CONGRESSO NAZIONALE TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento Modena, Novembre 2010

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1 CONGRESSO NAZIONALE TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento Modena, Novembre 2010 TEST FUNZIONALE EX VIVO DI SPLICING PER LA DIAGNOSTICA MOLECOLARE DEL CARCINOMA DEL SENO E DELL OVAIO: VALUTAZIONE DELL EFFETTO DELLE VARIANTI DI SIGNIFICATO SCONOSCIUTO NEI GENI BRCA1 E BRCA2 Daniela Di Giacomo, Pascaline Gaildrat, Sophie Krieger, Agnés Hardouin, Enrico Ricevuto, Mario Tosi INSERM U614 Laboratoire de Génétique Médicale et Fonctioneelle du Cancer et des Maladies Neuropsychiatriques Rouen, FRANCIA

2 PROBLEMATICHE Cancro del seno e dell ovaio ereditario: 1/400 Cancro colorettale ereditario non poliposico: 1/500 Storia familiare Geni BRCA (BRCA1, BRCA2) Identificazione Di una variante di significato sconosciuto(vss) nei geni che predispongono al cancro Geni MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) Varianti neutre? Mutazioni patogene? Mutazioni missenso, silenziose (traduzione), introniche: una frazione importante di questi VSS ha potenzialmente un impatto maggiore sullo splicing

3 EFFETTO DELLE VSS SULLO SPLICING? VSS= Mutazioni nello splicing? RNA prémessagero Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Intron 1 Intron 2 Intron 3 Definizione dei confini esonici UACUAAC NNYYYYYYYYCAGAG ESE ESS GUGURAGU ISE ISS Branch point site Sito accettore di splicing Enhancer Silencer Sito donatore di splicing Regolazione dello splicing

4 STUDIO DELL IMPATTO DELLE VSS SULLO SPLICING: APPROCCI COMPLEMENTARI Predizioni bio-informatiche dei difetti di splicing Analisi RT-PCR sul RNA estratto a partire da sangue o da linee linfoblastoidi del PAZIENTE Insufficienti RNA del paziente non è sempre disponibile Test ex vivo di splicing (minigene) DNA genomico del PAZIENTE Sistema eterologo

5 TEST FUNZIONALE DI SPLICING BamHI I- CLONAGGIO II- TRANSFEZIONE DNA sangue periferico Esone wt MluI Vettore wt o variante Cellule HeLa BamHI Esone + mutazione MluI III- ANALISI RT-PCR CMV F R F R Esone A Esone B F R Vettore pcas2 pcdna3.1(-)/serping1/c1nh Tournier et al, Human Mutation, 2008 Gaildrat et al, Methods in Molecular Biology, 2010 Elettroforesi IV- SEQUENZA

6 TEST FUNZIONALE DI SPLICING Esempio : Paziente affetta da un cancro familiare dell ovaio VSS = BRCA1, c.5434 C>G, p.pro1812ala «missenso» Test di splicing (Minigene) Esone 23 Test monoallelico + exon 23 - exon 23 Gaildrat et al, Journal of Human Genetics, 2010

7 TEST FUNZIONALE DI SPLICING Esempio : Paziente affetta da un cancro familiare dell ovaio VSS = BRCA1, c.5434 C>G, p.pro1812ala «missenso» esone 23 Test di splicing (Minigene) RT-PCR sull RNA del sangue del paziente Test monoallelico Test biallelico + exon 23 - exon 23 + exon 23 - exon 23 Gaildrat et al, Journal of Human Genetics, 2010

8 PROPOSTA DI SCHEMA DI ANALISI Sequenziamento: VSS Predizione bioinformatica Test ex vivo Minigene Rapporto intermediario e richiesta di campione di sangue su PAXGENE Se c è un difetto di splicing RT-PCR sul sangue del Paziente Per conferma Mutazione deleteria di splicing Referto finale Consulenza genetica

