed il 50% sarà omozigote normale (bb). Eredità autosomica dominante Se entrambi i genitori sono affetti (Bb) da una malattia autosomica dominante, allora il 75% dei figli sarà affetto (BB or Bb), e il 25% sarà omozigote normale (bb). Nelle malattie autosomiche dominanti, la lettera maiuscola indica il gene che dà la malattia: un solo gene dannoso dà origine la fenotipo affetto Qual è la probabilità di essere affetto un figlio di entrambi i genitori affetti da una malattia autosomica dominante ed entrambi eterozigoti? Nota: è raro che un individuo affetto da una malattia autosomica dominante sia omozigote per il gene che dà la malattia. 6

7 Analisi di alberi genealogici: malattia autosomica recessiva genitori e figli degli individui affetti sono portatori OBBLIGATI il rischio di essere un portatore si divide per 2 ad ogni generazione (seguente e precedente quella del portatore accertato) la maggior parte degli omozigoti affetti sono figli di matrimoni tra due individui portatori (eterozigoti) che generano figli: 1/4 affetti, 2/4 portatori, 1/4 omozigoti normali i fratelli non affetti hanno una probabilità di 2/3 di essere portatori (1 omozigote normale + 2 portatori =3 non affetti) le nuove mutazioni sono rare se la malattia è rara, si può assumere che le persone al di fuori della famiglia siano omozigoti normali, o si può usare la frequenza dei portatori nella popolazione Eredità autosomica recessiva Se un genitore è normale (AA) e l altro è portatore (Aa), allora il 50% in media dei figli sarà omozigote normale (AA), e l altro 50% sarà portatore eterozigote non affetto (Aa). Non vi sono figli affetti. Nel caso di malattie autosomiche recessive, le lettere minuscole stanno ad indicare i geni che in omozigosi danno la malattia, perché entrambi i geni devono essere mutati perché si osservi il fenotipo patologico. Qual è la probabilità di avere un figlio affetto se entrambi i genitori sono portatori? Eredità autosomica recessiva Probabilità di essere portatori di una malattia autosomica recessiva Se entrambi i genitori sono portatori sani (Aa), il 25% in media dei figli sarà omozigote normale (AA), il 50% sarà eterozigote non affetto (Aa), e il 25% sarà omozigote affetto (aa). Se un genitore è un portatore sano (Aa) e l altro è affetto (aa), allora il 50% in media dei figli sarà eterozigote non affetto (Aa), e l altro 50% sarà omozigote affetto affected (aa). La probabilità di essere portatore (eterozigote) di una malattia autosomica recessiva si deriva conoscendo che il probando nella generazione IV è affetto dalla malattia. I genitori nella generazione III ed i figli nella generazione V sono portatori obbligati della malattia. 7

