Facoltà di Medicina e Chirurgia. Cattedra e Scuola di Specializzazione in Medicina Interna. Dr. Vittorio Emanuele
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1 Facoltà di Medicina e Chirurgia Cattedra e Scuola di Specializzazione in Medicina Interna Screening dei Pazienti del Network Aterostop per la Mutazione Palermo I G528D 1646 G-A (Esone 11) del LDL R Dr. Vittorio Emanuele Matricola 68292
2 Screening dei Pazienti del Network Aterostop per la Mutazione Palermo I G528D 1646 G-A (Esone 11) del LDL R Premessa Nonostante i notevoli progressi medico - scientifici degli ultimi anni, ad oggi le malattie cardiovascolari rimangono la prima causa di morte nei paesi occidentali. Fra i tanti fattori di rischio individuati uno dei più importanti è l ipercolesterolemia. Lo scenario del controllo dell ipercolesterolemia è completamente cambiato con l avvento degli inibitori dell HMG Co A reduttasi, enzima di cui recentemente si è riusciti a risolvere a 2.3 angstroms la struttura spaziale dei siti di legame con il substrato (1). Tale evoluzione si deve alla potenza ed all ottima tollerabilità di questi farmaci, a cui recentemente si stanno affiancando non solo nuove generazioni di composti noti (Rosuvastatina), ma anche nuove molecole con meccanismo di azione completamente diverso (Ezetimibe) (2). Notevoli risultati sono stati raggiunti anche sul fronte dello studio della patogenesi delle ipercolesterolemie: una parte di quest ultime sono dovute ad un difetto genetico a trasmissione autosomica dominante, che colpisce il recettore delle LDL e che si riscontra con una frequenza 1/500 nella sua forma eterozigote. La malattia è estremamente subdola, dato che decorre in maniera a-sintomatica e che ha pochi segni: l aumento dei valori di colesterolemia (questi classicamente si attestano fra 350 e 550 mg/dl nei soggetti eterozigoti e possono 1
3 superare anche i 1000 mg/dl nei pazienti omozigoti) e, in alcuni casi, la presenza di accumuli di colesterolo a livello cutaneo, tendineo e oculare. Questa elevata e continua ipercolesterolemia produce gravi forme di aterosclerosi. Il gene del recettore per l LDL mappa sul cromosoma 19, dove si estende per una lunghezza di circa paia di basi, ed è costituito da 18 esoni e 18 introni. Il gene codifica per una proteina di 839 amminoacidi. Il suo peso molecolare, subito dopo la sintesi, è di dalton ed arriva a dopo l aggiunta di carboidrati nell apparato di Golgi; acquista, così, la sua definitiva conformazione tridimensionale e giunge (in media 45 minuti dopo la sintesi) sulla superficie della membrana cellulare, a livello delle fossette rivestite. L identificazione del recettore si deve a J.L. Goldstein e M.S. Brown nel 1974, in seguito alla scoperta che in fibroblasti in coltura la sintesi del colesterolo era inibita dalle LDL ma non dalle HDL e che questo effetto inibitorio delle LDL era assente nelle colture fibroblastiche provenienti da pazienti omozigoti per l ipercolesterolemia familiare. Dieci anni dopo gli stessi autori definirono la struttura spaziale del recettore delle LDL (fig. 1), meritandosi il Nobel per la medicina l anno seguente (3). La struttura del recettore si può dividere in cinque regioni o domains: cominciando dal C-Terminale abbiamo la regione intracitoplasmatica, la regione della transmembrana, la regione legata agli oligosaccaridi, la regione omologa all Epidermal Gowth Factor e, infine, la regione ricca in cisteina, dove è presente il sito per il legame del ligando. Il recettore si localizza a livello della membrana citoplasmatica nelle zone dove sono presenti le fossette rivestite. Una volta legata l LDL, il 2