9 PROPOSTA DI SCHEMA DI ANALISI Sequenziamento: VSS BRCA1/2 54 Consecutive VSS Caen-Rouen-Lille In posizioni diverse da +1,+2 o -1,-2 Predizione bioinformatica 10 Predizioni forti (CONFINI ESONICI) Test ex vivo Minigene Rapporto intermediario e richiesta di campione di sangue su PAXGENE Se c è un difetto di splicing RT-PCR sul sangue del Paziente Per conferma 4 Difetti di splicing Mutazione deleteria di splicing Referto finale Consulenza genetica Théry et al, Journal of Medical Genetics, 2010, sottomesso

10 PROPOSTA DI SCHEMA DI ANALISI Sequenziamento: VSS BRCA1/2 54 Consecutive VSS Caen-Rouen-Lille In posizioni diverse da +1,+2 o -1,-2 Rapporto intermediario e richiesta di campione di sangue su PAXGENE Predizione bioinformatica Test ex vivo Minigene Se c è un difetto di splicing RT-PCR sul sangue del Paziente Per conferma 10 Predizioni forti (CONFINI ESONICI) 4 Difetti di splicing Predizioni «deboli» Per 44 VSS 5 Difetti di splicing, tutte in posizioni esoniche interne Mutazione deleteria di splicing Referto finale Consulenza genetica ELEMENTI DI REGOLAZIONE DELLO SPLICING Théry et al, Journal of Medical Genetics, 2010, sottomesso

11 CONCLUSIONI Predizioni che modificano o creano nuovi confini esonici permettono di definire la priorità dei test funzionali; Predizioni dell effetto su elementi di regolazione dello splicing non sono ancora attualmente applicabili nella routine diagnostica molecolare; I test di splicing, basati sull utilizzo di minigeni rappresentano una metodica sensibile e specifica oltre che mostrarsi una valida alternativa agli studi effettuati direttamente sull RNA del paziente, che spesso risulta non essere disponibile; Questi test facilitano l interpretazione di test realizzati sull RNA del paziente.

12 PROSPETTIVE FUTURE 61 VSS BRCA1/2 analizzabili con test pcas 18 VSS BRCA1 43 VSS BRCA2 9 VSS Esoniche 9 VSS Introniche 20 VSS Esoniche 23 VSS Introniche 29 VSS esoniche Predizioni «deboli» 28 VSS introniche sono ESCLUSE dall analisi pcas 4 Predizioni «forti» c.68-7 T>A c G>T c T>C c A>T

13 Ringraziamenti Inserm U614 et Service de Génétique CHU, Rouen Dr.ssa Pascaline Gaildrat Dr.ssa Isabelle Tournier Dr.ssa Myriam Vezain Dr.ssa Audrey Killian Dr. Jean-Christophe Théry Dr.ssa Elodie Bohers Dr.ssa Stéphanie Baert-Desurmont Dr.ssa Julie Tinat Prof. Thierry Frébourg Dr.ssa Alexandra Martins Prof. Mario Tosi Inserm U614 et CHU, Rouen Centre François Baclesse, Caen (Dr.ssa Agnès Hardouin, Dr.ssa Sophie Krieger) Centre Oscar Lambret, Lille (Dr. Jean-Philippe Peyrat, Dr.ssa Françoise Révillon) Università degli Studi dell Aquila Prof. Enrico Ricevuto Dr.ssa Tina Sidoni Università degli Studi G. D Annunzio Chieti Prof. S. Iacobelli Prof.ssa C. Natoli Università La Sapienza Roma Prof. G. Giannini

14 BILAN TEST D ÉPISSAGE SUR VSI DE BRCA 81 VSI analysés en test ex vivo d épissage (minigène) Laboratoire d Oncogénétique CRLCC ( Peyrat de Caen (Dr A. Hardouin) et de Lille (Pr 21 VSI (26%) avec effet sur l épissage 9 VSI (11%) avec effet majeur 12 VSI (15%) avec effet partiel 60 VSI (74%) sans effet sur l épissage 11% des VSI reclassés en mutations délétères d épissage Base de données Mutations BRCA Bonnet et al, Journal of Human Genetics, 2008 J.C. Théry et al, données non publiées

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