8 Analisi di alberi genealogici: malattia autosomica recessiva Qual è la probabilità di un figlio affetto se entrambi i genitori sono normali: probabilità padre portatore x probabilità madre portatrice x 1/4 (probabilità che il figlio sia affetto) = Se la frequenza dei portatori sani nella popolazione è il 2% (2/100 or 1/50) Analisi di alberi genealogici: malattia autosomica recessiva Qual è la probabilità di essere affetto per un figlio di genitore affetto: Probabilità che un genitore non affetto sia portatore x 1/2 = Qual è la probabilità di essere affetto per un figlio di entrambi i genitori affetti : 100% Eccetto che nei casi di eterogeneità genetica, in cui il figlio può essere un doppio eterozigote non affetto La sorella affetta indica che i genitori sono portatori obbligati, sicchè il fratello ha una probabilità di 2/3 di essere un portatore e la sua partner ha la probabilità di essere portatrice pari a quella dei portatori sani nella popolazione, il 2%. Il rischio di malattia per il figlio? È allora: 2/3 x 1/50 x 1/4 = 1/300 Per esempio la sordità profonda è una malattia autosomica ressiva. Un genitore è sordo a causa del gene mutato a (genotipo aa, BB), l altro genitore è sordo a causa del gene mutato b (genotipo AA, bb). Qual è il genotipo del figlio e qual è la sua probabilità di esser sordo? Analisi di alberi genealogici: eredità X-linked recessiva Il gene che dà la malattia è trasmesso dal cromosoma X: dalle madri passa ai figli maschi e alle figlie, e dai padri alle figlie ma non ai figli maschi i maschi non affetti non hanno il gene che dà la malattia (non possono essere portatori) la madre di un figlio maschio affetto è portatore obbligato, a meno che il figlio abbia una nuova mutazione mutazioni nuove sono comune per molte malattie recessive X- linked tutte le figlie di un padre affetto ed il 50% delle figlie di na madre portatrice, sono portatrici discendendo di generazione in generazione nell albero genealogico sulla linea femminile, il rischio di essere portatrice si dimezza ad ogni generazione Eredità X-linked recessiva normale (X H Y) x portatrice sana (X H X h ) 50% femmine, normali 50% femmine, portatrici 50% maschi, normali 50% maschi, affetti Qual è la probabilità di generare un figlio maschio affetto se il padre è affetto? 8

9 Eredità X-linked dominante affetti (X B Y) x normali (X b X b ) 100% femmine, affette 100% maschi, normali normali (X b Y) x affette (X b X B ) 50% femmine, normali 50% femmine, affette 50% maschi, normali 50% maschi, affetti Eredità Y-linked dominante affetti (X Y) x normali (X X) 100% femmine, normali 100% maschi, affetti 9

10 Problemi sui caratteri monofattoriali 1. Un individuo maschio normale sposa una signora che è portatrice di una malattia recessiva X-linked. Dei figli che possono generare, è probabile che A) Tutti i figli maschi siano affetti e tutte le figlie siano affette B) Tutti i figli maschi siano affetti e tutte le figlie siano portatrici C) Nessun figlio maschio sia affetto e tutte le figlie affette D) 1/2 dei figli maschi sia affetto, e tutte le figlie portatric i E) 1/2 dei figli sia affetto, e 1/2 delle figlie siano portatric i 2. Qual è la probabilità di avere un figlio affetto se un genitore è affetto da una malattia recessiva e l altro genitore è portatore? A) Vicino al 100% perché nuove mutazioni sono frequenti B) 1/4 C) 1/2 D) 2/3 E) Praticamente zero 3. Se entrambi i genitori sono affetti da una malattia dominante con quale probabilità possono avere un figlio normale? A) Se entrambi i genitori sono eterozigoti per lo stesso gene, 1/4 B) Se entrambi i genitori sono omozigoti affetti, 1/2 C) Se entrambi i genitori sono eterozigoti per lo stesso gene,1/2 D) Se entrambi i genitori sono omozigoti affetti, 1/4 E) Se entrambi i genitori sono omozigoti affetti, 3/4 4. Se da un individuo maschio affetto e da una femmina normale non portatrice nascono un figlio maschio affetto ed una figlia affetta, la malattia trasmessa è probabilmente: A) X-linkedrecessiva B) X-linked dominante C) Y-linked D) autosomica dominante E) autosomicarecessiva 5. Una signora normale sposa un signore con fibrosa cistica. Il fratello della signora ha anche lei la fibrosi cistica. Qual è la probabilità che i loro figli abbiano la fibrosi cistica? B) 3/4 C) 2/3 D) 1/3 6. Quando entrambi i fenotipi sono parzialmente espressi nello stato eterozigote, gli alleli vengono definiti: A) codominanti B) dominanti C) recessivi D) normali E) fenocopie 7. Un individuo maschio normale sposa una signora che è omozigote per una malattia X-linked recessiva. Dei figli che potrebbero avere, è probabile che: A) Tutti i figli maschi siano affetti e tutte le figlie siano affette B) Tutti i figli maschi siano affetti e tutte le figlie siano portatrici C) Nessun figlio maschio sia affetto e tutte le figlie siano affette D) Nessun figlio maschio sia affetto e tutte le figlie siano portatrici E) Tutti i figli maschi siano affetti e metà delle figlie siano portatrici 8. Qual è la probabilità di avere un figlio affetto da un genitore non affetto ed un altro affetto da una malattia autosomica recessiva? A) ¼ B) 1/4 x 1/4 x 1/4 C) La probabilità del genitore non affetto di essere portatore x ½ D) Vicino al 100% a causa della frequenza di nuove mutazioni E) 50% se il genitore non affetto è normale 9. I genitori di un figlio con una malattia autosomica recessiva: A) Sono molto probabilmente omozigoti normali e la malattia fu causata da una nuova mutazione B) Probabilmente hanno mutazioni in geni diversi, eterogeneità genica C) Hanno più figli maschi affetti che figlie D) Non sono a rischio di avere un altro figlio affetto E) Eterozigoti obbligati 1