4 complesso recettore - ligando entra nella cellula come una vescicola di endocitosi, formando l endosoma. A questo punto il recettore viene sganciato dall LDL per essere restituito alla membrana. L endosoma subisce, quindi, un processo di acidificazione che lo trasforma in lisosoma. A questo punto l apolipoproteina B viene digerita dagli enzimi lisosomiali, mentre il colesterolo viene liberato all interno della cellula, dove rimane disponibile per la costruzione delle membrane cellulari e per le altre funzioni fisiologiche tessuto - specifiche. Fra l altro, i livelli di colesterolo intracellulare influenzano negativamente l attività enzimatica dell HMG Co A reduttasi, che regola, appunto, la produzione endogena di colesterolo. Sebbene ogni domain svolga un ruolo nell economia della struttura recettoriale, le regioni più importanti sono sicuramente quella deputata al legame con il ligando, quella che àncora il recettore alla membrana e quella intracitoplasmatica. Quest ultima risulta indispensabile per il legame con le strutture delle fossette rivestite e con la clatrina, per lo svolgimento dell endocitosi mediata dal recettore e la successiva formazione di endosomi prima e lisosomi poi. Ovviamente, una mutazione sul gene del recettore, che causa un alterazione della sequenza amminoacidica, in alcuni casi produce lo sconvolgimento dell architettura tridimensionale del recettore, con conseguente perdita o diminuzione della funzione della regione interessata. Così si possono avere recettori che non si agganciano alla membrana o che, pur agganciandosi, non riescono a legare il ligando o che, pur legando correttamente le LDL, non riescono a venire internalizzate all interno della cellula (fig. 2). Recenti studi hanno evidenziato come le mutazioni del gene del recettore per le lipoproteine a bassa densità (LDL 3
5 R) abbiano la tendenza a clusterizzare in determinate aree geografiche, fra cui anche in Italia (dove sono presenti diversi cluster al Nord, al Sud, nelle Isole (4) ) e in Grecia (5). Nonostante ciò, nessun cluster è stato riscontrato fino ad ora in Calabria (fig. 3 e 4). Proprio in questa regione da qualche mese è attivo un Network Regionale per lo studio e la cura delle iperlipidemie familiari denominato Aterostop, approvato dalla Regione Calabria. Metodi Dei circa 1000 pazienti, arruolati nei primi sei mesi di attività del Network Aterostop, ne sono stati selezionati 42 appartenenti a 23 famiglie, tutti con diagnosi fenotipica di Ipercolesterolemia Familiare Eterozigote, con familiarità per iperlipidemia, con valori di colesterolo maggiore di 290 mg/dl e trigliceridemia normale. Sei dei pazienti in esame presentavano anche xantomatosi tendinea. Il DNA di questi pazienti è stato estratto mediante l uso del Kit MIDI della Qiagen, archiviato e conservato a +4C. Fra le tante mutazioni descritte per questo gene (circa 700), è stata scelta la G528D 1646 G A dell esone 11 a causa della particolare genetica di popolazione di tale mutazione. Quest ultima, infatti, in base ai dati della letteratura risulta essere molto frequente nel Sud Italia e nelle zone costiere della Grecia. Ci è sembrato ragionevole cercare in Calabria questa mutazione e non un'altra a causa dell elevata omogeneità di popolazione esistente fra queste zone. Nonostante la 4