11 Simboli negli alberi genealogici 1. Qual è il tipo di trasmissione probabile di questo albero genealogico? A) autosomico dominante B) autosomicorecessivo C) X-linkeddominante D) X-linkedrecessivo E) Y-linked 2. Qual è la probabilità che III-3 sia portatrice? B) 75% D) 25% 3. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico? A) autosomico dominante B) autosomicorecessivo C) X-linked dominante D) X-linkedrecessivo E) Y-linked 4. Qual è la probabilità che un figlio di IV- 6 e di un individuo non consanguineo sia affetto dalla malattia? B) 75% D) 25% 4bis. Ha importanza conoscere il sesso di IV-9? 5. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico? A) autosomico dominante B) autosomico recessivo C) X-linked dominante D) X-linked recessivo E) Y-linked 6. Qual è la probabilità che II-5 sia portatore? B) 2/3 D) 1/3 7. Qual è la probabilità che III-2 sia portatore? B) 2/3 D) 1/3 2

12 8. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico? A) autosomico dominante B) autosomico recessivo C) X-linked dominante D) X-linked recessivo E) Y-linked 9. Qual è la probabilità che IV-3 abbia una figlia affetta? B) 75% D) 25% 10. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico? A) autosomico dominante B) autosomico recessivo C) X-linked dominante D) X-linked recessivo E) Y-linked 11. Qual è la probabilità che III -13 sia affetto? B) 75% D) 25% 12. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico? A) autosomico dominante B) autosomico recessivo C) X-linked dominante D) X-linked recessivo E) Y-linked 13. Qual è la probabilità che IV-4 sia affetto? B) 75% D) 25% 14. Ha importanza conoscere il sesso di IV-4? 15. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico? A) autosomico dominante B) autosomico recessivo C) X-linked dominante D) X-linked recessivo E) Y-linked 16. Qual è la probabilità che IV-5 abbia un figlio maschio affetto? B) 75% D) 25% 17. Ha importanza conoscere il sesso di IV-6? 3

13 18. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico? A) autosomico dominante B) autosomico recessivo C) X-linked dominante D) X-linked recessivo E) Y-linked 19. Qual è la probabilità che II-5 sia portatore? B) 2/3 D) 1/3 20. Qual è la probabilità che III -4 sia portatrice? B) 2/3 D) 1/3 21. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico se II-2 ha un figlio maschio affetto e due figlie femmine normali? A) autosomico dominante B) autosomico recessivo C) X-linked dominante D) X-linked recessivo E) Y-linked 22. Qual è la probabilità che II-4 e II-5 abbiano un altro figlio con la malattia? B) 75% D) 25% SOLUZIONI DEGLI ESERCIZI 1 E 9 E 7 D 15 D 2 C 1 D 8 E 16 E 3 A 2 C 9 E 17 Si 4 D 3 C 10 A 18 B 5 D 4 C 11 C 19 A 6 A 4bis si 12 B 20 B 7 B 5 B 13 D 21 A 8 D 5 A 14 no 22 C 4

14 Endonucleasi di restrizione Enzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici Manipolazione del DNA in genetica umana e medica Corso di Genetica per la Facoltà di Medicina e Chirurgia dell Università di Torino Alberto Piazza Blunt Ends= estremità prive di estensione Endonucleasi di restrizione EcoRI non taglierà questa sequenza Sonde (probes)) molecolari Reagenti usati per identificare una sequenza specifica di DNA o RNA in un miscuglio complesso in cui è avvenuta una ibridazione (accoppiamento di basi complementari tra il filamento singolo della sonda ed il filamento singolo bersaglio di DNA o RNA). Le sonde sono comunemente marcate da materiale radioattivo o fluorescente. Sonde cdna- sequenze di DNA complementare a RNA (originariamente prodotte mediante trascrizione inversa di RNA), in grado di identificare sequenze di esoni (espressi) Sonde oligonucleotidiche- sequenze di DNA prodotte sinteticamente lunghe nucletidi Sonde RNA- RNA marcato in grado di identificare sequenze di di DNA o RNA complementari 1

15 Southern Blotting (DNA) Diagnosi della sindrome di insensibilità per mezzo dell analisi del Southern blot Il DNA dal gel di agarosio è stato trasferito su nitrocellulosa ed ibridizzato alla sonda cdna di un recettore dell androgeno. Si osservano 3 frammenti genomicinel DNA di entrambi i genitori ma non in quello del figlio. Conclusione: Il recettore dell androgeno (AR) è X-linked. La madre ha solo un gene AR intatto (l intensità delle bande è simile a quella della padre). Il figlio ha ereditato dalla madre il cromosoma X che ha una delezionenel gene AR. Mutazioni puntiformi Polimorfismi del DNA Due mutazioni puntiformi che cambiano la sequenza nucleotidica EcoRI non è in grado di tagliare le due sequenze mutate polimorfismi del DNA = differenze nella sequenza di DNA per definizione due o più alleli ad un locus la cui frequenza nella popolazione è >1% Il termine polimorfismo viene esteso ai casi di cambiamento nella sequenza del DNA: negli RFLP per indicare differenze nelle lunghezze dei frammenti di restrizione causate da perdita o guadagno di siti di restrizione nel DNA, nelle delezioni o inserzioni di DNA, nelle ripetizioni di gruppi nucleotidici nei microsatelliti e minisatelliti, nelle ripetizioni di trinucleotidi, nelle mutazioni puntiformi (SNP), etc. 2

16 Polimorfismi RFLP e Southern Blot Diagnosi molecolare dell anemia falciforme Si possono identificare solamente i frammenti di DNA che ibridizzano con la sonda molecolare (probe) la sonda nonibridizza con il frammento MstII di 0.2 Kb Analisi di un albero famigliare mediante RFLP e Southern Blot Polimorfismi VNTR e STR I minisatelliti (VNTR, Variable Number of Tandem Repeats) sono lunghi più di 12 basi I microsatelliti (STR, Short Tandem Repeats) sono lunghi da 2 a 4 basi Gli alleli A and B al locus X differiscono per il numero di ripetizioni di minisequenze (tandem repeats) in questa famiglia l allele 2 è concatenato alla malattia La sonda (probe) 1 una sonda single-locus - identifica un tratto di DNA esclusivo di un locus La sonda (probe) 2 una sonda multiple-locus identifica tratti di DNA che si ripetono in più loci 3