6 presenza in letteratura di un protocollo per lo screening della mutazione in questione, si è preferito, per motivi di costo e di semplicità tecnica, svilupparne uno ex-novo (l analisi della regione del gene è riportata nella tavola I): - Amplificazione Mix per singola PCR e per 50µl di amplificato: 5µl PCR Buffer 10X (Qiagen) 4µl dntp s 2µl Primer F (N543H) 10µM 2µl Primer R (Mut. G528D) 10µM 0.25µl Super TAQ Polimerasi (Qiagen) 33.75µl dh2o 3µl DNA Primer F (F N543H): 5 CTC-CCC-CGC-CCT-CCA-GCC-TCA-CAG-C- 3 Primer R (G528D mut R): 5 CGC-CCG-CCG-CGC-CCC-GCG-CCC-GTC-CCG-CCG-CCC-CCG-CCC-G AG-TCA-CCA-GCG-AGT-AGA-TGT-CCA-GA- 3 5
7 Programma Termico (27 cicli): 94 C per 1 minuto 65 C per 2 minuti 72 C per 1 minuto - Digestione Mix per singola digestione con l uso di 40µl di prodotto di PCR: 4µl NEB Buffer Dpn II (BioLabs) 0.6µl Dpn II 10000U/ml (BioLabs) 40µl Prodotto di PCR Condizioni di digestione: 37 C /12h. - Separazione La separazione avverrà tramite elettroforesi orizzontale a immersione convenzionale per 45 Minuti a 130 Volt in Gel di Agarosio al 5% (250ml di gel-buffer, 12,5g di Agarosio e 15µl di Ethidium Bromuro), usando i pettini ampi che creano i pozzi per caricare nel gel 35µl di Prodotto di Digestione e 5µl di Loading Buffer (40µl Tot.). In uno dei pozzetti centrali verrà caricato il Marker. - Lettura Gel Retroilluminatore ad UV 6
8 Risultati Il protocollo di screening sviluppato per questa mutazione ci ha permesso di fare diagnosi genetica grazie alla presenza di ben due bande mutagene, portando a quattro il loro numero nei pazienti positivi, contro le due dei pazienti negativi. Questo consente un agevole diagnosi genetica del difetto. I risultati sono stati davvero inaspettati, soprattutto dato l esiguo numero di pazienti screenati (42) e considerato l elevato numero di mutazioni fino ad ora descritte per questo gene. Sono risultati positivi in eterozigosi per la mutazione Palermo I G528D quattro pazienti (fig. 5, 6 e 7-10), di cui tre correlati tra loro (2 famiglie). L elevata percentuale di positività (9,5% dei pazienti, 8,7% delle famiglie) farebbe sospettare la presenza di un elevata incidenza di questa mutazione in Calabria e, probabilmente, la sua tendenza a clusterizzare, come avviene in Campania, in Sicilia e nelle zone costiere della Grecia. Va precisato che una delle famiglie positive aveva origini campane, in linea con l elevata omogeneità di popolazione di buona parte del Sud Italia. Dalle figure è possibile notare, inoltre, l assoluta non contaminazione della reazione di amplificazione testimoniata dal pozzetto bianco, oltre l uguaglianza con il controllo positivo. Si noti che il primer F usato per le prime reazioni era provvisto anche di sequenza CG-Clamp, dato che si aveva intenzione di studiare l esone 11 di questi pazienti anche con la DGGE. Le reazioni di amplificazione con questo primer, però, erano molto scadenti e la sostituzione con il primer N543H, senza CG-Clamp, ha risolto tutti i problemi. È in corso, presso la nostra Unità Operativa, un ampliamento 7
9 dello screening di questa mutazione col fine di accertare l eventuale presenza di questo cluster anche in Calabria. Per dimostrare il cluster, infatti, è necessaria la presenza di almeno 5 individui positivi per la stessa mutazione, come riportato in letteratura (4). Conclusioni Il 9,5% dei pazienti screenati (8,7% delle famiglie) è risultato essere portatore eterozigote della mutazione G528D del gene del recettore per le lipoproteine a bassa densità (LDL R). Questo risultato suggerisce la presenza di un elevata prevalenza di questa mutazione in Calabria, in accordo con i dati del Sud Italia e della Grecia. La dimostrazione dell esistenza di un cluster aprirebbe la strada per studi