17 Una famiglia tipizzata per un polimorfismo VNTR DNA Fingerprinting per il test di paternità Chi tra F1 e F2 è il padre biologico di C? Sonde a molti loci con molti alleli Dal 5 al 10% dei figli hanno un padre biologico diverso dal padre presunto Analisi cariotipica spettrale Il Northern blot è una tecnica usata per determinare in quale tessuto o tipo cellulare è espresso un gene, ed anche la lunghezza e la quantità di mrna. I livelli di mrna sono spesso correlati ai livelli di proteina presente nel tessuto. Ibridazione In Situ Fluorescente (FISH) 24 sonde DNA cromosomaspecifiche, ciascuna marcata con una combinazione differente di 5 fluorocromi 4

18 Tecniche di laboratorio per la diagnosi genetica molecolare Analisi a bassa risoluzione Analisi cromosomica (del cariotipo) RFLP (restriction fragment length polymorphisms) Southern blotting - DNA Northern blotting - RNA Western blotting - proteine PCR (polymerase chain reaction) amplificazione del DNA Analisi ad alta risoluzione RFLP DNA Sequencing - determinazione dei nucleotidi PCR amplificazione del DNA PCR: Reazione a catena della polimerasi Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un eccesso di primers e dideossinucleotidi (dntp) in un buffer. PCR: Reazione a catena della polimerasi PCR: Reazione a catena della polimerasi 5

19 n.ro cicli PCR: amplificazione n.ro sequenze bersaglio La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA sintetizzata tra i due primers PCR/RFLP per l analisi dell anemia falciforme Occorre ~1m g di DNA per l analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pgdi DNA/cellula umana (5x10-12 g) allora ~1 m g of DNA potrebbe essere isolato da cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni. In 1 m g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA. Questo 0.1pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 m g in 25 cicli e 27 m g in 30 cicli. PCR/VNTR/STR in genetica forense Sequenziamento del DNA (1): strutture dei nucleotidi Quale delle persone sospette può avere commesso il crimine? La tecnica PCR è utile, spesso necessaria, per amplificare il DNA estratto dai reperti trovati sulla scena del delitto. Si usano sonde multi-locus con molti alleli. 6

20 Sequenziamento del DNA (2): il metodo di Sanger Sequenziamento del DNA (3): il metodo di Sanger pozzetti autoradiogramma Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide * Indica il primer (lungo 15 nucleotidi) ** I dntp sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddntp in ciascuna provetta Si legga la sequenza man mano sintetizzata dal basso verso l alto. Il nucleotideg è il più vicino al primer (* indica il primer (lungo 15 nucleotidi)) e l estremità 5 mentre il nucleotide T è all estremità 3. 5 GCTCCACGTAACGT3 Questa sequenza è complementare al filamento stampo. Il Progetto Genoma Umano Obiettivi 1. Costruire una mappa di marcatori genetici (polimorfismi) Esempio di mappa fisica e genetica nel Genoma Umano STS Notl STS cm polimorfismo due o più alleli che si manifestano in una popolazione con una frequenza maggiore dell 1% - fino ad oggi sono stati identificati circa SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) e STS (Sequence Tagged Sites, coppie di primers PCR), polimorfismi distribuiti nel genoma umano - tali marcatori dovrebbero idealmente essere sufficientemente vicini così che di ogni malattia ereditaria possa essere identificato il gene o i geni responsabili Lungo tutto il genoma sono stati identificati (2002) circa SNP e STS Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) Sequence Tagged Sites (STS) (coppie di primers PCR) Restriction Enzyme Sites (NotI) 2. Stabilire una mappa fisica della localizzazione dei geni in relazione ad altri geni sui cromosomi 1 centimorgan (cm) = 2*10 6 bp 3. Sequenziare l intero genoma umano aploide di 3 x 10 9 bp 7

21 Il gene umano medio Uno degli scopi del progetto Genoma Umano è di sequenziarele 3 x10 9 basi nucleotidichedel genoma il cui numero di geni è stimato intorno a Il gene umano medio Lunghezza Numero di esoni 7 Lunghezza dell esone Lunghezza dell introne coppie di basi (17 kb) nucleotidi nucleotidi 8