di genetica della popolazione anche nella nostra regione, al fine di compilare una mappa delle mutazioni più frequenti e, quindi, facilmente screenabili. Dato l elevato numero delle mutazioni di questo gene, come abbiamo ricordato sopra, avere una mappa della frequenza delle mutazioni in relazione alle aree geografiche consente di diminuire i costi e il tempo dello screening nei soggetti con diagnosi fenotipica e nei loro familiari. E inutile, infatti, ricordare il vantaggio di avere una diagnosi genetica in età giovanile, quando ancora il fenotipo non è manifesto. 8
10 Bibliografia 1. ISTVAN AND DEISENHOFER, Sterically Stopping Cholestrol Synthesis, Science 292, Poster al 78 Congresso dell EAS. 3. J.L. GOLDSTEIN AND M.S. BROWN, Sci Am 1984; 251: S. BERTOLINI, A. CANTAFORA, M. AVERNA, C. CORTESE, C. MOTTI, S. MARTINI, G. PES, A. POSTIGLIONE, C. STEFANUTTI, I. BLOTTA, L. PISCIOTTA, M. ROLLERI, S. LANGHEIM, M. GHISELLINI, I. RABBONE, S. CALANDRA, Clinical Expression of Familial Hypercholesterolemia in Clusters of Mutations of the LDL Receptor Gene That Cause a Receptor-Defective or Receptor- Negative Phenotype, ATVB 2000; 20:e41-e JOANNE TRAEGER, SYNODINOS, NICHOLAS MAVROIDIS, EMMANUEL KANAVAKIS, EURYDIKI DROGARI, STEVE E. HUMPHRIES, IAN N. M. DAY, CHRISTOS KATTAMIS, NICHOLAS MATSANIOTIS, Analysis of low density lipoprotein receptor gene mutations and microsatellite haplotypes in Greek FH heterozygous children: six independent ancestors account for 60% of probands, Hum Gen 1998: 102; DURRINGTON, Le Iperlipidemie. Diagnosi e trattamento, Manchester T.R. HARRISON et alii, Principi di Medicina Interna, USA D. GALTON AND W. KRONE, Le iperlipidemie nella pratica clinica, Milano J.L. GOLDSTEIN AND M.S. BROWN, A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis, Science, 232, 34-47,
11 Tavole e Figure 10
12 Fig.1 Struttura del recettore per le LDL 11
13 FIG. 2 Struttura del Gene LDL - R 12
14 Fig.3 GRECIA. In rosso sono segnati i luoghi dove è stato possibile dimostrare l esistenza di cluster per la mutazione G528D del LDL - R 13
15 Fig.4 Cluster Italiani G528D Altri Famiglie individuate nel corso del nostro screening 14
16 Fig.5 Il gel agli UV: sono visibili 3 positivi oltre il controllo, il marker e il bianco 15
17 Fig.6 BIANCO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO Controllo Positivo Frammenti DNA nell Eterozigote: 87 bp 88 bp 67bp 21 bp 16
18 Frammenti DNA nel sano: 87 bp 88 bp PCR Product = 172 bp Primer F 2.5kb FH122 (e11) T TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCCTCCCCCGCCC ACGTCCAGCTGAGATCTCCTAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTAGGAGGGGGCGGG A A 12bp Frammenti DNA nell Eterozigote: 87 bp 88 bp 21 bp 67 bp Frammenti DNA nell Omozigote: 87 bp 21 bp 67 bp Tavola I FH12(e11) C G C #exon11 TCCAGCCTCACAGCTATTCTCTGTCCTCCCACCAGCTTCATGTACTGGACTGACTGGGGA ^ ^ AGGTCGGAGTGTCGATAAGAGACAGGAGGGTGGTCGAAGTACATGACCTGACTGACCCCT MUTAZIONE II Sito di taglio non specifico G F M Y W T D W G YWTD Primer R 27 bp Mutagenico 21 bp A C ACTCCCGCCAAGATCAAGAAAGGGGGCCTGAATGGTGTGGACATCTACTCGCTGGTGACT TGAGGGCGGTTCTAGTTCTTTCCCCCGGACTTACCACACCTGTAGATGAGCGACCACTGA 15 bp T G T P A K I K K G G L N G V D I Y S L V T bp 40 bp Clamp 17
19 Fig. 7 Confronto fra un paziente negativo a sinistra e uno positivo a destra 18
20 Fig. 8 Confronto fra negativo, positivo e bianco, rispettivamente da sinistra verso destra 19
21 Fig. 9 Due dei tre positivi rilevati da questo gel 20
22 Fig. 10 Immagine dello stesso gel a colori invertiti 21
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